本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高植物低温耐受性的rna及其应用。
背景技术：
木薯(manihotesculenta)是全球重要的粮食和能源作物，其储藏根含有丰富的淀粉，是全球热带、亚热带地区近8亿人粮食的主要来源。我国主要为酒精和饲料原料，以及满足国民食品多元化需求，自给率仅20％。栽培木薯在长期的进化和人工选择过程中具有超常的光、热、水资源利用率，单位面积的生物能产量高于几乎所有其它栽培作物，具有高光效、耐干旱、耐贫瘠、低温敏感的特点。然而，由于世界热区多为发展中国家，针对热带作物木薯的科技投入和研究水平总体偏低。木薯产量、品质、抗逆性和适应性的重大基础理论研究严重滞后，导致其产量、品质和抗性潜力没有充分被挖掘。
在我国，木薯主要种植于广西、广东和海南等热带、亚热带省区，且大多为老少边穷地区，年种植面积约600万亩，鲜薯年产量约1000万吨，每年需进口干片1500万吨以上，可见需求缺口巨大。同时，由于生态环境的恶化，耕地面积减少、病虫害、干旱、盐碱、低温等因素一直制约着木薯种植业的发展，这些因素每年造成的产量损失超过50％，使得国内木薯加工产业面临原料匮乏的局面。从2005年开始，我国已成为世界第一大木薯进口国。要满足国内市场的需求，需要继续扩大木薯种植面积，改进育种和种植技术。因此开展木薯逆境适应的理论基础研究，培育高产、抗逆木薯新种质，在满足人民生活品多样化需求和农民致富方面具有不可替代的作用。
木薯对低温非常敏感，适宜生长在平均温度18℃以上、全年无霜期至少8个月的地区，当气温低于15℃时其生长发育开始受到抑制，低于4℃时，顶端生长受抑制、植株萎蔫、茎杆坏死。如在薯块形成后受低温胁迫则导致块根膨大和淀粉累积受限、产量下降。近年来，虽然木薯在云南、贵州、福建、江西、山东等省份有引种试种，但受限于低温天气的影响，耐低温品种缺乏，种植面积难以扩大，农民增收有限。因此，开展耐低温育种基础性研究，培育耐低温木薯品种，使木薯种植北移，满足我国和世界能源工业对木薯原材料的需求，是我国木薯产业发展的迫切需求。
由于木薯耐低温栽培品种十分匮乏，加之利用传统的杂交育种方式存在育种周期长、杂交不亲和、花期不遇等诸多因素的限制，造成目前耐低温木薯品种的培育工作滞后。以往利用转录组分析及转基因技术获得了大量响应低温胁迫，并在低温胁迫下具备调控功能的蛋白质编码基因，但是这些基因的高/低表达往往影响了木薯的产量和品质。本发明中使用的长链非编码rna是一种基因表达调控rna，在木薯中过表达不影响植株正常的生长发育，但可以显著提高木薯的抗低温能力。因此，无论是以crr2序列为候选标的，在木薯杂交群体中利用关联分析进行定向育种；还是以crr2高表达株系作为基础材料，结合传统杂交育种技术进行品种改良；或者利用先进的基因编辑体系将筛选标记剔除后直接用于新品种选育，都将显著提高木薯抗逆育种的效率，缩短选育时间，为木薯抗逆品种选育提供基因资源和基础材料。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种可提高植物低温耐受性的rna及其应用。
本发明的第一个方面是提供一种提高植物低温耐受性的crr2基因，其核苷酸序列如seqidno:1所示。
本发明的第二个方面是提供一种提高植物低温耐受性的rna，命名为crr2，其核苷酸序列如seqidno:1所示。所述rna是本申请第一个方面crr2基因经bamhi和sali两限制性内切酶去除酶切位点后序列转录的rna。
本发明的第三个方面是提供一种重组载体，其包含原始载体和本发明第一个方面所述的crr2基因。
其中，所述原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pcambia1301载体质粒，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。
优选地，所述原始载体为pcambia1301载体质粒，本发明第一个方面所述的crr2基因与pcambia1301载体质粒经bamhi和sali两限制性内切酶双酶切连接。
本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的crr2基因、或者本发明第二个方面所述的rna、或者本发明第三个方面所述的重组载体在提高植物低温耐受性中的应用。
本发明第五个方面是提供一种本发明第一个方面所述的crr2基因的扩增方法，包括以下步骤：以木薯品种tms60444的叶片为材料提取总rna，以polyt进行反转录获得的cdna为模板，以crr2-sprimer：ggatccaaatttaacacggttgattcac和crr2-aprimer：gtcgactcgggattcactttaccttctag为引物，通过pcr方法扩增获得crr2基因，其序列如seqidno:1所示。
本发明的第六个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示。
本发明的crr2基因及其对应转录的rna(命名为crr2)可特异地响应低温胁迫反应。通过亚细胞定位分析表明该rna在细胞核、细胞质中均有定位。进一步将crr2基因转到木薯中，获得木薯crr2高表达株系，发现crr2高表达株系对低温胁迫更加耐受，存活率也大幅提高，同时，crr2高表达株系中脯氨酸含量显著提高，低温处理后丙二醛(mda)的含量显著降低，表明crr2和crr2基因可以提高植物的低温耐受性。将来可利用crr2和crr2基因对植物进行遗传改良，为提高植物低温耐受性提供有效的资源。
附图说明
图1为木薯低温响应lncrna鉴定及crr2表达鉴定结果。
图2为rnafold软件预测的crr2二级结构。
图3为rnafish鉴定crr2的亚细胞定位结果。
图4为木薯crr2高表达株系鉴定及低温耐受能力分析结果，其中oe-1～8为8个阳性转基因木薯株系。
图5为crr2调控的下游基因鉴定结果。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
1、crr2基因的获得
以木薯品种tms60444的叶片为材料提取总rna，以polyt进行反转录获得的cdna为模板，以crr2-sprimer：ggatccaaatttaacacggttgattcac和crr2-aprimer：gtcgactcgggattcactttaccttctag为引物，通过pcr方法扩增获得crr2基因，其序列如seqidno:1所示(带有bamhi和sali两限制性内切酶的酶切位点)。
pcr扩增反应体系如下：
pcr扩增程序：98℃5分钟；98℃10秒钟，55℃5秒，72℃15秒，32个循环；72℃5分钟。
2、crr2的鉴定与表达模式分析
利用木薯顶端和叶片在低温和干旱处理前后(低温处理：4周龄木薯组培苗在4摄氏度条件下处理24小时后取材；干旱处理：4周龄木薯组培苗在20％peg中处理3小时后取材)的ssrna-seq测序数据，我们鉴定到318个特异响应低温、干旱的lncrna(图1a)，韦恩分析发现其中69个lncrna共同受到低温和干旱胁迫的调控(图1b)。其中，crr2(crr2基因转录的rna，其序列如seqidno:2所示)的表达特异地受到低温胁迫的调控(图1c)，利用qrt-pcr检测crr2在不同低温处理时间段的表达趋势，发现crr2能够在短时间内对低温做出响应，并在低温处理24小时候表达量达到峰值(图1d)。
3、crr2的一级序列及二级结构分析
经ssrna-seq测序数据分析，crr2基因位于八号染色负链表达，全长329bp，gc含量56％，由1个外显子组成，其上下游邻近蛋白质编码基因分别是manes.06g068600和manes.08g068500。
为研究木薯crr2的序列保守程度，从而在进化层面上对其进行功能注释。我们以crr2的全长序列为检索对象搜索ncbi数据库，并未在其他物种中搜索到同源序列，表明crr2序列的保守程度较低。
利用rnafold软件的最小自由能算法(minimumfreeenergy，mfe)，对crr2进行二级结构特征分析，发现crr2含有4个主要茎环结构，其中位于5’端的一号茎环含有一个分支环(图2)。
4、亚细胞定位分析
对于crr2亚细胞定位的分析，能帮助我们解析其生物学功能。利用rna荧光原位杂交技术(fish)可以直观的观测到crr2的亚细胞定位。我们针对性的设计了crr2的探针，以木薯幼嫩叶片的横切组织为材料，通过杂交、免疫后观测到crr2在木薯细胞核、细胞质中均有定位(图3)。
5、木薯crr2高表达株系的低温耐受性研究
将“1、crr2基因的获得”得到的扩增产物经bamhi和sali双酶切后连接到经相同内切酶切后的表达载体pcambia1301中，通过测序鉴定目的序列的完整性和连接顺序的正确性，包含35s和终止子及crr2的dna序列如seqidno:5所示。
将构建的crr2基因过表达载体，转化木薯胚性愈伤，获得了8个阳性转基因木薯株系。southernblot成功验证了转基因植株的真实性和插入位点的数目(图4a)。我们发现crr2过表达株系1号和5号中crr2的表达量相对较高且具有单一的插入位点(图4b)，因此这两个株系将被作为后续的主要研究材料。
我们将5周大小的盆栽苗放在4摄氏度的光照培养箱中处理2天后，温度恢复到26摄氏度，培养7天后拍照，分别检测木薯野生型(wt)和crr2高表达(oe-1和oe-5)组之间在低温胁迫敏感性上是否存在差异。图4c显示与wt相比，crr2高表达株系对低温胁迫更加耐受，存活率也大幅提高。同时，crr2高表达株系中脯氨酸含量较wt中显著提高(图4d)，而低温处理后丙二醛(mda)的含量较wt显著降低(图4e)，这两个低温相关的生理指标与其生理表型是一致的，表明crr2的高表达显著提高了木薯的低温耐受能力。
6、木薯crr2特异地调控了140个蛋白质编码基因的表达
为了解析受crr2调控的下游关键基因和遗传通路，我们对木薯野生型和转crr2基因的株系进行了低温处理(5周大小的盆栽苗放在4摄氏度的光照培养箱中处理2天后，温度恢复到26摄氏度观察7天)，并采集处理前后植株的叶片和顶端，进行了转录组测序。对数据分析后，我们采用deseq进行下游基因差异表达分析，通过比较处理前后转基因株系与对照组，并选取|log2ratio|≥1和q<0.05的基因作为差异表达下游基因。我们发现相当数量的蛋白质编码基因受crr2直接或间接调控(图5a)。对oe-1和oe-5两个株系在低温处理前后的调控基因进行交叉比较，发现分别有33和107个基因始终受到crr2的诱导和抑制表达(图5b)，这些基因将作为后续研究的重点目标进行深入研究。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110>中国热带农业科学院热带生物技术研究所
<120>一种提高植物低温耐受性的rna及其应用
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>339
<212>dna
<213>artificial
<400>1
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1.一种提高植物低温耐受性的crr2基因，其特征在于，其核苷酸序列如seqidno:1所示。
2.一种提高植物低温耐受性的rna，其特征在于，其核苷酸序列如seqidno:2所示。
3.一种重组载体，其特征在于，其包含原始载体和权利要求1所述的crr2基因。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述原始载体为pcambia1301载体质粒，权利要求1所述的crr2基因与pcambia1301载体质粒经bamhi和sali两限制性内切酶双酶切连接。
5.如权利要求1所述的crr2基因、或者权利要求2所述的rna、或者权利要求3或4所述的重组载体在提高植物低温耐受性中的应用。
6.一种权利要求1所述的crr2基因的扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：以木薯品种tms60444的叶片为材料提取总rna，以polyt进行反转录获得的cdna为模板，以crr2-sprimer：ggatccaaatttaacacggttgattcac和crr2-aprimer：gtcgactcgggattcactttaccttctag为引物，通过pcr方法扩增获得crr2基因，其序列如seqidno:1所示。
7.一种引物对，其特征在于，其核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示。
技术总结