本发明涉及一种华支睾吸虫特异抗原基因val28，以及基于val28为抗原研制检测华支睾吸虫感染的胶体金免疫层析试纸，可用于华支睾吸虫感染的血清检测，属于免疫学技术领域。
背景技术：
华支睾吸虫病又称肝吸虫病，是由华支睾吸虫（clonorchissinensis）寄生在包括人在内的哺乳类动物的肝胆管内所引起的以肝胆病变为主的一种重要的食源性人兽共患寄生虫病。华支睾吸虫的流行区与病毒性肝炎流行区重叠，对全球公共卫生安全产生重大威胁。华支睾吸虫感染者患肝胆管癌的风险是正常人的4.5倍，患肝硬化、肝癌的风险也成倍的增加。因此对华支睾吸虫感染血清进行血清学检测和流行病学调查可以有效的降低华支睾吸虫病的风险，有利于减轻华支睾吸虫病造成的疾病负担，对人和动物的健康发展具有重要的意义。
目前用于华支睾吸虫病的诊断方法主要是粪便虫卵检查法，在显微镜下观察虫体形态特点来做出诊断。病原学诊断方法具有快速简便的优势，其也存在一定的弊端，如由于华支睾吸虫虫卵和后睾吸虫虫卵较为相似，所以对操作人员的经验和专业性要求较高，在轻度感染时易发生误检或漏检。免疫学诊断方法是病原学诊断方法的重要补充，其具有敏感性高、特异性强、重复性好并且适用于检测样品多的基层单位等优点而被广泛应用，是病原学诊断方法的重要补充。
val蛋白完全暴露于宿主的免疫系统中，对寄生虫和宿主之间的相互关系十分重要，被认为是潜在的良好抗原。本研究利用ncbi对华支睾吸虫val28基因序列进行比对分析，结果显示，华支睾吸虫val28基因序列与目前已上传基因库的其它寄生虫基因序列不存在同源性，初步表明该基因可能具有较好的特异性。目前未见关于基于华支睾吸虫val28为抗原制备免疫胶体金试纸条以检测华支睾吸虫感染的相关报道。
技术实现要素：
本发明所述的一种华支睾吸虫特异抗原基因val28及医用用途，以及基于该基因为抗原制备的检测华支睾吸虫感染的胶体金免疫层析试纸，可用于华支睾吸虫感染血清的检测。
本发明所述的一种华支睾吸虫特异抗原基因val28（clonorchissinensisvenomallergen-likeprotein28，简称：csval28）（genbank:mh172541.1），其基因序列如：seqno.1所示。
本发明所扩增的华支睾吸虫特异抗原基因val28目的片段大小为495bp，此目的片段已去掉信号肽。通过smart在线软件分析该基因表达的蛋白含有scp结构域，通过expasy的protparam数据库对该蛋白的理化性质进行预测，该蛋白含有165个氨基酸，等电点为8.80。
本发明所述的一种华支睾吸虫特异抗原基因val28的获取方法，包括以下步骤：
根据华支睾吸虫val28的基因序列，设计特异性引物，通过聚合酶链式反应扩增出华支睾吸虫val28的目的片段，获得华支睾吸虫特异性抗原基因val28。
本发明所述的基于华支睾吸虫val28蛋白制备的一种检测华支睾吸虫感染的胶体金免疫层析试纸条：通过对华支睾吸虫val28进行蛋白纯化，利用柠檬酸三钠还原法烧制胶体金溶液，然后对胶体金溶液的ph及spa蛋白的标记量等条件进行确定，将样品垫、硝酸纤维素膜（nc膜）、金标垫、pvc底板、吸水纸等进行组装，对组装好的试纸条的检测线（华支睾吸虫val28蛋白）和质控线（兔抗spa蛋白）的最佳包被量进行确定，制备了一种诊断和检测华支睾吸虫感染的胶体金试纸条。
本发明积极效果在于：
提供了华支睾吸虫新的特异性抗原基因val28，为一种新的基因蛋白；基于华支睾吸虫val28蛋白制备的胶体金试纸条具有稳定性高、特异性强、灵敏性好，检测成本低廉等优势，另外试纸条使用方便、操作简单、检测结果简单明了、适于临床中快速诊断，解决了临床上检测和诊断疾病时间紧、待检样品数量大等问题，同时好的检测方法可以在一定程度上降低华支睾吸虫病带来的疾病负担。
附图说明：
图1为val28基因pcr扩增图（m：dl2000marker；1：val28pcr产物）；
图2为pmd-18t-val28克隆载体双酶切鉴定图（m：dna标志物（dl:5000）；
1：pmd-18t-val28克隆载体的双酶切产物；2：pmd-18t-val28克隆载体）；
图3为pet-28a-val28表达载体双酶切鉴定图（m：dna标志物（dl10000）1：pet-28a-val28表达载体的双酶切产物；2：pet-28a-val28表达载体）；
图4为重组pet-28a-val28蛋白的纯化图（m：蛋白质标志物；1：纯化的重组pet-28a-val28蛋白）；
图5图6均为重组pet-28a-val28蛋白的westernblotting分析（m：蛋白质标志物；1：犬华支睾吸虫阴性血清；2：犬华支睾吸虫阳性血清）；
图7为胶体金溶液图；
图8为胶体金颗粒透射电镜图；
图9为标记spa蛋白的胶体金颗粒透射电镜图；
图10为胶体金溶液最佳ph值的确定图；
图11为spa蛋白最佳标记量的确定图；
图12为检测线（t线）蛋白最佳包被浓度的确定图；
图13为质控线（c线）蛋白最佳包被浓度的确定；
图14为特异性试验结果图；
图15为敏感性试验结果图；
图16为重复性试验结果图；
图17为部分实际样品检测图。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
华支睾吸虫特异抗原基因的获取及鉴定
华支睾吸虫val28基因的扩增
根据华支睾吸虫val28（genbank：mh172541.1）的基因序列，设计特异性引物序列如下：
f:cgcggatcctttgtgaagctgcatgatc；
r:cccaagcttcttcaagtggcctggac（划线部分为酶切位点，划线部分之前为保护性碱基）。通过聚合酶链式反应扩增出华支睾吸虫val28的目的片段。结果显示，成功扩增出513bp的片段（包括val28目的片段、酶切位点、保护性碱基）。（如图1所示）
pmd-18t-val28克隆载体和pet-28a-val28表达载体的构建
利用bamhi和hindiii两种酶对重组质粒pmd-18t-val28进行双酶切鉴定，通过1%琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定。结果显示，成功构建pmd-18t-val28克隆载体（如图2所示）。
利用bamhi和hindiii两种酶对重组质粒pet-28a-val28进行双酶切鉴定，通过1%琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定。结果显示，成功构建pet-28a-val28表达载体（如图3所示）。
重组pet-28a-val28蛋白的表达纯化
将pet-28a菌液和测序成功的重组表达载体pet-28a-val28菌液分别培养于lb培养基，待其生长至od600=0.6时，加入千分之一的iptg诱导5h，完成表达并进行纯化，然后经sds-page分析完成蛋白的鉴定。结果显示，在约22kda处可见清晰目的条带，表明重组pet-28a-val28蛋白纯化成功（如图4所示）。
重组pet-28a-val28蛋白的westernblotting分析
利用westernblotting检测方法，以重组pet-28a-val28蛋白为抗原检测未感染华支睾吸虫的犬血清样品和犬感染华支睾吸虫阳性血清样品。结果显示，检测阴性血清时无条带（如图5所示），检测犬感染华支睾吸虫阳性血清时可见约22kda左右有清晰条带（如图6所示），表明重组pet-28a-val28蛋白具有良好的免疫原性。
实施例2
胶体金溶液的烧制
通过柠檬酸三钠还原法烧制胶体金溶液，肉眼观察胶体金颗粒溶液颜色有无变化，是否有沉淀和聚集产生。结果显示，胶体金溶液呈酒红色，无聚集和沉淀产生。（如图7所示）
胶体金颗粒的鉴定
然后，可以通过拍摄透射电镜，观察胶体金颗粒直径大小、分散情况。结果显示，胶体金颗粒粒径约为40nm，大小均一，分布均匀（如图8所示）；标记spa蛋白的金颗粒，周围有一圈晕染（如图9所示）。
最适ph值的确定
分别将不同体积的0.2mol/lk2co3分别依次加入1ml胶体金溶液中，每管均加入20μgspa蛋白进行过量标记，并缓慢混匀，静止30min后，向每管加入10%nacl各100μl，静置2h后，观察颜色变化。结果显示，当加入2μl的0.2mol/lk2co3时，颜色不再变化，此时溶液达到最佳ph值（如图10所示）。
蛋白最佳标记量的确定
向6个1.5mlep管中均加入1ml胶体金溶液，将胶体金溶液调至最佳ph值，向ep管内依次加入0、2、4、6、8、10μl的spa蛋白并混匀，室温放置30min后，向每管加入100μl的10%nacl，静置1h后，观察颜色变化。结果显示加入spa蛋白量为5μg时，颜色不再变化，在此基础上多加20%为最佳标记量，即6μg为spa蛋白的最佳标记量（如图11所示）。
金标抗体的制备和鉴定
（1）根据确定好的最佳k2co3量将胶体金溶液调至最佳ph值，并加入最佳spa蛋白标记量进行标记；
（2）每管加入100μl10%的bsa（0.02mtris-hcl溶解），封闭10-15min；
（3）离心30min,4℃离心机；
（4）弃掉上清，加入10%体积的复溶液进行重悬，4℃保存备用；
（5）通过透射电镜观察。结果显示，标记spa蛋白的金颗粒周围有一圈晕染（如图9所示）。
试纸条的组装
（1）将nc膜贴于pvc底板上（注意保持nc膜的清洁，不可有划痕）；
（2）将金标垫压于nc膜上方2mm处；
（3）将样品垫压于金标垫上方2mm处；
（4）将吸水纸压于nc膜2mm；
（5）裁剪试纸条，每张试纸条宽度为4mm。
检测线（t线）和质控线（c线）最佳包被量的确定
对t线包被的蛋白进行不同浓度进行稀释，观察t线的显色情况，确定t线蛋白最佳包被浓度，结果显示，t线的最佳包被浓度为0.5μg/μl（如图12所示）；
对c线包被的蛋白进行不同浓度进行稀释，观察c线的显色情况，确定c线蛋白最佳包被浓度，结果显示，t线的最佳包被浓度为0.25μg/μl（如图13所示）。
实施例3
胶体金试纸条性能的测定
特异性试验
用组装好的试纸条分别对华支睾吸虫阳性样品（a）、华支睾吸虫阴性样品（b）、东方次睾吸虫阳性样品（c）、肝片吸虫阳性样品（d）、犬弓形虫阳性血清（e）、新孢子虫阳性血清（f）、双腔吸虫阳性血清（g）进行检测，观察检测线是否显色。结果显示，该方法有较好的特异性（如图14所示）。
敏感性试验
在确定检测线和质控线最佳包被浓度的前提下，将华支睾吸虫阳性血清进行倍比稀释，观察各试纸条t线显色情况，判断制备的胶体金试纸条的敏感性；结果显示，敏感性达1:200（如图15所示）。
重复性试验
用三个批次的胶体金试纸条分别对华支睾吸虫阴性血清、阳性血清进行检测，观察检测线颜色变化，判断试纸条的重复性是否良好。结果显示，表明该方法具有良好的重复性（如图16所示）。
保存期试验
按确定的条件进行试纸条的组装，放于室温、4℃、37℃，进行封闭干燥储存。分别在7d、15d、30d、60d后进行试验。观察试纸条显色深浅的变化来确定最佳保存时间。结果显示保存一个月时，显色效果仍理想（如表1所示）。
表1.保存期试验
注：“ ”表示条带特别清晰；“ ”表示条带清晰；“ ”表示条带颜色较淡。
实施例4
实际样品的检测
采集并检测103份犬血清样品检测，显示有11份为阳性血清，阳性率为10.67%。部分样品（如图17所示）。
序列表
<110>吉林大学
<120>一种华支睾吸虫特异抗原val28及医用用途
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>495
<212>dna
<213>华支睾吸虫(clonorchissinensis)
<400>1
tttgtgaagctgcatgatcagggaagggtgagactgcaaaaaggagaagttcttggacag60
ccatgtgctcgcaatatgcccccagtggtatgggacaatgaactggccgaaaaagcccaa120
aaatgggcgagcaagtgccaagcaggccacgactccaattcagaacgcaaaaccaagaaa180
tttgatttggttgggcaaaactgggcaggaggttacgacttgcagggtgctttcaatgca240
tggtttgatgaatatagaaactacaactacgcgaatagaagttgtacgggtgtttgcgga300
cattacactcagattgtatggaacgaaactacacacataggctgcggttttgcccggtgc360
cccagtcaaccatggcgccatgcatttgtttgtaactatgggccagctgggaacatgagg420
atgaggacactaaatggagctatcatagtgctgccaccgtacgaggaatcgtccacgtgt480
ccaggccacttgaag495
<210>2
<211>28
<212>dna
<213>华支睾吸虫(clonorchissinensis)
<400>2
cgcggatcctttgtgaagctgcatgatc28
<210>3
<211>26
<212>dna
<213>华支睾吸虫(clonorchissinensis)
<400>3
cccaagcttcttcaagtggcctggac26
1.一种华支睾吸虫特异抗原基因val28，其基因序列如：seqno.1所示。
2.如权利要求1所述的一种华支睾吸虫特异抗原基因val28的获取方法：包括以下步骤：
根据华支睾吸虫val28的基因序列，设计特异性引物序列如下：
f:cgcggatcctttgtgaagctgcatgatc；
r:cccaagcttcttcaagtggcctggac；
通过聚合酶链式反应扩增出华支睾吸虫val28的目的片段；
利用bamhi和hindiii两种酶对重组质粒pmd-18t-val28进行双酶切鉴定，通过1%琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定，构建pmd-18t-val28克隆载体；
利用bamhi和hindiii两种酶对重组质粒pet-28a-val28进行双酶切鉴定，通过1%琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定，构建pet-28a-val28表达载体；
将pet-28a菌液和测序成功的重组表达载体pet-28a-val28菌液分别培养于lb培养基，待其生长至od600=0.6时，加入千分之一的iptg诱导5h，完成表达并进行纯化，然后经sds-page分析完成蛋白的鉴定。
3.利用权利要求1所述的华支睾吸虫特异抗原基因val28制备的一种检测华支睾吸虫感染的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：
通过对华支睾吸虫val28进行蛋白纯化，利用柠檬酸三钠还原法烧制胶体金溶液，然后对胶体金溶液的ph及spa蛋白的标记量等条件进行确定，将样品垫、硝酸纤维素膜（nc膜）、金标垫、pvc底板、吸水纸等进行组装，对组装好的试纸条的检测线（华支睾吸虫val28蛋白）和质控线（兔抗spa蛋白）的最佳包被量进行确定，即得。
技术总结