一种不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法与流程

1.本发明属于银杏叶提取物的制备领域，尤其涉及一种不含银杏酸的水溶性银 杏叶提取物的制备方法。


背景技术：

2.以银杏叶为原料制备的银杏叶标准提取物为棕色粉末，味苦，具有活血、化 瘀、通络、扩张血管、改善微循环等功效，因而广泛应用于心脑血管疾病患者的 治疗与康复。目前市场上银杏叶标准提取物的质量标准为银杏黄酮含量＞24％， 银杏内酯＞6％，银杏酸＜10ppm。然而该类银杏叶标准提取物中含有银杏酸，其 具有强致敏性及细胞毒性等毒副作用，限制了其在美容产品中的应用；其次，该 类银杏叶标准提取物大约50％成分不溶于水，不利于配制化妆品；此外，该类银 杏叶提取物配制的化妆品颜色深，限制了其在化妆品中的添加量。


技术实现要素：

3.发明目的：本发明的目的是提供一种能够用于化妆品、不含银杏酸的水溶性 银杏叶提取物的制备方法，该方法制备的银杏叶提取物不仅能很好地清除自由基， 抗氧化能力强，水溶性好，久置稳定，同时兼顾抑制酪氨酸酶的功效。
4.技术方案：本发明不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法，包括如下 步骤：
5.(1)采用浓度为10
‑
45％的乙醇对银杏叶进行多次浸提后，过滤、合并滤液 并减压浓缩至无醇；
6.(2)采用纯水加热搅拌溶解、冷却至2
‑
10℃，离心、经陶瓷膜过滤，采用 5
‑
30％的乙醇洗脱，获得的洗脱液上脱酸树脂柱，浓缩、真空干燥制得粗品；
7.(3)采用浓度为90
‑
95％的乙醇对粗品加热回流后，经冷却、过滤，浓缩、 干燥、粉碎，制得不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物。
8.本发明的制备方法通过先采用低浓度的乙醇进行提取，浓缩、稀释后再冷却 至2
‑
10℃，离心去杂、离心液陶瓷膜过滤，滤液随后上大孔吸附树脂柱，水洗去 杂后再采用低浓度的乙醇进行洗脱，最后将获得的低醇洗脱液上脱酸树脂柱进行 脱酸，通过这些步骤之间的环环相扣，进而能够有效制得不含银杏酸的水溶性银 杏叶提取物。
9.进一步说，步骤(1)中，所述多次浸提为两次浸提，先采用与银杏叶质量 体积比为1:7
‑
10、浓度为10
‑
45％的乙醇进行回流提取2
‑
3h，再采用与银杏叶质 量体积比为1:5
‑
10、浓度为10
‑
45％的乙醇进行回流提取2
‑
3h。
10.进一步说，步骤(2)中，所述加热搅拌溶解的温度为20
‑
50℃，时间为30
‑
60min。
11.进一步说，步骤(2)中，所述乙醇洗脱的流速为每小时1
‑
3柱床体积。
12.进一步说，步骤(2)中，所述浓缩是经脱酸树脂柱后的流出液纳滤膜浓缩 至固体物含量10
‑
20％，再真空浓缩至浸膏状。
13.进一步说，步骤(3)中，所述加热回流的温度为20
‑
50℃，时间为30
‑
60min。
14.再进一步说，本发明制备的水溶性银杏叶提取物中银杏黄酮醇质量分数为 4
‑
10％，银杏总内酯质量分数为1.5
‑
4％，银杏酸的质量分数为0。
15.更进一步说，本发明制备的水溶性银杏叶提取物应用于化妆品。
16.有益效果：与现有技术相比，本发明的显著优点为：该制备方法能够有效提 取不含银杏酸的水溶性淡黄色银杏叶提取物，该银杏叶提取物极易溶于水，能够 长时间放置无沉淀析出，且该银杏叶提取物不仅能很好地清除自由基，抗氧化能 力强，水溶性好，久置稳定，同时兼顾抑制酪氨酸酶功效，将其单独或与其他活 性物质合用，能赋予化妆品以消除炎症，抗花粉过敏，美白，抗蓝光等功效。
附图说明
17.图1为本发明制备的银杏叶提取物清除羟自由基的反应曲线图；
18.图2为本发明制备的银杏叶提取物清除dpph自由基的反应曲线图；
19.图3为本发明制备的银杏叶提取物酪氨酸酶活能力的抑制反应曲线图。
具体实施方式
20.下面结合实施例和附图对本发明的技术方案做进一步详细说明。
21.实施例1
22.本发明不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法，包括如下步骤：
23.(1)浸提：将银杏绿叶烘干、粉碎，先加入与银杏叶质量体积比为1:7、浓 度为45％的乙醇回流提取3h，过滤；滤渣再加入质量体积比为1:5、浓度为45％ 的乙醇回流提取3h，过滤，合并两次浸提的滤液，减压浓缩至无醇；
24.(2)柱色谱：加入质量比为1:3的纯水加热至50℃搅拌回流30min，冷却 至4℃，离心，将离心液经陶瓷膜过滤，滤液上大孔吸附树脂，水洗除杂后，采 用浓度为30％的乙醇进行洗脱，洗脱的流速为每小时1
‑
3柱床体积；
25.(3)制备提取物：将洗脱获得的洗脱液上脱酸树脂柱，并将流出液纳滤膜 浓缩至固体物含量20％，再真空浓缩至浸膏状，真空干燥、粉碎，制得粗品；将 粗品加入浓度为95％的乙醇，在50℃条件下加热回流1h，冷却至室温，过滤后 将滤液真空浓缩、干燥、粉碎，制得不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物，该银杏 叶提取物的收率为0.4％。
26.成品检测：该实施例制备的银杏叶提取物为淡黄色，易溶于水，水溶液澄清 透明。并且经hplc检测，所含银杏黄酮醇为10％，银杏总内酯4％，银杏酸含 量为零。
27.性能检测
28.将上述制备的银杏叶提取物分别进行清除羟自由基能力、清除dpph自由基 能力和抑制酪氨酸酶活能力性能检测，对应的试验方案如下所示。
29.一、清除羟自由基性能检测
30.(1)试验材料
31.试剂：pbs、硫酸亚铁铵、邻二氮菲、0.1％双氧水溶液，ddh2o。
32.仪器：紫外分光光度计、比色皿、移液皿、水浴锅、试管。
33.(2)测试方法：紫外分光光度法。
34.(3)试验步骤
35.表1试剂及其用量
[0036][0037]
所有试管依次加入上表中的试剂(双氧水最后一步加入)，置于37℃水浴反 应1h，以1号试管溶液为参比，在536nm波长下分别测定2、3、4、5号试管溶 液的吸光度。以抗氧化剂v
c
作为阳性对照，每次实验进行三次平行，结果取平 均值。
[0038]
清除率(％)＝(a
样
‑
a
样空
‑
a
损
)/(a
未损
‑
a
损
)；
[0039]
其中，a
样
为加入受试物的羟基自由基体系(即fe
2
‑
邻二氮菲 双氧水 受试 物)的吸光度；
[0040]
a
样空
为受试物的吸光度；
[0041]
a
损
为加入双氧水的羟自由基体系(即fe
2
‑
邻氮二菲 双氧水)的吸光度；
[0042]
a
未损
为不加入双氧水的羟自由基体系(即fe
2
‑
邻氮二菲溶液)的吸光度。
[0043]
(4)试验结果
[0044]
表2体外抗氧化作用
[0045]
样品浓度(mg/ml)抗氧化率(％)v
c
1.0450.0银杏叶提取物2.599.3银杏叶提取物1.2573.5银杏叶提取物0.62560.3银杏叶提取物0.312549.9
[0046]
根据表2的结果获得剂量
‑
反应曲线，如图1所示。当浓度为2.5mg/ml时， 银杏叶提取物的羟自由基清除率能达到99.3％，且根据图1所示的剂量
‑
反应曲 线可知，其ec
50
值为0.23mg/ml。由此可知，该银杏叶提取物能够较好地清除 自由基，抗氧化能力强。
[0047]
二、清除dpph自由基性能检测
[0048]
(1)试验材料
[0049]
待测样品银杏叶提取物，维他命e溶解于无水乙醇溶液。用无水乙醇制备 0.1mmdpph溶液，4℃保存备用。
[0050]
(2)实验步骤
[0051]
样品组：在试管中分别依次加入1ml dpph溶液和0.5ml不同浓度的待测 样品，混匀后黑暗处放置60min，将上述溶液转移至比色皿中，以无水乙醇为基 准(调零)在517nm波长处测吸光值，吸光值记为a1；
[0052]
空白对照：在试管中分别依次加入1ml无水乙醇和0.5ml不同浓度的待测 样品，黑暗处放置60min，将上述溶液转移至比色皿中，以无水乙醇为基准(调 零)在517nm波长处测吸光值，吸光值记为a2；
[0053]
控制组：在试管中加入1ml dpph溶液和0.5ml无水乙醇，混匀后黑暗处 放置60min，将上述溶液转移至比色皿中，以无水乙醇为基准(调零)在517nm 波长处测吸光值，吸光值记为a0。
[0054]
根据以下自由基清除率公式计算(k)：
[0055]
k(％)＝[1
‑
(a1‑
a2)/a0]*100％
[0056]
试验重复三次，取其平均值作为最后结果。
[0057]
(3)试验结果
[0058]
表3体外抗氧化作用
[0059]
样品浓度(mg/ml)抗氧化率(％)ve0.043191.5银杏叶提取物0.04094.6银杏叶提取物0.02584.9银杏叶提取物0.02069.5银杏叶提取物0.01055.7银杏叶提取物0.005036.2银杏叶提取物0.002528.1
[0060]
根据表3获得的剂量
‑
反应曲线如图2所示。根据该图2可知，ve在浓度为 0.0431mg/ml时的dpph自由基清除率为91.5％，当浓度为0.040mg/ml时，银 杏叶提取物的dpph自由基清除率为94.6％，，且其ec
50
值为0.0079mg/ml。由 此可知，本发明制备的银杏叶提取物对dpph(1,1
‑
二苯基
‑2‑
三硝基苯肼)的清除 能力强于油溶性维生素e。
[0061]
(三)抑制蘑菇酪氨酸酶活性能检测
[0062]
(1)试验材料
[0063]
仪器：水浴锅、elx808酶标仪、移液枪、ep管、试管、枪头。
[0064]
试剂：磷酸缓冲液(pb)、蘑菇酪氨酸酶、l
‑
左旋多巴标准溶液、银杏叶提 取物。用pb溶液稀释银杏叶提取物。
[0065]
(2)试验方法
[0066]
用移液枪移取40μl浓度为5mmol/l的l
‑
左旋多巴到96孔板中，加入40μl 待测银杏叶提取物，加入80μl的磷酸缓冲液，37℃温育10min，最后加入40μl 酪氨酸酶，温育5
‑
10min，迅速在酶标仪490nm下测定吸光度。每个浓度设置 三个平行：设置空白组(不加酪氨酸酶，以死酶代替)和控制组(不加样品，以 磷酸缓冲液代替)。
[0067]
酪氨酸酶活性抑制率/％＝(1
‑
ai/ao)
×
100％
[0068]
其中，ao：控制组扣掉空白组的吸光度；
[0069]
ai：样品组扣掉空白组的吸光度；
[0070]
至少测定3个浓度下的抑制酪氨酸酶活能力，经数据拟合后计算出ic
50
。ic
50
越小，则抑制酪氨酸酶能力越强。
[0071]
(3)试验结果
[0072]
表4酪氨酸酶酶活抑制率
[0073]
样品浓度(mg/ml)酪氨酸酶抑制率(％)银杏叶提取物2.0077.1银杏叶提取物1.6084.8银杏叶提取物1.2074.1银杏叶提取物0.858.8银杏叶提取物0.435.3银杏叶提取物0.224.6
[0074]
由表4获得的对蘑菇酪氨酸酶的酶活抑制率剂量
‑
反应曲线如图3所示。根 据表4可知，当浓度为1.60mg/ml时，银杏叶提取物对酪氨酸酶酶活抑制率可 以达到84.8％，并且根据剂量
‑
反应曲线计算可得，i
c50
值为0.564mg/ml。表明， 银杏叶提取物具有较好的美白功效。
[0075]
综上所述，本发明提取的银杏叶提取物不仅能很好地清除自由基，抗氧化能 力强，水溶性好，久置稳定，同时兼顾抑制酪氨酸酶功效，其能够更安全地应用 于化妆品中。
[0076]
实施例2
[0077]
本发明不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法，包括如下步骤：
[0078]
(1)浸提：将银杏绿叶烘干、粉碎，先加入质量体积比为1:8、浓度为40％ 的乙醇回流提取2.5h，过滤；再加入质量体积比为1:6、浓度为40％的乙醇回流 提取2.5h，过滤，合并两次浸提的滤液，减压浓缩至无醇；
[0079]
(2)柱色谱：加入质量比为1:4的纯水加热至30℃搅拌回流40min，冷却 至2℃离心，将离心液经陶瓷膜过滤，滤液上大孔吸附树脂，水洗除杂后，采用 浓度为25％的乙醇进行洗脱，洗脱的流速为每小时1
‑
3柱床体积；
[0080]
(3)制备提取物：将洗脱获得的洗脱液上脱酸树脂柱，并将流出液纳滤膜 浓缩至固体物含量15％，再真空浓缩至浸膏状，真空干燥、粉碎，制得粗品；将 粗品加入浓度为93％的乙醇，加热至30℃回流0.5h，冷却至室温，过滤后将滤 液真空浓缩、干燥、粉碎，制得不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物，该银杏叶提 取物的收率为0.35％。
[0081]
成品检测：该实施例制备的银杏叶提取物为淡黄色，易溶于水，水溶液澄清 透明。并且经hplc检测，所含银杏黄酮醇为7.4％，银杏总内酯3.8％，银杏酸 含量为零。
[0082]
实施例3
[0083]
本发明不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法，包括如下步骤：
[0084]
(1)浸提：将银杏绿叶烘干、粉碎，先加入质量体积比为1:9、浓度为30％ 的乙醇回流提取2h，过滤；再加入质量体积比为1:7、浓度为30％的乙醇回流提 取2h，过滤，合并两次浸提的滤液，减压浓缩至无醇；
[0085]
(2)柱色谱：加入质量比为1:5的纯水加热至20℃搅拌回流50min，冷却 至6℃，离心，将离心液经陶瓷膜过滤，滤液上大孔吸附树脂，水洗除杂后，采 用浓度为20％的乙醇进
行洗脱，洗脱的流速为每小时1
‑
3柱床体积；
[0086]
(3)制备提取物：将洗脱获得的洗脱液上脱酸树脂柱，并将流出液纳滤膜 浓缩至固体物含量18％，再真空浓缩至浸膏状，真空干燥、粉碎，制得粗品；将 粗品加入浓度为91％的乙醇，加热至20℃回流0.5h，冷却至室温，过滤后将滤 液真空浓缩、干燥、粉碎，制得不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物，该银杏叶提 取物的收率为0.3％。
[0087]
成品检测：该实施例制备的银杏叶提取物为淡黄色，易溶于水，水溶液澄清 透明。并且经hplc检测，所含银杏黄酮醇为6.3％，银杏总内酯3.2％，银杏酸 含量为零。
[0088]
实施例4
[0089]
本发明不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法，包括如下步骤：
[0090]
(1)浸提：将银杏绿叶烘干、粉碎，先加入质量体积比为1:10、浓度为20％ 的乙醇回流提取2h，过滤；再加入质量体积比为1:10、浓度为20％的乙醇回流 提取2h，过滤，合并两次浸提的滤液，减压浓缩至无醇；
[0091]
(2)柱色谱：加入质量比为1:5的纯水加热至20℃搅拌回流60min，冷却 至8℃，离心，将离心液经陶瓷膜过滤，滤液上大孔吸附树脂，水洗除杂后，采 用浓度为15％的乙醇进行洗脱，洗脱的流速为每小时1
‑
3柱床体积；
[0092]
(3)制备提取物：将洗脱获得的洗脱液上脱酸树脂柱，并将流出液纳滤膜 浓缩至固体物含量15％，再真空浓缩至浸膏状，真空干燥、粉碎，制得粗品；将 粗品加入浓度为90％的乙醇，加热至20℃回流0.5h，冷却至室温，过滤后将滤 液真空浓缩、干燥、粉碎，制得不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物，该银杏叶提 取物的收率为0.25％。
[0093]
成品检测：该实施例制备的银杏叶提取物为淡黄色，易溶于水，水溶液澄清 透明。并且经hplc检测，所含银杏黄酮醇为5.1％，银杏总内酯2.0％，银杏酸 含量为零。
[0094]
实施例5
[0095]
本发明不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法，包括如下步骤：
[0096]
(1)浸提：将银杏绿叶烘干、粉碎，先加入质量体积比为1:10、浓度为10％ 的乙醇回流提取2h，过滤；再加入质量体积比为1:5、浓度为10％的乙醇回流提 取2h，过滤，合并两次浸提的滤液，减压浓缩至无醇；
[0097]
(2)柱色谱：加入质量比为1:5的纯水加热至20℃搅拌回流60min，冷却 至10℃，离心，将离心液经陶瓷膜过滤，滤液上大孔吸附树脂，水洗除杂后， 采用浓度为10％的乙醇进行洗脱，洗脱的流速为每小时1
‑
3柱床体积；
[0098]
(3)制备提取物：将洗脱获得的洗脱液上脱酸树脂柱，并将流出液纳滤膜 浓缩至固体物含量10％，再真空浓缩至浸膏状，真空干燥、粉碎，制得粗品；将 粗品加入浓度为90％的乙醇，加热至20℃回流0.5h，冷却至室温，过滤后将滤 液真空浓缩、干燥、粉碎，制得不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物，该银杏叶提 取物的收率为0.2％。
[0099]
成品检测：该实施例制备的银杏叶提取物为淡黄色，易溶于水，水溶液澄清 透明。并且经hplc检测，所含银杏黄酮醇为4％，银杏总内酯1.5％，银杏酸含 量为零。
[0100]
通过上述实施例可知，本发明的制备方法能够有效提取不含银杏酸的水溶性 淡黄色银杏叶提取物，将其单独或与其他活性物质合用，能赋予化妆品以消除炎 症，抗花粉过敏，美白，抗蓝光等功效。

技术特征：
1.一种不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)采用浓度为10
‑
45％的乙醇对银杏叶进行多次浸提后，过滤、合并滤液并减压浓缩至无醇；(2)采用纯水加热搅拌溶解、冷却至2
‑
10℃，离心、经陶瓷膜过滤，采用5
‑
30％的乙醇洗脱，获得的洗脱液上脱酸树脂柱，浓缩、真空干燥制得粗品；(3)采用浓度为90
‑
95％的乙醇对粗品加热回流后，经冷却、过滤，浓缩、干燥、粉碎，制得不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物。2.根据权利要求1所述不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述多次浸提为两次浸提，先采用与银杏叶质量体积比为1:7
‑
10、浓度为10
‑
45％的乙醇进行回流提取2
‑
3h，再采用与银杏叶质量体积比为1:5
‑
10、浓度为10
‑
45％的乙醇进行回流提取2
‑
3h。3.根据权利要求1所述不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述加热搅拌溶解的温度为20
‑
50℃，时间为30
‑
60min。4.根据权利要求1所述不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述乙醇洗脱的流速为每小时1
‑
3柱床体积。5.根据权利要求1所述不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述浓缩是经脱酸树脂柱后的流出液纳滤膜浓缩至固体物含量10
‑
20％，再真空浓缩至浸膏状。6.根据权利要求1所述不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述加热回流的温度为20
‑
50℃，时间为30
‑
60min。7.根据权利要求1所述不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法，其特征在于：制备的所述水溶性银杏叶提取物中银杏黄酮醇质量分数为4
‑
10％，银杏总内酯质量分数为1.5
‑
4％，银杏酸的质量分数为0。8.根据权利要求7所述不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法，其特征在于：所述水溶性银杏叶提取物应用于化妆品。
技术总结
本发明公开了一种不含银杏酸的水溶性银杏叶提取物的制备方法。首先采用浓度为10


技术研发人员：徐金荣 童莉 孔凡涛 郑云云 郑庆香 查建生 李新岗
受保护的技术使用者：南京斯拜科生化实业有限公司
技术研发日：2021.03.25
技术公布日：2021/6/29