本发明属于基因编辑
技术领域：
，具体涉及一种可以在高等丝状真菌香菇中过表达cas9蛋白的cas9蛋白双元表达载体及其构建方法、应用和转化系统。
背景技术：
：crispr/cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)系统是继znf和talens技术之后的第三代基因编辑技术，被广泛应用于原核生物以及真核生物细胞水平和个体水平基因编辑细胞系。crispr/cas9相比其他基因编辑技术，如新指核酸酶(zfns)或转录激活因子样效应物核酸酶(talens)，操作更简单，同时更容易针对同一细胞中的多个基因位点进行编辑，该系统可成为替代目前基因组工程方法的一种更安全，毒性更低的新方法。到目前为止crispr/cas已经运用到了各种细胞以及大肠杆菌、酿酒酵母、拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、线虫、果蝇、蚕、斑马鱼、非洲爪蟾、小鼠、大鼠、猪、羊等，从最低等的微生物到哺乳动物的基因敲除修饰或突变。另一方面，其强大的基因组编辑能力已经用于生物治疗，如hiv、hbv等rna病毒引起的疾病治疗研究、单基因或多基因遗传病治疗研究、癌症治疗研究等方面。但在高等丝状担子菌中，由于自身极低的同源重组率，或缺乏相关的质粒体系，难以利用传统的方法开展遗传转化操作的研究，crispr/cas9系统的应用一直发展缓慢。gpie-egfp是南京农业大学赵明文教授实验室最早运用的，已在高等丝状真菌灵芝中实现了高等绿色荧光蛋白egfp的表达。原始载体gpie-egfp是一个双元表达载体，可利用农杆菌介导的方法，携带目的基因转化至灵芝中，且本身具有潮霉素hyg抗性筛选标签，具体可参见shietal.于2012年发表的文章(shil,fangx,lim,mud,rena,tanq,zhaom.(2012).developmentofasimpleandefficienttransformationsystemforthebasidiomycetousmedicinalfungusganodermalucidum.worldjmicrobiolbiotechnol.28:283–291.doi:10.1007/s11274-011-0818-z.。技术实现要素：本发明提供了一种优化的可以在高等丝状真菌香菇中过表达cas9蛋白的双元表达载体，解决了在香菇中无法表达cas9蛋白的技术问题。本发明的目的之一在于提供一种cas9蛋白双元表达载体，以双元表达载体gpie-egfp为基础，用优化的cas9蛋白编码基因替换双元表达载体gpie-egfp的egfp编码基因。所述cas9蛋白双元表达载体还具有能够在大肠杆菌和农杆菌中复制扩增的元件、能够携带外源基因的lbt-dna和rbt-dna、和/或灵芝中组成型表达基因gpd的启动子glgpdp。所述优化的cas9蛋白编码基因，如seqidno.1所示包括：所述cas9蛋白编码基因的n端包含glgpd的第一个内含子和第一个外显子的前3个氨基酸编码序列，共76个碱基，如seqidno.2所示；经密码子优化，适合在丝状真菌香菇中表达；所述cas9蛋白编码基因n端增加如seqidno.3所示的3×flag标签序列，以利于后续检测蛋白质表达；所述cas9蛋白编码基因n端和c端各增加一个如seqidno.4和seqidno.5所示的核定位信号编码序列nls，增加cas9基因的核定位能力；所述cas9蛋白编目基因c端包含一个35s终止子，如seqidno.6。改造后获得的gpie-cas9双元表达载体的碱基序列如seqidno.11所示，图谱如图4所示。本发明的目的之二在于提供一种构建所述cas9蛋白双元表达载体的方法，包括如下步骤：步骤s1，用限制性内切酶bamhi和psti酶切原始载体gpie-egfp质粒，以去除原始载体gpie-egfp中的egfp蛋白编码基因序列；步骤s2，用t4dna连接酶连接步骤s1中去除egfp蛋白编码基因序列的载体大片段与具有粘性末端的人工合成优化的cas9蛋白编码基因；其中，所述优化的cas9蛋白编码基因序列n端包含glgpd的第一个内含子和第一个外显子的前3个氨基酸编码序列共76个碱基序列、3×flag标签序列、同时n端和c端各增加一个核定位信号编码序列nls、c端包含一个35s终止子。本发明的目的之三在于提供一种所述的cas9蛋白双元表达载体的应用，所述应用为所述cas9蛋白双元表达载体在丝状真菌香菇中过表达cas9蛋白。本发明的目的之四在于提供一种含有cas9蛋白双元表达载体的转化系统，其是将权利要求1～7任一项所述的cas9蛋白双元表达载体通过农杆菌介导法导入宿主香菇中，并筛选阳性转化子获得。本发明积极进步效果在于：本发明载体构建简单，优化的cas9蛋白编码基因包含的元件序列均为人工合成，合成后的片段序列可直接替换原始载体gpie-egfp中的egfp编码基因片段。本发明经密码子优化cas9蛋白双元表达载体适合在丝状真菌香菇中过表达cas9蛋白。附图说明图1为原始载体gpie-egfp的结构图谱。图2为原始载体gpie-egfp经bamhi和psti酶切电泳结果图。图3为人工合成优化的cas9蛋白基因编码序列片段电泳结果图。图4为本发明的cas9蛋白双元表达载体即重组载体gpie-cas9的结构图谱。图5为大肠杆菌gpie-cas9阳性转化子验证cas9优化基因部分片段的dna扩增电泳结果图。图6为重组载体gpie-cas9经bamhi和psti酶切电泳结果图。图7为香菇单核体阳性转化子验证cas9优化基因部分片段的dna扩增电泳结果图。图8为香菇单核体阳性转化子cas9优化基因的mrna转录水平rt-qpcr检测结果图。图9为香菇单核体阳性转化子中优化的cas9蛋白表达水平的western-blot检测图。具体实施方式实施例一、原始载体改造1.去除原始载体gpie-egfp中的egfp蛋白编码基因序列gpie-egfp(图1)用bamhi和psti酶切，回收载体片段(约10594bp左右)，如seqidno.7所示。具体步骤如下：(1)用限制性内切酶bamhi和psti酶切gpie-egfp质粒，酶切体系如表1所示，37℃反应2-3h。表1组分量ddh2oto50μlgpie-egfp质粒2μg10×buffer5μlbamhi1μlpsti1μl总量50μl(2)酶切后的gpie-egfp质粒进行琼脂糖凝胶分离，结果如图2所示，用axygen公司的dna凝胶回收试剂盒纯化回收载体大片段，溶解在30μl的ddh2o中，-20℃备用。2.优化的cas9蛋白表达基因片段的纯化回收优化的cas9蛋白表达基因片段序列如seqidno.1所示，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，提供包含目的片段的puc57-cas9质粒。用bamhi和psti酶切puc57-cas9质粒，回收目的基因片段(约4570bp左右)。(1)用限制性内切酶bamhi和psti酶切puc57-cas9质粒，酶切体系如表2所示，37℃反应2-3h。表2组分用量ddh2oto50μlpuc57-cas9质粒2μg10×buffer5μlbamhi1μlpsti1μl总量50μl(2)酶切后的puc57-cas9质粒进行琼脂糖凝胶分离，用axygen公司的dna凝胶回收试剂盒纯化回收cas9目的基因片段即优化的cas9蛋白编码基因，片段经琼脂糖凝胶电泳检测后(图3)，溶解在30μl的ddh2o中，-20℃备用。二、cas9蛋白双元表达载体的构建及检测1.原始载体与目的基因的连接经过酶切回收的载体gpie(seqidno.7)和优化的cas9蛋白编码基因(seqidno.1)均具有由限制性内切酶bamhi和psti双酶切之后形成的黏性末端，可用takara公司的t4dnaligase进行连接，连接体系如表3所示，16℃反应3h。表3组分量ddh2oto20μlgpie双酶切载体片段50ngcas9基因双酶切片段与载体dna的摩尔比约为310×ligationbuffer2μlt4dnaligase1μl总量20μl2.转化，阳性克隆子检测，送检测序并质粒小提。(1)转化1)取100μl的dh5α感受态细胞(上海唯地生物技术有限公司)从-80℃超低温冰箱内拿出，迅速插入冰中，5min后待菌块融化；2)加入上文中提到的酶切回收的载体gpie和优化的cas9蛋白编码基因的20μl连接产物，混匀后在冰浴中静置30min。3)将感受态细胞置于42℃水浴中热激45s，迅速放回冰中并静置2min。4)向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌lb培养基，混匀后37℃，200rpm复苏60min。5)5000rpm离心1min收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含kan抗性的抗生素lb固体培养基上。6)将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作，将平板放37℃培养至少15h。(2)阳性克隆子检测挑取连接产物转化培养平板上生长的单菌落，进行单个克隆子的kan抗性液体培养基的培养，37℃，200rpm振荡培养过夜。然后以克隆子菌液为模版进行菌液pcr，引物为tcas9f/r，引物序列如表4中的seqidno.8/9所示，菌液pcr体系如表5所示。tcas9f/r扩增片段为cas9基因中大小为432bp的基因序列，如seqidno.10所示。pcr反应温度和时间设置为：95℃预变性5min；95℃变性30s—56℃退火45s—72℃延伸30s，该步骤重复循环30次；72℃产物充分延伸10min；4℃保存pcr产物。产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示，确定能够扩增出位于432bp左右条带的克隆子为阳性克隆子。表4tcas9fcgtctgggataagggacgtg(seqidno.8)tcas9rgaagcgagcattcgcttacg(seqidno.9)表5组分量ddh2oto25μlpremixtaq12.5μl模板(菌液)2μltcas9f0.2-1.0μm终浓度tcas9r0.2-1.0μm终浓度总量20μl(3)送检测序并质粒小提挑取上一步中提到的能够扩增出检测条带的克隆子，送测序公司进行测序，序列结果与目的基因序列seqidno.10进行比对，测序正确的为阳性克隆子。阳性克隆子菌液扩大培养后，用axygen公司的质粒dna小量试剂盒抽提质粒，溶解在70μl的ddh2o中，-20℃保存。质粒应为需要构建的gpie-cas9双元表达载体，结构图谱如图4所示，完整序列如seqidno.11所示，用bamhi和psti酶切所抽提质粒，结果如图6所示，酶切后的gpie载体片段(10528bp)和cas9基因片段(4570bp)均有对等长度的片段。三、农杆菌介导的gpie-cas9双元表达载体在香菇单核体中的转化所用方法借鉴上海市农业科学院食用菌所刘建雨等人的已授权专利《一种以米粒作为培养基质的金针菇转化方法》(zl201710198507.6)和尚晓冬等人的已授权专利《一种以米粒作为培养基质的香菇转化方法》(zl20170198506.1)。参考两项专利中介绍的方法，将gpie-cas9双元表达载体转化至香菇单核体中。转化后，需要进一步筛选成功转化的转化阳性克隆子。1.gpie-cas9转化香菇阳性克隆子在基因水平检测cas9基因的复制1)挑取微量香菇单核体菌丝(0.1-1μg)置于100μltebuffer。2)95℃加热10min后，马上置于冰上冷却，用移液器反复吹打，混匀。3)取1μl上清液作为模板进行pcr，引物同为tcas9f/r，pcr程序为95℃预变性5min；95℃变性30s—56℃退火45s—72℃延伸30s，该步骤重复循环30次；72℃产物充分延伸10min；4℃保存pcr产物。4)1％琼脂糖凝胶电泳检测产物条带，结果如图8，确定能够扩增出位于432bp(seqidno.10)左右条带的克隆子为香菇单核体gpie-cas9阳性克隆子。2.香菇单核体gpie-cas9阳性克隆子在转录水平检测cas9基因的转录使用takara公司的minibestplantrnaextractionkit(codeno.9769)试剂盒抽取香菇单核体gpie-cas9阳性克隆子中cas9基因转录的mrna水平，然后用takara公司的primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)(codeno.rr047q)试剂盒将rna反转录为cdna，以cdna作为实时荧光定量pcr(rt-qpcr)的模板。检测香菇单核体gpie-cas9阳性克隆子中cas9基因转录的mrna水平的rt-qpcr以在香菇单核体中组成型表达的基因gpd为内参基因，引物为qgpdf/r，如seqidno.12/13所示，见表6，目的片段大小为167bp左右；原始载体gpie-egfp上本身具有的抗生素筛选标签潮霉素抗性基因hyg为阳性对照(已证明能够在香菇单核体细胞中表达)，引物为qhygf/r，如seqidno.14/15所示，见表6，片段大小为198bp左右；检测cas9基因转录水平的引物重新设计为目的片段为222bp左右的rt-qpcr检测引物qcas9f/r，如seqidno.16/17，见表6。表6qgpdfccccggtcacatgacatcag(seqidno.12)qgpdrtcctgtacattagcgcgacc(seqidno.13)qhygfctctcggagggcgaagaatc(seqidno.14)qhygrgcgggagatgcaataggtca(seqidno.15)qcas9fcctgatcatcaagctgccga(seqidno.16)qcas9rtccaggtagtgcttgtgctg(seqidno.17)利用rocheappliedscience的faststartuniversalsybrgreenmaster(rox)试剂进行荧光定量pcr，反应体系见表7，反应程序设置为：1)holdstage：50℃2min，95℃10min；2)pcrstage：95℃15s，55℃30s，72℃30s(收集荧光)，循环40次；3)meltcurvestage：95℃15s，60℃1min，95℃15s(收集荧光)。表7组分量rnase-freeddh2oto50μl2×ultrasybrmixture(withrox)forword25μl模板(cdna)2μlrt-qpcr检测引物f(10μm)1μlrt-qpcr检测引物r(10μm)1μl总量50μlrt-qpcr结果经分析后，表明cas9基因在mrna水平有明显转录，结果如图8所示。3.香菇单核体gpie-cas9阳性克隆子在蛋白质水平检测cas9蛋白的表达利用上海贝博生物科技有限公司的丝状真菌蛋白提取试剂盒(货号：bb-31367-1)抽提香菇单核体gpie-cas9阳性克隆子的总蛋白，用westernblot检测cas9蛋白的表达，步骤如下：(1)进行sds-page电泳，点预染marker(赛默飞，货号：26619)、抽取的香菇单核体gpie-cas9阳性克隆子的总蛋白和阴性对照，阴性对照为不带3×flag标签的cas9蛋白(takara，货号：632641)。(2)选用聚偏氟乙烯膜(pvdf膜)进行转膜，将蛋白胶上的蛋白质分子转移至pvdf膜上。转膜结束后，用封闭液封闭pvdf膜，4℃过夜。(3)将pvdf膜进行一抗交联，一抗为抗flag标签小鼠单克隆抗体(全式金生物，货号：ht201-01)，室温孵育1-2h。(4)将pvdf膜进行二抗交联，二抗为辣根过氧化物酶标记igg(全式金生物，货号：hs201-01)，室温孵育1h。(5)dab辣根过氧化物酶显色试剂盒(博士德生物，货号：ar1024)对pvdf膜进行显色实验。westernblot检测香菇单核体gpie-cas9阳性克隆子中cas9蛋白的检测结果如图9所示。序列表<110>上海市农业科学院<120>cas9蛋白双元表达载体及其构建方法、应用和转化系统<130>p210039<160>17<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>4570<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ggatccatgcccgtgagtcctgcatccccatcgtgcaccgtattcacctcatcgtttggc60ccccttctcacaggtcaaggtcatggactacaaggaccacgacggcgactacaaggacca120cgacatcgactacaaggacgacgacgacaagatggcccccaagaagaagcgcaaggtcgg180catccacggcgtgcccgccgcggacaagaagtactccatcggcctggacatcggcacgaa240cagcgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgccgtccaagaagttcaaggt300gctgggcaacaccgaccgccacagcatcaagaagaacctgatcggcgccctgctgttcga360ctcgggcgagaccgccgaggcgacgcgcctgaagcgcaccgcgcgtcgccgctacacgcg420ccgcaagaaccgcatctgctacctccaggagattttcagcaacgagatggccaaggtgga480cgactcgttcttccaccgcctggaggagtccttcctggtggaggaagacaagaagcacga540gcgccaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtacccgac600gatctaccacctgcgcaagaagctggtggacagcaccgacaaggcggacctgcgcctgat660ctacctggccctggcgcacatgatcaagttccgcggccacttcctgatcgagggcgacct720gaaccccgacaactcggacgtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaacca780gctgttcgaggagaacccgatcaacgcctcgggcgtggacgccaaggcgatcctgtccgc840gcgcctgtccaagagccgccgcctggagaacctgatcgcccagctgcccggcgagaagaa900gaacggcctgttcggcaacctgatcgcgctgagcctgggcctgacgccgaacttcaagtc960gaacttcgacctggccgaggacgcgaagctccagctgagcaaggacacctacgacgacga1020cctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgcggacctgttcctggccgcgaa1080gaacctgtcggacgccatcctgctgtccgacatcctgcgcgtgaacaccgagatcacgaa1140ggcccccctgtcggcgtccatgatcaagcgctacgacgagcaccaccaggacctgaccct1200gctgaaggcgctggtgcgccagcagctgccggagaagtacaaggagattttcttcgacca1260gtccaagaacggctacgccggctacatcgacggcggcgcgagccaagaggagttctacaa1320gttcatcaagcccatcctggagaagatggacggcacggaggagctgctggtgaagctgaa1380ccgcgaggacctgctgcgcaagcagcgcaccttcgacaacggcagcatcccccaccagat1440ccacctgggcgagctgcacgccatcctgcgtcgccaagaggacttctacccgttcctgaa1500ggacaaccgcgagaagatcgagaagatcctgacgttccgcatcccctactacgtgggccc1560gctggcccgcggcaactcccgcttcgcgtggatgacccgcaagagcgaggagaccatcac1620gccctggaacttcgaggaagtggtggacaagggcgccagcgcgcagtcgttcatcgagcg1680catgaccaacttcgacaagaacctgcccaacgagaaggtgctgccgaagcactccctgct1740gtacgagtacttcaccgtgtacaacgagctgacgaaggtgaagtatgtgaccgagggcat1800gcgcaagcccgccttcctgagcggcgagcagaagaaggcgatcgtggacctgctgttcaa1860gaccaaccgcaaggtgacggtgaagcagctgaaagaggactacttcaagaagatcgagtg1920cttcgacagcgtggagatcagcggcgtggaggaccgcttcaacgccagcctgggcaccta1980ccacgacctgctgaagatcatcaaggacaaggacttcctggacaacgaggagaacgagga2040catcctggaggacatcgtgctgaccctgacgctgttcgaggaccgcgagatgatcgagga2100gcgcctgaagacgtacgcccacctgttcgacgacaaggtcatgaagcagctgaagcgtcg2160ccgctacaccggctggggccgcctgagccgcaagctgatcaacggcatccgcgacaagca2220gtcgggcaagaccatcctggacttcctgaagtccgacggcttcgcgaaccgcaacttcat2280gcagctgatccacgacgactcgctgaccttcaaagaggacatccagaaggcccaggtgtc2340gggccagggcgactccctgcacgagcacatcgccaacctggcgggctcccccgcgatcaa2400gaagggcatcctccagaccgtgaaggtggtggacgagctggtgaaggtcatgggccgcca2460caagccggagaacatcgtgatcgagatggcccgcgagaaccagaccacgcagaagggcca2520gaagaacagccgcgagcgcatgaagcgcatcgaggaaggcatcaaggagctgggctcgca2580gatcctgaaggagcaccccgtggagaacacccagctccagaacgagaagctgtacctgta2640ctacctccagaacggccgcgacatgtatgtggaccaggagctggacatcaaccgcctgtc2700cgactacgacgtggaccacatcgtgccccagagcttcctgaaggacgactcgatcgacaa2760caaggtgctgacccgcagcgacaagaaccgcggcaagagcgacaacgtgccgtcggagga2820agtggtgaagaagatgaagaactactggcgccagctgctgaacgccaagctgatcacgca2880gcgcaagttcgacaacctgaccaaggccgagcgcggtggcctgtcggagctggacaaggc2940gggcttcatcaagcgccagctggtggagacccgccagatcacgaagcacgtggcgcagat3000cctggactcccgcatgaacacgaagtacgacgagaacgacaagctgatccgcgag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技术特征：1.一种cas9蛋白双元表达载体，以双元表达载体gpie-egfp为基础，其特征在于，用优化的cas9蛋白编码基因替换双元表达载体gpie-egfp的egfp编码基因获得的gpie-cas9双元表达载体。
2.根据权利要求1所述的cas9蛋白双元表达载体，其特征在于，所述优化的cas9蛋白编码基因包括：
所述cas9蛋白编码基因的n端包含glgpd的第一个内含子和第一个外显子的前3个氨基酸编码序列；
所述cas9蛋白编目基因c端包含一个35s终止子。
3.根据权利要求2所述的cas9蛋白双元表达载体，其特征在于，所述cas9蛋白编码基因的n端包含glgpd的第一个内含子和第一个外显子的前3个氨基酸编码序列，共76个碱基，如seqidno.2所示。
4.根据权利要求2所述的cas9蛋白双元表达载体，其特征在于，所述cas9蛋白编目基因c端包含一个35s终止子，如seqidno.6。
5.根据权利要求2所述的cas9蛋白双元表达载体，其特征在于，所述优化的cas9蛋白编码基因还包括：
所述cas9蛋白编码基因n端增加如seqidno.3所示的3×flag标签序列，以利于后续检测蛋白质表达；
和/或，
所述cas9蛋白编码基因n端和c端各增加一个如seqidno.4和seqidno.5所示的核定位信号编码序列nls，增加cas9基因的核定位能力。
6.根据权利要求2所述的cas9蛋白双元表达载体，其特征在于，所述优化的cas9蛋白编码基因如seqidno.1所示。
7.根据权利要求1所述的cas9蛋白双元表达载体，其特征在于，所述cas9蛋白双元表达载体具有能够在大肠杆菌和农杆菌中复制扩增的元件、能够携带外源基因的lbt-dna和rbt-dna、和/或灵芝中组成型表达基因gpd的启动子glgpdp。
8.一种构建权利要求1～7任一项所述cas9蛋白双元表达载体的方法，包括如下步骤：
步骤s1，用限制性内切酶bamhi和psti酶切原始载体gpie-egfp质粒，以去除原始载体gpie-egfp中的egfp蛋白编码基因序列；
步骤s2，用t4dna连接酶连接步骤s1中去除egfp蛋白编码基因序列的载体大片段与具有粘性末端的人工合成优化的cas9蛋白编码基因；
其中，所述优化的cas9蛋白编码基因序列n端包含glgpd的第一个内含子和第一个外显子的前3个氨基酸编码序列共76个碱基序列、3×flag标签序列、同时n端和c端各增加一个核定位信号编码序列nls、c端包含一个35s终止子。
9.一种权利要求1～7任一项所述的cas9蛋白双元表达载体的应用，其特征在于所述应用为所述cas9蛋白双元表达载体在丝状真菌香菇中过表达cas9蛋白。
10.一种含有cas9蛋白双元表达载体的转化系统，其特征在于将权利要求1～7任一项所述的cas9蛋白双元表达载体通过农杆菌介导法导入宿主香菇中，并筛选阳性转化子获得。
技术总结本发明公开了一种Cas9蛋白双元表达载体及其构建方法、应用和转化系统，以双元表达载体GPiE‑egfp为基础，用优化的Cas9蛋白编码基因替换双元表达载体GPiE‑egfp的eGFP编码基因获得Cas9蛋白双元表达载体。其具有能够在大肠杆菌和农杆菌中复制扩增的元件、能够携带外源基因的LB T‑DNA和RB T‑DNA、灵芝中组成型表达基因gpd的启动子Glgpdp和优化的Cas9蛋白编码基因，所述优化的cas9基因的N端包含Glgpd的第一个内含子和第一个外显子的前3个氨基酸编码序列共76个碱基和3×FLAG标签，同时在cas9基因的N端和C端各增加一个核定位信号编码序列NLS。本发明经密码子优化Cas9蛋白双元表达载体适合在丝状真菌香菇中表达Cas9蛋白。
技术研发人员：付阳;谭琦;尚晓冬;宋春艳
受保护的技术使用者：上海市农业科学院
技术研发日：2021.06.17
技术公布日：2021.08.03
