本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酿酒酵母表达长效重组人bfgf-hsa融合蛋白及其标准品的制备方法。
背景技术：
碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bfgf)，是成纤维细胞生长因子蛋白(fibroblastgrowthfactors，fgfs)家族中的一员。bfgf是存在于哺乳动物和人体中的一种十分微量却有较多生物功能活性的物质，也因其所具有的广泛生理功能和非常重要的临床应用价值，被国内外研究人员所偏爱。bfgf可以刺激机体中新生血管的生成，也可在创伤愈合的过程中发挥作用，还可以促进组织的再生与胚胎组织的发育和分化，帮助机体组织进一步发育完善。除此之外，还发现其与肿瘤的发生和发展休戚相关。跟据近年的科研成果来看，重组人bfgf已被广泛应用到临床领域，主要用于治疗机体组织创伤或者与神经系统等相关的疾病。
bfgf主要分布于垂体、视网膜等组织中。由于起始位点不同，bfgf在人体内形成不同大小蛋白。目前发现的bfgf就有4种不同大小蛋白，但主要活性成分为分子量约17.2kda大小的蛋白，由154个氨基酸组成。bfgf是内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞等细胞的促有丝分裂原，在伤口的愈合，组织再生过程中起着重要作用。
早在九十年代，satoh等科学家就证明了在消化道溃疡中，bfgf能快速修复受损上皮细胞。matsuuram等在dss诱导的结肠炎模型中显示通过直肠给药，随着给药量的增加，uc小鼠的肠上皮组织越接近正常小鼠的肠上皮组织，但文献并未详细报道bfgf的治疗机制。而近期研究揭示了bfgf治疗溃疡性结肠炎相关的分子机制。在溃疡性结肠炎初始阶段，bfgf表达量低，而在肠上皮修复阶段，体内的碱性成纤维生长因子上升，加强“正常”血管生成，并且能直接影响上皮细胞及其基质层干细胞增殖、分化，修复损伤上皮组织。经过深入一步研究显示，bfgf还能上调p27肿瘤抑癌基因的表达，通过调节细胞周期，在细胞周期抑制和增殖间达到一个新的平衡，防止在溃疡性结肠炎治疗期间细胞过度增殖。在慢性溃疡性结肠炎中，bfgf能显著下调tnf-α等促炎因子表达和mpo活性，提示bfgf在治疗中可能起到抗炎作用。虽然有研究报道，在许多肿瘤中，bfgf可能是一个潜在的癌症标记物，如大肠癌、乳腺癌、肺癌等。但目前研究尚不清楚bfgf是否参与溃疡性结肠炎癌变的发生发展机制。
由于动物和人体内正常组织中含碱性成纤维因子量极少，而且bfgf在体外极容易失效，远不能满足实际需要。目前许多机构相继利用细菌、病毒等系统实现了bfgf蛋白的高效表达。重组bfgf蛋白质的生产主要依靠大肠杆菌及酵母菌表达系统，临床上使用的“扶济复”、“盖扶”就是利用大肠杆菌基因工程菌表达提纯的bfgf蛋白。但利用大肠杆菌表达后的蛋白需要经超声碎菌后从菌液中提纯目的蛋白。这种传统方法生产的重组人bfgf纯品成本较昂贵，提纯步骤复杂，蛋白在溶液中很不稳定，静置后极易形成二聚体、多聚体，或者出现明显的絮状沉淀，严重影响蛋白质的活性。而利用病毒载体表达bfgf却潜在病毒变异、基因整合等一系列安全问题。
人血清白蛋白(humanserumalbumin,hsa)是人体血液中的主要蛋白，由585个氨基酸构成，是人体循环系统内的含量最多的可溶性蛋白，在血液中的浓度为34～54g/l。hsa由肝脏合成，血清半衰期长，可达19天。hsa在调节血液渗透压、营养和促进伤口愈合等方面发挥重要作用，广泛用于肝硬化腹水、烧伤、休克等临床治疗。此外，hsa具有无免疫原性、人体相容性好、组织分布广和无酶活等特性，使其成为非常理想的重组蛋白融合载体。通过构建融合蛋白技术能够增加重组蛋白的分子量从而延长半衰期，有效的提高重组蛋白的稳定性。
对于生物制品来说，其质量评价的有效性指标多采用生物学方法，这些方法本身变异性较大。因此，标准品是生产中必不可少的组成部分，在生物制品标准化、质量控制和效力评价中，标准品是药品质量评价的标尺，起着非常重要的作用。
技术实现要素：
为克服背景技术中的技术问题，本发明利用酿酒酵母表达的长效重组人bfgf与hsa融合而成的重组蛋白(bfgf-hsa)，生产工艺简单、成本低、产物均一，建立了一种经济、高效、稳定表达的高浓度、高活性的长效重组人bfgf标准品蛋白，为建立长效重组人bfgf蛋白质量标准提供依据。
一种酿酒酵母表达长效重组人bfgf-hsa融合蛋白制备方法，包含以下步骤：
(1)酿酒酵母分泌表达载体pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa的构建，具体包括：
人碱性成纤维细胞生长因子和人血清白蛋白因子的人工优化和获得，以获得质粒pmd19-t-bfgf-hsa；
对质粒pyes2/ct-mfα及质粒pmd19-t-bfgf-hsa进行双酶切，并分别切胶回收bfgf-hsa基因片段和pyes2/ct-mfα载体，然后用t4dna连接酶进行连接，获得阳性克隆pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa；
(2)bfgf-hsa融合蛋白工程菌的制备、转化，具体包括：
酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制；
将步骤(1)获得的pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa转化酿酒酵母invsc1感受态细胞，通过培养基的培养及pcr扩增、筛选，获得阳性克隆子invsc1/pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa；
(3)invsc1/pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa工程菌的诱导表达和纯化，具体包括：
将步骤(2)获得的阳性克隆子invsc1/pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa，通过培养、诱导表达，再依次经过金属离子亲和层析和阴离子交换层析纯化，即得本发明获得的酿酒酵母表达重组人bfgf-hsa融合蛋白。
进一步的，所述步骤(1)中，人碱性成纤维细胞生长因子和人血清白蛋白因子的人工优化和获得，以获得质粒pmd19-t-bfgf-hsa，具体步骤为：
根据pyes2/ct-mfα载体的性质(图1)和酿酒酵母宿主密码子偏爱性，设计了重组人bfgf-hsa基因序列和重组人bfgf-hsa的氨基酸序列，重组人bfgf-hsa基因序列如序列表1所示，重组人bfgf-hsa的氨基酸序列如序列表2所示；
将序列以bfgf-hsa顺序插入pmd19-tsimplevector，其5’端接notⅰ酶切位点，3’端接xbaⅰ酶切位点，由此得到质粒pmd19-t-bfgf-hsa。
进一步的，所述步骤(1)中，对质粒pyes2/ct-mfα及质粒pmd19-t-bfgf-hsa进行双酶切，并分别切胶回收bfgf-hsa基因片段和pyes2/ct-mfα载体，然后用t4dna连接酶进行连接，获得阳性克隆pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa，具体步骤为：
用内切酶noti和内切酶xbai分别对质粒pyes2/ct-mfα及质粒pmd19-t-bfgf-hsa进行双酶切；
在37℃金属浴酶切反应3h，酶切产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并分别切胶回收bfgf-hsa基因片段和pyes2/ct-mfα载体，然后用t4dna连接酶进行连接；
将重组质粒转化至大肠杆菌(dh5ɑ)，在含氨苄青霉素的lb平板培养基上挑取阳性克隆，经菌液pcr(正向引物bfgf-hsa-f：5'-tcacttcaaggacccaaaaagacta-3'；反向引物bfgf-hsa-r：5'-ccaccatcttctggtaatgcaggca-3')及双酶切(notⅰ和xbaⅰ)鉴定，选取阳性克隆pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa。
进一步的，所述步骤(2)中，酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制，具体方法为：
ypd培养基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g(制备固体培养基时另加20g琼脂粉)，溶于800ml水中，定容到1l，121℃高压灭菌20min；
sc-u选择培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸(制备sc-u选择性平板培养基时另加20g琼脂粉)，加去离子水900ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液，混匀，4℃保存备用；
sc-u诱导培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，加去离子水800ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液和100ml过滤除菌的20％半乳糖溶液，混匀，4℃保存备用。
进一步的，所述步骤(2)中，获得阳性克隆子invsc1/pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa的具体步骤为：
采用电转化法将pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa转化至酿酒酵母invsc1感受态细胞：
将10μlpyes2/ct-mfα-bfgf-hsa质粒加到80μl酿酒酵母invscl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，然后转移到预冷的电击杯中，冰浴5min，擦干电击杯外壁；
将bio-rad电转化仪调至真菌档，pic选项，电击杯置于bio-rad电转化仪上电击，迅速向电击杯中加入500μl预冷的1m山梨醇溶液，混合均匀，涂sc-u板；
30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆；
在sc-u选择培养基(含氨苄)生长的为含有pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa的酿酒酵母转化子，菌液pcr(正向引物：bfgf-hsa-f；反向引物：bfgf-hsa-r)筛选invsc1/pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa阳性克隆子。
进一步的，所述步骤(3)中，含有invsc1/pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa的工程菌的诱导表达，具体步骤为：
挑取invsc1/pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa单菌落接种于20mlsc-u选择培养基，经30℃、220rpm震荡培养过夜，测定其od600nm吸光值，计算好相应体积的菌液转接至于100mlsc-u诱导培养基中，使得初始od600nm达到0.4；
4℃、1500g离心5min，收集菌体，用1～2ml的sc-u诱导培养基悬浮菌体，重新接种100ml的sc-u诱导培养基中，置于30℃震荡培养96h，4℃、15000g离心5min，收集菌体和上清，诱导表达的上清液经离心并通过0.22μm滤膜过滤，收集过滤液液。
进一步的，所述步骤(3)中，金属离子亲和层析的步骤为：
取离心并过0.22μm滤膜过滤后的过滤液，使用gehealthcare公司chelatingsepharosetmfastflow镍离子螯合亲和层析填料自行装柱，用3个柱体积的纯化水清洗ni2 螯合亲和层析柱，再用pbs平衡2-3个柱体积；
在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5-6ml/min；
再用pbs过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到od280nm稳定。再以含500mm咪唑pbs缓冲液过层析柱，洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，即得到经过金属离子亲和层析后的重组人bfgf-hsa蛋白原液。
进一步的，所述步骤(3)中，阴离子交换层析的步骤为：
deae阴离子交换层析将金属离子亲和层析纯化后收集的蛋白原液置换到bindingbufferⅱ(50mm三羟甲基氨基甲烷，ph8.5)中后，上样通过用bindingbufferⅱ平衡好的deae阴离子交换层析柱，收集bfgf-hsa融合蛋白峰；
再用elutionbufferⅱ(50mm三羟甲基氨基甲烷，1mnacl，ph8.5)洗脱，洗去杂蛋白并收集洗脱峰对应的蛋白，即为本发明获得的纯化后的重组人bfgf-hsa融合蛋白。
一种重组人bfgf-hsa融合蛋白标准品的制备方法，包括以下步骤：
取经过金属离子亲和层析和阴离子交换层析纯化后的重组人bfgf-hsa融合蛋白溶液，用0.22μm滤膜过滤除菌，用10mmol/l磷酸缓冲液稀释后，加入终浓度为10％甘油、0.12g/ml甘露醇、0.025g/ml蔗糖冻干保护剂，进行冷冻真空干燥，干燥后即为重组人bfgf-hsa融合蛋白标准品。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明利用酿酒酵母分泌表达的长效重组人碱性成纤维细胞生长因子与hsa融合而成的重组蛋白(bfgf-hsa)，提高了重组蛋白的稳定性。酿酒酵母分泌表达系统为真核表达系统，能够高水平表达蛋白质分泌到培养基中，产品生产工艺简单、成本低、产物均一、无免疫原性。
本发明同时制备了检测标准品，以bfgf国际标准品为标准进行协作标定，冻干bfgf标准品经外观、无菌、水分检测均符合规定，在-20、4、25和37℃保持24个月生物活性稳定。
附图说明：
图1质粒pyes2/ct-mfα图谱；
图2sds-page鉴定纯化后重组人bfgf-hsa蛋白
图3westernblot鉴定纯化后重组人bfgf-hsa蛋白
序列表说明：
序列表1本发明重组人bfgf-hsa的核苷酸序列
序列表2本发明重组人bfgf-hsa的氨基酸序列
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
具体实施方式：
实施例1：酿酒酵母分泌表达载体pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa的构建
1.1人碱性成纤维细胞生长因子和人血清白蛋白因子的人工优化和获得：
通过genbank查询获得以下相关基因和氨基酸序列，本次试验将利用目的基因表达的氨基酸序列优化基因序列，再进行人工合成两段基因来构建表达载体。根据pyes2/ct-mfα载体的性质(图1)和酿酒酵母宿主密码子偏爱性，设计重组人bfgf-hsa基因序列和重组人bfgf-hsa的氨基酸序列，重组人bfgf-hsa基因序列如序列表1所示，重组人bfgf-hsa的氨基酸序列如序列表2所示。
序列表1中，gcggccgc为noti酶切位点，tctaga为xbai酶切位点；atg为起始密码子，taa为终止密码子；gcagaggcggcggctaaggaagctgcagccaaagcc为连接bfgf和hsa序列的linker所对应的碱基序列；catcaccatcaccatcac为6×his标签序列。
将序列以bfgf-hsa顺序插入pmd19-tsimplevector，其5’端接notⅰ酶切位点，3’端接xbaⅰ酶切位点，由此得到质粒pmd19-t-bfgf-hsa。
1.2pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa表达载体的构建
用内切酶noti和内切酶xbai分别对质粒pyes2/ct-mfα及质粒pmd19-t-bfgf-hsa进行双酶切。
酶切反应体系为：
在37℃金属浴酶切反应3h，酶切产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并分别切胶回收bfgf-hsa基因片段和pyes2/ct-mfα载体，然后用t4dna连接酶进行连接。
连接反应体系为：
反应条件为16℃、14h，按常规方法(氯化钙法)将重组质粒转化至大肠杆菌(dh5ɑ)，在含氨苄青霉素的lb平板培养基上挑取阳性克隆，经菌液pcr(正向引物bfgf-hsa-f：5'-tcacttcaaggacccaaaaagacta-3'；反向引物bfgf-hsa-r：5'-ccaccatcttctggtaatgcaggca-3')及双酶切(notⅰ和xbaⅰ)鉴定，选取阳性克隆pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa。
实施例2：bfgf-hsa融合蛋白工程菌的制备、转化
2.1酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制
ypd培养基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g(制备固体培养基时另加20g琼脂粉)，溶于800ml水中，定容到1l，121℃高压灭菌20min；
sc-u培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸(制备sc-u选择性平板培养基时另加20g琼脂粉)，加去离子水900ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液，混匀，4℃保存备用；
sc-u诱导培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，加去离子水800ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液和100ml过滤除菌的20％半乳糖溶液，混匀，4℃保存备用。
2.2pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa转化酿酒酵母
采用电转化法将pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa转化至酿酒酵母invsc1感受态细胞。
将10μlpyes2/ct-mfα-bfgf-hsa质粒加到80μl酿酒酵母invscl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，然后转移到预冷的电击杯中。冰浴5min，擦干电击杯外壁。将bio-rad电转化仪调至真菌档，pic选项，电击杯置于bio-rad电转化仪上电击。迅速向电击杯中加入500μl预冷的1m山梨醇溶液，混合均匀，涂sc-u板。30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆。在sc-u选择培养基(含氨苄)生长的为含有pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa的酿酒酵母转化子，菌液pcr(正向引物：bfgf-hsa-f；反向引物：bfgf-hsa-r)筛选invsc1/pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa阳性克隆子。
实施例3：invsc1/pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa工程菌的诱导表达、检定和纯化
3.1工程菌的诱导表达、检定
挑取invsc1/pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa单菌落接种于20mlsc-u选择培养基，经30℃、220rpm震荡培养过夜。测定其od600nm吸光值，计算好相应体积的菌液转接至于100mlsc-u诱导培养基中，使得初始od600nm达到0.4。
4℃、1500g离心5min，收集菌体，用1～2ml的sc-u诱导培养基悬浮菌体，重新接种100ml的sc-u诱导培养基中，置于30℃震荡培养96h，4℃、15000g离心5min，收集菌体和上清，诱导表达的上清经0.22μm滤膜过滤。
诱导表达得到的上清蛋白液经sds-page电泳可观察到82kda左右有明显的特异性条带出现(图2，其中，泳道m：marker；泳道1：含有空载质粒酿酒酵母菌株的诱导上清；泳道2，诱导上清)，使用兔抗bfgf多克隆抗体(anti-fgf1antibody，ab207321)经westernblot鉴定含有pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa质粒的酿酒酵母菌株的诱导表达上清液均可观察到82kda左右特异性条带(图3，其中，泳道m：marker；泳道1：空载质粒酿酒酵母菌株产物；泳道2：bfgf-hsa蛋白)，由此可见本发明制备的含人碱性成纤维细胞生长因子的真核表达载pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa的酿酒酵母工程菌经半乳糖诱导能产生82kda左右的重组人碱性成纤维细胞生长因子和血清白蛋白的融合蛋白。
3.2重组人bfgf-has融合蛋白的纯化
3.2.1金属离子亲和层析
离心收集培养液上清，用0.22μm滤膜过滤用以上样。使用gehealthcare公司chelatingsepharosetmfastflow镍离子螯合亲和层析填料自行装柱，用3个柱体积的纯化水清洗ni2 螯合亲和层析柱，再用pbs平衡2-3个柱体积。在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5-6ml/min。再用pbs过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到od280nm稳定。再以含500mm咪唑pbs缓冲液过层析柱，洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，即得到金属离子亲和层析洗脱后的bfgf-hsa蛋白原液。
3.2.2阴离子交换层析
deae阴离子交换层析将金属离子亲和层析洗脱后的bfgf-hsa蛋白原液置换到bindingbufferⅱ(50mm三羟甲基氨基甲烷，ph8.5)中后，上样通过用bindingbufferⅱ平衡好的deae阴离子交换层析柱，收集bfgf-hsa融合蛋白峰。再用elutionbufferⅱ(50mm三羟甲基氨基甲烷，1mnacl，ph8.5)洗脱，洗去杂蛋白并收集洗脱峰对应的蛋白，即得本发明获得的酿酒酵母表达重组人bfgf-hsa融合蛋白。
实施例4：bfgf-hsa标准品的制备和检测
4.1bfgf-hsa标准品的制备
将重组bfgf-hsa纯化后蛋白溶液用0.22μm滤膜过滤除菌，用10mmol/l磷酸缓冲液稀释后加入终浓度为10％甘油、0.12g/ml甘露醇、0.025g/ml蔗糖冻干保护剂，进行冷冻真空干燥。
4.2bfgf-hsa标准品的检测
蛋白质含量测定：对上述纯化后的bfgf-hsa标准品用bradford法检测蛋白浓度，其蛋白含量为2.0mg/ml。
sds-page进行纯度鉴定：对bfgf-hsa标准品进行sds-page鉴定纯度，其纯度为98％，相对分子量82kda。
hplc纯度鉴定：bfgf-hsa标准品经μrpcc18st4.6/100反相层析柱进行分析。通过计算峰面积得出主峰面积占总面积的99.33％。
n-端氨基酸序列测定：
(a)sds-page电泳：将bfgf-hsa蛋白样品sds-page电泳，上样前先将配置好的聚丙烯酰胺凝胶装到垂直电泳仪上，用50v恒压空跑30min；
(b)转膜：将蛋白电转到pvdf(聚偏二氟乙烯)膜上，电转缓冲液用caps缓冲液；
(c)丽春红染色：将pvdf膜放到丽春红染液中染色30min，用水洗去背景颜色；
(d)将目的条带剪下放于eppendorf管中，-20℃保存，用edman降解法进行n端氨基酸测序；
(e)n-端二十个氨基酸序列为eaeayvefpraaampalped，说明纯化后的目的蛋白就是bfgf-hsa。
综上，本发明利用酿酒酵母表达的长效重组人bfgf与hsa融合而成的重组蛋白(bfgf-hsa)，克服了现有技术中，采用大肠杆菌、乳酸杆菌、短芽孢杆菌及毕赤酵母表达系统容易形成包涵体、获得的蛋白生物学活性较低的缺陷，生产工艺简单、成本低、产物均一；同时，提供了一种重要的重组人bfgf-hsa标准品，在生物制品标准化、质量控制和效力评价中，起着非常重要的作用。本发明制备的长效重组人bfgf-hsa融合蛋白，具有更好的均一性、稳定性和更好的回收率，可显著降低生产成本。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司
<120>一种酿酒酵母表达长效重组人bfgf-hsa融合蛋白及其标准品的制备方法
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2340
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gcggccgcaatgcctgcattaccagaagatggtggatctggtgcgtttccaccaggtcac60
ttcaaggacccaaaaagactatactgtaaaaatggtggcttttttctaagaattcatcct120
gatggcagagtcgacggtgttagagaaaaatcagatcctcatattaaattgcagttacaa180
gcagaagagcgtggtgtcgtgagtattaagggtgtttgtgccaatagatatttagccatg240
aaagaggatgggaggctgttagcttctaagtgtgttacagacgaatgctttttcttcgaa300
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gatgaattcaagccgcttgtcgaggagccacaaaatttaattaaacaaaactgtgaatta1740
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gtcgtacttaatcaactgtgtgtcctacacgagaagactcctgtcagtgacagagtgaca1980
aaatgttgcaccgagagcttagttaatagaagaccgtgtttttcagcgctggaagttgat2040
gaaacctatgttccaaaggagttcaatgcagaaacattcaccttccatgctgatatatgt2100
actcttagtgaaaaagaaaggcagatcaaaaaacaaactgccctggtcgaattagtcaaa2160
cataaacctaaagcaacgaaggaacagttgaaggccgtaatggatgatttcgcagctttc2220
gttgaaaaatgttgcaaggctgatgacaaagagacatgttttgctgaagagggaaaaaaa2280
ttggtggcagcttctcaagccgctttagggttacatcaccatcaccatcactaatctaga2340
<210>2
<211>774
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
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151015
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1.一种酿酒酵母表达长效重组人bfgf-hsa融合蛋白制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)酿酒酵母分泌表达载体pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa的构建，具体包括：
人碱性成纤维细胞生长因子和人血清白蛋白因子的人工优化和获得，以获得质粒pmd19-t-bfgf-hsa；
对质粒pyes2/ct-mfα及质粒pmd19-t-bfgf-hsa进行双酶切，并分别切胶回收bfgf-hsa基因片段和pyes2/ct-mfα载体片段，然后用t4dna连接酶进行连接，经含氨苄青霉素的lb平板培养基筛选获得阳性克隆pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa；
(2)bfgf-hsa融合蛋白工程菌的制备、转化，具体包括：
酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制；
将步骤(1)获得的pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa电转化酿酒酵母invsc1感受态细胞，通过培养基的培养及pcr扩增、筛选，获得阳性克隆子invsc1/pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa；
(3)invsc1/pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa工程菌的诱导表达和纯化，具体包括：
将步骤(2)获得的阳性克隆子invsc1/pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa，通过培养、诱导表达，再依次经过金属离子亲和层析和阴离子交换层析纯化，即得本发明所需酿酒酵母表达重组人bfgf-hsa融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达长效重组人bfgf-hsa融合蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，人碱性成纤维细胞生长因子和人血清白蛋白因子的人工优化和获得，以获得质粒pmd19-t-bfgf-hsa，具体步骤为：
根据pyes2/ct-mfα载体的性质和酿酒酵母宿主密码子偏爱性，设计了重组人bfgf-hsa基因序列和重组人bfgf-hsa的氨基酸序列，重组人bfgf-hsa基因序列如序列表1所示，重组人bfgf-hsa的氨基酸序列如序列表2所示；
将序列以bfgf-hsa顺序插入pmd19-tsimplevector，其5’端接notⅰ酶切位点，3’端接xbaⅰ酶切位点，由此得到质粒pmd19-t-bfgf-hsa。
3.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达长效重组人bfgf-hsa融合蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，对质粒pyes2/ct-mfα及质粒pmd19-t-bfgf-hsa进行双酶切，并分别切胶回收bfgf-hsa基因片段和pyes2/ct-mfα载体，然后用t4dna连接酶进行连接，获得阳性克隆pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa，具体步骤为：
用内切酶noti和内切酶xbai分别对质粒pyes2/ct-mfα及质粒pmd19-t-bfgf-hsa进行双酶切；
在37℃金属浴酶切反应3h，酶切产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并分别切胶回收bfgf-hsa基因片段和pyes2/ct-mfα载体，然后用t4dna连接酶进行连接；
将重组质粒转化至大肠杆菌(dh5ɑ)，在含氨苄青霉素的lb平板培养基上挑取阳性克隆，经菌液pcr及双酶切鉴定，选取阳性克隆pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa。
4.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达长效重组人bfgf-hsa融合蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制，具体方法为：
ypd培养基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g(制备固体培养基时另加20g琼脂粉)，溶于800ml水中，定容到1l，121℃高压灭菌20min；
sc-u选择培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸(制备sc-u选择性平板培养基时另加20g琼脂粉)，加去离子水900ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液，混匀，4℃保存备用；
sc-u诱导培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，加去离子水800ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液和100ml过滤除菌的20％半乳糖溶液，混匀，4℃保存备用。
5.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达长效重组人bfgf-hsa融合蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，获得阳性克隆子invsc1/pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa的具体步骤为：
采用电转化法将pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa转化至酿酒酵母invsc1感受态细胞：
将10μlpyes2/ct-mfα-bfgf-hsa质粒加到80μl酿酒酵母invscl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，然后转移到预冷的电击杯中，冰浴5min，擦干电击杯外壁；
将bio-rad电转化仪调至真菌档，pic选项，电击杯置于bio-rad电转化仪上电击，迅速向电击杯中加入500μl预冷的1m山梨醇溶液，混合均匀，涂sc-u板；
30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆；
在sc-u选择培养基(含氨苄)生长的为含有pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa的酿酒酵母转化子，菌液pcr，筛选invsc1/pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa阳性克隆子。
6.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达长效重组人bfgf-hsa融合蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，
invsc1/pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa工程菌的诱导表达，具体步骤为：
挑取invsc1/pyes2/ct-mfα-bfgf-hsa单菌落接种于20mlsc-u选择培养基，经30℃、220rpm震荡培养过夜，测定其od600nm吸光值，计算好相应体积的菌液转接至于100mlsc-u诱导培养基中，使得初始od600nm达到0.4；
4℃、1500g离心5min，收集菌体，用1～2ml的sc-u诱导培养基悬浮菌体，重新接种于100ml的sc-u诱导培养基中，置于30℃震荡培养96h，4℃、15000g离心5min，收集菌体和上清，诱导表达的上清液经离心并通过0.22μm滤膜过滤，收集过滤液。
7.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达长效重组人bfgf-hsa融合蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，金属离子亲和层析的步骤为：
取离心并过0.22μm滤膜过滤后的过滤液，使用gehealthcare公司chelatingsepharosetmfastflow镍离子螯合亲和层析填料自行装柱，用3个柱体积的纯化水清洗ni2 螯合亲和层析柱，再用pbs平衡2-3个柱体积；
在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5-6ml/min；
再用pbs过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到od280nm稳定，再以含500mm咪唑pbs缓冲液过层析柱，洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，即得到经过金属离子亲和层析后的重组人bfgf-hsa蛋白原液。
8.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达长效重组人bfgf-hsa融合蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，阴离子交换层析的步骤为：
将金属离子亲和层析纯化后收集的蛋白原液置换到bindingbufferⅱ中后，上样通过用bindingbufferⅱ平衡好的deae阴离子交换层析柱，收集bfgf-hsa融合蛋白峰；
再用elutionbufferⅱ洗脱，洗去杂蛋白并收集洗脱峰对应的蛋白，即为本发明获得的纯化后的重组人bfgf-hsa融合蛋白。
9.一种重组人bfgf-hsa融合蛋白标准品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取权利要求1-8任一项制备方法制得的重组人bfgf-hsa融合蛋白溶液，用0.22μm滤膜过滤除菌，用10mmol/l磷酸缓冲液稀释后，加入终浓度为10％甘油、0.12g/ml甘露醇、0.025g/ml蔗糖冻干保护剂，进行冷冻真空干燥，干燥后即为重组人bfgf-hsa融合蛋白标准品。
技术总结