本发明属于植物基因工程和分子生物学技术领域，特别是涉及一种大豆gmhda12基因和蛋白及其应用。
背景技术：
大豆是重要的油料作物，是食物蛋白质的主要来源，解析其耐逆机理，进而改善其耐逆性，具有重要的理论及现实意义。
环境因子的变化，如极端温度、干旱、盐碱、涝害等胁迫因素及激素aba等对植物的生长发育有重要影响，在严重的胁迫条件下会造成农作物大规模减产，因此耐逆性作物的培育是种植业必需解决的问题之一。
目前，应用基因工程育种已经成为增强作物耐逆性的重要方法之一。通过分子生物学手段克隆、筛选、鉴定得到具有自主知识产权的调控抗逆功能基因，并将其通过基因工程手段导入植物体内改变植物抗性具有重要的研究和应用价值。
技术实现要素：
基于此，本发明的目的之一是提供一种大豆gmhda12基因和蛋白在改变植物抗逆性中的应用，该基因和蛋白具有改变植物抗逆性的功能。
实现上述发明目的的具体技术方案如下：
一种大豆gmhda12基因在改变植物抗逆性中的应用，所述大豆gmhda12基因的核苷酸序列如seqidno.3所示；或为如seqidno.3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；或为编码氨基酸序列为seqidno.4所示的核苷酸序列。
一种大豆gmhda12蛋白在改变植物抗逆性中的应用，所述大豆gmhda12蛋白的氨基酸序列如seqidno.4所示；或如seqidno.4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，但蛋白活性相同。
在其中一些实施例中，所述抗逆性为对aba、干旱或盐的抗性。
在其中一些实施例中，所述植物为大豆、拟南芥、水稻、小麦或玉米。
本发明的另一目的在于提供一种大豆gmhda12基因的重组表达载体在改变植物抗逆性中的应用。
实现上述发明目的的具体技术方案如下：
一种大豆gmhda12基因的重组表达载体在改变植物抗逆性中的应用，所述重组表达载体上插入有上述大豆gmhda12基因，或插入可用于表达上述大豆gmhda12蛋白的基因。
在其中一些实施例中，所述重组表达载体为ubq-gmhda12-gfp。
在其中一些实施例中，所述抗逆性为对aba、干旱或盐的抗性。
在其中一些实施例中，所述植物为大豆、拟南芥、水稻、小麦或玉米。
本发明的还一目的在于提供一种大豆gmhda12基因的基因编辑载体在改变植物抗逆性中的应用。
实现上述发明目的的具体技术方案如下：
一种大豆gmhda12基因的基因编辑载体在改变植物抗逆性中的应用，所述基因编辑载体上插入有上述大豆gmhda12基因，或插入可用于表达上述大豆gmhda12蛋白的基因。
在其中一些实施例中，所述基因编辑载体为pcas9-gmhda12。
在其中一些实施例中，所述抗逆性为对aba、干旱或盐的抗性。
在其中一些实施例中，所述植物为大豆、拟南芥、水稻、小麦或玉米。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人通过设计基因特异性引物，从大豆全长cdna文库中克隆得到大豆gmhda12基因序列，并以此构建插入有大豆gmhda12基因的ubq-gmhda12-gfp表达载体质粒，再将该表达载体质粒转化模式植物拟南芥，得到超表达gmhda12基因的转基因植株。通过在植物体内超表达实验比较分析证明，超表达该大豆gmhda12基因的植物对aba敏感，由于aba与干旱和盐胁迫具有关联性，超表达该大豆gmhda12基因的植物对干旱和盐胁迫也有一定的敏感性。该基因的发掘与利用为抗逆农作物的培育研究提供了基因资源，将在植物基因工程改良抗逆植物的研究和应用中发挥重要作用，可广泛用于培育抗逆作物新品种；
此外，本发明的发明人也构建得到了大豆gmhda12基因编辑载体pcas9-gmhda12，后续可以通过基因编辑等手段在植物体内抑制该基因表达，进而培育可能具有增加抗逆效果的植株。
附图说明
图1为本发明实施例1中gmhda12基因扩增结果；其中，m为dnamarker；
图2为本发明实施例1中超表达gmhda12基因的重组表达载体ubq-gmhda12-gfp的示意图；
图3为本发明实施例1中大豆gmhda12基因的编辑载体pcas9-gmhda12的示意图；
图4为本发明实施例2中超表达gmhda12的转基因植物和野生型植物对aba敏感性的研究结果；
图5为本发明实施例2中超表达gmhda12的转基因植物和野生型植物对aba敏感性的研究结果柱状图；
图6为本发明实施例2中超表达gmhda12的转基因植物和野生型植物在经aba处理后基因表达情况。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
为了便于理解本技术，下面定义了一些术语和短语。
在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。
此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在......中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。
应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对以下实施例中涉及到的碱基序列进行修改，也属于本发明的保护范围。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1大豆gmhda12基因克隆及超表达ubq-gmhda12-gfp载体构建
大豆gmhda12基因克隆包括总rna提取、cdna文库构建和基因克隆三个步骤。具体步骤如下：
(1)、总rna提取
取大约1g的大豆根、茎、叶混合样品，加入液氮充分研磨，采用magenrna提取试剂盒，参考说明书操作提取rna。将获得的rna用50μlrnase-free水溶解。用nanodrop微量分光光度计测定rna的质量和浓度。
(2)、cdna初级文库的构建
采用诺唯赞逆转录试剂盒，合成cdna第一链。
在经过高温高压灭菌后的离心管中加入1μgrna，添加rnase-free的h2o至总体积为8μl，置于金属浴65℃加热5min，迅速放置于冰上骤冷，静置2min。
加入8μl5×gdnawipermix，用移液枪轻轻吹打混匀，金属浴42℃反应2min。分别加入2μl10×rtmix，2μlhiscriptⅲenzymemix，1μloligo(dt)20vn及5μlrnase-free的h2o，用移液枪轻轻吹打混匀，置于金属浴37℃反应45min，85℃反应5s，得到的cdna产物-20℃保存用于后续的实验。
(3)、大豆gmhda12基因克隆及ubq-gmhda12-gfp表达载体、基因编辑载体pcas9-gmhda12的构建
以大豆cdna为模板，设计seqidno.1(gattaacagggatcccccatgccttccaaggacaaaat)和seqidno.2(gagactagtggtaccccctgaaacatccatttgatcat)所示的引物，扩增gmhda12基因的序列(反应程序为：1.94℃2min；2.98℃10sec；3.56℃30sec；4.72℃1min30sec；5.循环步骤2-4(35cycles)；6.72℃7min；7.16℃forever)，通过在ncbi(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)网站上进行blast等序列分析，表明成功克隆出大豆gmhda12基因(图1)，其基因编码核苷酸和氨基酸序列分别为seqidno.3和seqidno.4所示。
将克隆得到的大豆gmhda12基因插入植物表达载体pubq-1300(对载体pcambia1300进行改造而得)中，得到ubq-gmhda12-gfp表达载体，载体示意图如图2所示。
针对大豆gmhda12基因进行crspr-cas9靶点预测，选取特异性位点设计引物seqidno.5(atatatggtctcgattgtacttctacgacggtgatgtgttttagagctagaaatagc)和seqidno.6(attattggtctcgaaactgtgtggacggtaaatctcccaatctcttagtcgactctac)，以通用载体pcbc-dt1t2为模板，pcr扩增获得gmhda12基因的crspr-cas9表达骨架，切胶回收crspr-cas9表达骨架并和通用植物表达载体phee401e分别使用bsai单酶切后，纯化回收，最后使用t4连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态，卡那霉素抗性板筛选阳性克隆，构建得到大豆gmhda12基因编辑载体pcas9-gmhda12，载体示意图如图3所示。
seqidno.3
atgccttccaaggacaaaatcgcttacttctacgacggtgatgtcggtagtgtatactttggggcgaagcatccaatgaagccccaccggctttgcatgactcatcatcttgttctctcatacgatcttcataagaagatggagatttaccgtccacacaaggcttatcctgttgagcttgcccagtttcattcagctgattatgttgagtttttgaacaggattacacctgacactcagcacttgttcttgaaggaactgacaaaatataatcttggagaagactgccctgtatttgacaacttatttgaattttgtcagatttatgctggtggaactatagatgctgcacgtcgattaaacaatcaattgtgtgatattgctataaactgggccggtggactacatcatgctaagaaatgcgaggcatctggattttgttacatcaatgacttggttttaggaatcttggagcttcttaaatatcatgctcgtgttttgtatattgatatagatgtgcaccatggtgatggtgtagaagaagccttctacttcactgacagggtgatgactgtcagttttcacaagtacggagatttgttcttcccaggtactggcgatgctaaggaaataggagaaagagaaggaaagttttatgccataaatgtcccattgaaggatggaatagatgacagtagcttcactcgacttttcaagactattatttccaaagtacttgaaacatatcaacctggtgcaatagttctccagtgtggagcagactcgcttgctggcgatcgcttgggttgcttcaatctctctattgatggtcacgctgaatgtgttagcttcgtaaagagattcaatttgccattgctggtcactggaggtggggggtacacaaaagaaaatgttgctcgatgttggactgttgaaacaggagttcttctagatacagagcttccaaatgagattccggaaaatgattatattaaatattttgcaccagaattttctttgaagattccaaatgggcagatagaaaatttgaatagtaaatcatatcttagcaccattaaaatgcaagtcttggaaaatcttcgttgcatccaacatgctccaagtgtacagatgcaggaggtccctccggacttctacattccagagttcgatgaagatgagcagaaccctgatgaacgccttgatcagcacactcaagacaagcacattcagcgcgatgatgaatactatgacggtgacaatgacaatgatcaaatggatgtttcatga
seqidno.4
mpskdkiayfydgdvgsvyfgakhpmkphrlcmthhlvlsydlhkkmeiyrphkaypvelaqfhsadyveflnritpdtqhlflkeltkynlgedcpvfdnlfefcqiyaggtidaarrlnnqlcdiainwagglhhakkceasgfcyindlvlgilellkyharvlyididvhhgdgveeafyftdrvmtvsfhkygdlffpgtgdakeigeregkfyainvplkdgiddssftrlfktiiskvletyqpgaivlqcgadslagdrlgcfnlsidghaecvsfvkrfnlpllvtggggytkenvarcwtvetgvlldtelpneipendyikyfapefslkipngqienlnsksylstikmqvlenlrciqhapsvqmqevppdfyipefdedeqnpderldqhtqdkhiqrddeyydgdndndqmdvs
实施例2gmhda12基因在植物中超表达对aba的敏感性研究
本实施例是将实施例1获得的ubq-gmhda12-gfp表达载体转化模式植物拟南芥，得到ubq-gmhda12-gfp转基因植物，进一步研究ubq-gmhda12-gfp转基因植物对aba处理的敏感性。
ubq-gmhda12-gfp转基因植物的获得
将ubq-gmhda12-gfp表达载体质粒导入农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)eha105感受态细胞，采用特异性引物(tactcttcgatttgtgatttc，seqidno:7)对导入ubq-gmhda12-gfp表达载体的农杆菌进行菌落pcr检测，对检测阳性的菌落进行扩大培养，采用农杆菌侵染拟南芥花序的方法进行植物宿主转化。对转基因植物进行叶片pcr鉴定和蛋白表达鉴定，进而筛选转基因阳性植株，即ubq-gmhda12-gfp超表达转基因拟南芥植株。
ubq-gmhda12-gfp转基因植物对aba处理的敏感性研究
分别取适量ubq-gmhda12-gfp超表达拟南芥种子(即ubq-gmhda12-gfp转基因植物种子，编号为oe-4，oe-5)和野生型对照拟南芥种子(wt)于1.5ml离心管，加入1mlnaclo种子消毒液(含1％有效氯的naclo、0.01％tritonx-100溶液)，高速震荡5min，1000rpm离心30sec，于超净工作台中弃去上清，用无菌水清洗种子3次。将清洗后的种子加无菌水于4℃冰箱低温冷处理3天。
然后将经过低温冷处理的种子分别均匀点种在含有0和0.5μmaba的ms固体培养板(含1％蔗糖，ph5.6)上，待培养基上的水份吹干后，加盖并用封口膜封口。将平板移置于植物控温培养室，22℃，长日照条件下(光照16h/黑暗8h)培养，并在5天后拍照，统计子叶变绿的小苗数目。
结果如图4和图5所示，添加0maba的ms平板上，ubq-gmhda12-gfp超表达和野生型对照拟南芥种子均可以萌发并且生长出绿色的子叶，且无差异；而在添加0.5μmaba的ms平板上，ubq-gmhda12-gfp超表达oe-4，oe-5的子叶大部分不能变绿，而wt的子叶大部分可以变绿，存在显著性差异。
提取rna，使用荧光实时定量pcr技术分析转基因植物中aba响应基因的表达。如图6所示，aba诱导表达的标志基因em6、rd29a在oe-4，oe-5超表达体中表达相对于野生型降低。
以上结果表明在植物宿主体内超表达gmhda12基因可以改变植物对aba的敏感性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110>中国科学院华南植物园
<120>大豆gmhda12基因和蛋白及其应用
<130>1
<160>7
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>38
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gattaacagggatcccccatgccttccaaggacaaaat38
<210>2
<211>38
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gagactagtggtaccccctgaaacatccatttgatcat38
<210>3
<211>1290
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
atgccttccaaggacaaaatcgcttacttctacgacggtgatgtcggtagtgtatacttt60
ggggcgaagcatccaatgaagccccaccggctttgcatgactcatcatcttgttctctca120
tacgatcttcataagaagatggagatttaccgtccacacaaggcttatcctgttgagctt180
gcccagtttcattcagctgattatgttgagtttttgaacaggattacacctgacactcag240
cacttgttcttgaaggaactgacaaaatataatcttggagaagactgccctgtatttgac300
aacttatttgaattttgtcagatttatgctggtggaactatagatgctgcacgtcgatta360
aacaatcaattgtgtgatattgctataaactgggccggtggactacatcatgctaagaaa420
tgcgaggcatctggattttgttacatcaatgacttggttttaggaatcttggagcttctt480
aaatatcatgctcgtgttttgtatattgatatagatgtgcaccatggtgatggtgtagaa540
gaagccttctacttcactgacagggtgatgactgtcagttttcacaagtacggagatttg600
ttcttcccaggtactggcgatgctaaggaaataggagaaagagaaggaaagttttatgcc660
ataaatgtcccattgaaggatggaatagatgacagtagcttcactcgacttttcaagact720
attatttccaaagtacttgaaacatatcaacctggtgcaatagttctccagtgtggagca780
gactcgcttgctggcgatcgcttgggttgcttcaatctctctattgatggtcacgctgaa840
tgtgttagcttcgtaaagagattcaatttgccattgctggtcactggaggtggggggtac900
acaaaagaaaatgttgctcgatgttggactgttgaaacaggagttcttctagatacagag960
cttccaaatgagattccggaaaatgattatattaaatattttgcaccagaattttctttg1020
aagattccaaatgggcagatagaaaatttgaatagtaaatcatatcttagcaccattaaa1080
atgcaagtcttggaaaatcttcgttgcatccaacatgctccaagtgtacagatgcaggag1140
gtccctccggacttctacattccagagttcgatgaagatgagcagaaccctgatgaacgc1200
cttgatcagcacactcaagacaagcacattcagcgcgatgatgaatactatgacggtgac1260
aatgacaatgatcaaatggatgtttcatga1290
<210>4
<211>429
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
metproserlysasplysilealatyrphetyraspglyaspvalgly
151015
servaltyrpheglyalalyshisprometlysprohisargleucys
202530
metthrhishisleuvalleusertyraspleuhislyslysmetglu
354045
iletyrargprohislysalatyrprovalgluleualaglnphehis
505560
seralaasptyrvalglupheleuasnargilethrproaspthrgln
65707580
hisleupheleulysgluleuthrlystyrasnleuglygluaspcys
859095
provalpheaspasnleuphegluphecysglniletyralaglygly
100105110
thrileaspalaalaargargleuasnasnglnleucysaspileala
115120125
ileasntrpalaglyglyleuhishisalalyslyscysglualaser
130135140
glyphecystyrileasnaspleuvalleuglyileleugluleuleu
145150155160
lystyrhisalaargvalleutyrileaspileaspvalhishisgly
165170175
aspglyvalgluglualaphetyrphethraspargvalmetthrval
180185190
serphehislystyrglyaspleuphepheproglythrglyaspala
195200205
lysgluileglygluarggluglylysphetyralaileasnvalpro
210215220
leulysaspglyileaspaspserserphethrargleuphelysthr
225230235240
ileileserlysvalleugluthrtyrglnproglyalailevalleu
245250255
glncysglyalaaspserleualaglyaspargleuglycyspheasn
260265270
leuserileaspglyhisalaglucysvalserphevallysargphe
275280285
asnleuproleuleuvalthrglyglyglyglytyrthrlysgluasn
290295300
valalaargcystrpthrvalgluthrglyvalleuleuaspthrglu
305310315320
leuproasngluileprogluasnasptyrilelystyrphealapro
325330335
glupheserleulysileproasnglyglnilegluasnleuasnser
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lyssertyrleuserthrilelysmetglnvalleugluasnleuarg
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cysileglnhisalaproservalglnmetglngluvalproproasp
370375380
phetyrileproglupheaspgluaspgluglnasnproaspgluarg
385390395400
leuaspglnhisthrglnasplyshisileglnargaspaspglutyr
405410415
tyraspglyaspasnaspasnaspglnmetaspvalser
420425
<210>5
<211>57
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
atatatggtctcgattgtacttctacgacggtgatgtgttttagagctagaaatagc57
<210>6
<211>58
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
attattggtctcgaaactgtgtggacggtaaatctcccaatctcttagtcgactctac58
<210>7
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
tactcttcgatttgtgatttc21
1.一种大豆gmhda12基因在改变植物抗逆性中的应用，其特征在于，所述大豆gmhda12基因的核苷酸序列如seqidno.3所示；或为如seqidno.3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；或为编码氨基酸序列为seqidno.4所示的核苷酸序列。
2.一种大豆gmhda12蛋白在改变植物抗逆性中的应用，其特征在于，所述大豆gmhda12蛋白的氨基酸序列如seqidno.4所示；或如seqidno.4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，但蛋白活性相同。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述抗逆性为对aba、干旱或盐的抗性。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物为大豆、拟南芥、水稻、小麦或玉米。
5.一种大豆gmhda12基因的重组表达载体在改变植物抗逆性中的应用，其特征在于，所述重组表达载体上插入有上述大豆gmhda12基因，或插入可用于表达上述大豆gmhda12蛋白的基因。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组表达载体为ubq-gmhda12-gfp。
7.一种大豆gmhda12基因的基因编辑载体在改变植物抗逆性中的应用，其特征在于，所述基因编辑载体上插入有上述大豆gmhda12基因，或插入可用于表达上述大豆gmhda12蛋白的基因。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述基因编辑载体为pcas9-gmhda12。
9.根据权利要求5～8任一项所述的应用，其特征在于，所述抗逆性为对aba、干旱或盐的抗性。
10.根据权利要求5～8任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为大豆、拟南芥、水稻、小麦或玉米。
技术总结