本发明属于水产科学和基因工程
技术领域：
，更具体地，涉及企鹅珍珠贝tyr基因的启动子及其应用。
背景技术：
：企鹅珍珠贝(pteriapenguin)是一种用于培育大型海水珍珠的优质母贝，其所产天然珍珠以古铜色或蓝绿色为主。企鹅珍珠贝中的黑色素含量丰富，调控减少企鹅珍珠贝黑色素的含量，有望优化其珍珠质色泽，生产业界推崇的金色系列珍珠和彩虹珍珠，突破我国海水珍珠品质较低、色泽单一的产业瓶颈，而珍珠质色泽形成机制的研究是色泽调控的前提条件。企鹅珍珠贝的黑色素合成具有复杂的信号通路，其中酪氨酸酶(tyrosinase，tyr)是关键的限速酶，对黑色素的合成起决定性作用，其表达量可影响黑色素含量。tyr可能受多个转录因子调控，tyr转录因子可通过调控tyr表达进而调控黑色素的合成，因此，对tyr转录因子的筛选鉴定是构建企鹅珍珠贝黑色素合成信号通路，实现对黑色素合成进行调控的重要部分。中国专利cn110184323a公开了一种香蕉水通道蛋白基因启动子转录因子的鉴定方法，但目前尚无可用于筛选鉴定企鹅珍珠贝tyr转录因子的启动子及质粒，这严重阻碍了tyr转录因子的鉴定和信号通路的构建。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供企鹅珍珠贝tyr基因的启动子及其应用。本发明的第一个目的是提供一种企鹅珍珠贝tyr基因的启动子。本发明的第二个目的是提供一种鉴定企鹅珍珠贝tyr转录因子的方法。本发明的第三个目的是提供企鹅珍珠贝tyr基因的启动子在鉴定tyr转录因子中的应用。本发明上述目的通过以下技术方案实现：本发明首先通过构建企鹅珍珠贝基因组walker文库，克隆tyr启动子区域序列并分析，获得启动子序列。然后通过构建tyr启动子驱动的荧光素酶报告基因重组载体，将构建的重组载体转染至293t细胞系，对获得的启动子序列的功能进行验证，结果表明所得启动子为tyr强启动子。因此，本发明申请保护以下内容：一种企鹅珍珠贝tyr基因的启动子，其序列如seqidno.1所示。一种重组载体，其载体中含有seqidno.1所示序列。一种重组细胞系，其含有上述重组载体。优选地，所述重组载体的表达载体为pgl3-basic荧光素报告基因载体。优选地，所述细胞系为293t细胞系。通过将本发明所构建的tyr-promoter-luc重组载体与含待鉴定转录因子基因序列的表达载体共转染293t细胞系，测定细胞中荧光素酶活性的方法，可以确定企鹅珍珠贝的其它黑色素相关基因是否为黑色素合成关键基因tyr的转录因子。因此，本发明还申请保护所述启动子，所述重组载体，所述重组细胞系在鉴定企鹅珍珠贝tyr转录因子中的应用。本发明还提供了一种鉴定企鹅珍珠贝tyr转录因子的方法，其包含以下步骤：s1.构建目的基因重组载体；s2.将步骤s1所得载体与上述重组载体共同转染细胞，收集细胞进行双荧光素酶报告分析；s3.若过表达目的基因的细胞的荧光素酶活性高于对照，则表明所鉴定的目的基因为企鹅珍珠贝tyr转录因子。优选地，步骤s1所述表达载体为pcdna3.1。优选地，步骤s2所述细胞为293t细胞系。优选地，步骤s3结果判定中以pcdna3.1和权利要求2所述重组载体共转染的293t细胞系作为阴性对照。本发明具有以下有益效果：本发明首先提供了一种企鹅珍珠贝tyr基因的启动子，以及tyr启动子驱动的荧光素酶报告基因重组载体和重组293t细胞系。在此基础上，还提供了一种鉴定企鹅珍珠贝tyr转录因子的方法。通过将构建的tyr-promoter-luc重组载体与含待鉴定转录因子基因序列的表达载体共转染293t细胞系，测定细胞中荧光素酶活性的方法，可以确定企鹅珍珠贝的其它黑色素相关基因是否为黑色素合成关键基因tyr的转录因子。本发明克服了尚未有用于筛选鉴定企鹅珍珠贝tyr转录因子的启动子及质粒的缺陷，对tyr转录因子的鉴定和企鹅珍珠贝的黑色素合成信号通路的构建具有重要意义。附图说明图1为tyr基因的启动子序列分析结果图2为实施例3和实施例4中双荧光素酶活性检测结果。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1启动子的扩增本发明首先利用omega公司的e.z.n.a.组织dna试剂盒，从企鹅珍珠贝中提取基因组dna构建基因组walker文库，dna提取步骤参照试剂盒说明书进行。接着使用takara公司的genomewalkerkit试剂盒来克隆tyr的启动子区域。本发明设计了三个引物(tyr-sp1、tyr-sp2和tyr-sp3)来扩增tyr启动子的单个dna片段，并使用tyr-pro-f和tyr-pro-r验证扩增的得到的序列，序列如表1所示。表1克隆tyr启动子区域所用引物引物序列(5’-3’)用途tyr-sp1cagtatagttaagtctgtactgc基因组步移tyr-sp2gtagatatttgcaggtatgaaag基因组步移tyr-sp3gatctgtgagagatataaacttc基因组步移tyr-pro-fgaagagctcaagacagaatg启动子验证tyr-pro-rcagtatagttaagtctgtactgc启动子验证tyr-pro-luc-fcttgctagcactaatgggactctagcagg荧光素酶活性分析tyr-pro-luc-rcgcaagcttaatcaaattcctaaagcact荧光素酶活性分析mitf-fatgatgcaggactctggaatc基因扩增mitf-rtaatcacagcaaatcgttcga基因扩增pcr的扩增体系如表2所示。其中，tyr-sp1/2/3分别是三次pcr的下游引物，ap1(随机简并引物)为上游引物。表2基因启动子扩增的pcr体系(50μl)组成体积基因组dna模板5μldntpmixture(2.5mmeach)8μl10×lapcrbufferii(mg2 plus)5μltakaralataq(5u/μl)0.5μltyr-sp1/tyr-sp2/tyr-sp3primer1μlap1primer(100pmol/μl)1μl灭菌水29.5μl第一轮巢式pcr扩增程序为：94℃预变性1min；94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸2min30s，进行5个反应循环；94℃变性30s，25℃退火3min，72℃延伸2min30s；94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸2min30s，94℃变性30s，44℃退火1min，72℃延伸2min30s，进行15个反应循环；72℃延伸10min。第二轮和第三轮巢式pcr均使用前一轮pcr反应液作为dna模板，分别使用tyr-sp2primer和tyr-sp3primer作为下游引物。两轮巢式pcr扩增程序均为：94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸2min30s，94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸2min30s，94℃变性30s，44℃退火1min，72℃延伸2min30s，进行15个反应循环；72℃延伸10min。pcr扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳分离，得到大小为2100bp左右的条带。使用takara公司的pmd-18t载体，将扩增产物于载体按照下表中的连接体系混合，16℃反应30min，连接产物用上海生工公司的大肠杆菌dh5α感受态细胞进行转化。表3tyr启动子与pmd-18t载体连接体系取出-80℃保存的感受态大肠杆菌，立即静置于冰中；将全量连接产物加入100μl感受态细胞轻轻混匀，冰上静置30min；42℃热激45s，然后冰上放置1min；加入900μl的lb液体培养基(不含抗生素)，37℃150rpm振荡培养1～1.5h；培养结束后5000rpm离心3min，弃上清，用100μllb液体培养基重悬浮菌体。将重悬液涂于含氨苄青霉素抗性的lb平板上，37℃倒置培养12～20h。选取单菌落，用tyr-pro-f和tyr-pro-r引物进行菌落pcr鉴定，提取鉴定合格的菌液中的重组载体，并对所得tyr-promoter-pmd-18t重组载体进行测序。测序结果表明得到了起始密码子(atg)上游1959bp的基因组序列。tyr基因的转录起始位点位于atg上游16bp处，被指定为 1位。转录起始位点上游的1943bp序列被认为是一个推测的启动子。启动子序列分析结果如图1所示，结果显示，bhlh-lz转录因子识别的两个典型的e-box(catgtg)元件分别位于第1767位～1762和第1613～1608位的位置。此外，酪氨酸酶启动子含有6个假定的camp反应元件(cre)和3个假定的活化蛋白2(ap-2)结合位点。实施例2tyr启动子-luciferase重组载体的构建为验证所得tyr启动子的功能，本发明构建了tyr启动子驱动的荧光素酶报告基因重组载体(tyr启动子-luc)。使用tyr-pro-luc-f和tyr-pro-luc-r引物将tyr完整启动子序列扩增出来，启动子序列5’端的酶切位点为mluⅰ，3’端的酶切位点为nheⅰ，使用pgl3-basic载体，将tyr启动子序列和pgl3-basic载体同时酶切后，回收酶切后片段。使用takara公司的pgl3-basic载体，按照表3中的连接体系混合，50℃水浴连接15min，连接产物用上海生工公司的大肠杆菌dh5α感受态细胞进行转化。表4tyr启动子与pgl3-basic载体连接体系取出-80℃保存的感受态大肠杆菌，立即静置于冰中；将适量体积的连接产物(每100μl感受态细胞加入50ngdna，体积不超过感受态细胞体积的5％)与感受态细胞轻轻混匀，冰上静置20min；42℃热激90s，然后冰上放置2～3min；加入900μl的lb液体培养基(不含抗生素)，37℃150rpm振荡培养1～1.5h；培养结束后5000rpm离心3min，弃上清，用100μllb液体培养基重悬浮菌体。将重悬液涂于含氨苄青霉素抗性的lb平板上，37℃倒置培养12～20h。选取单菌落，用引物tyr-pro-luc-f和tyr-pro-luc-r进行菌落pcr鉴定，提取鉴定合格的菌液中的重组载体，并对所得tyr-promoter-luc重组载体进行测序，测序结果表明，获得的重组表达载体中tyr启动子序列正确。实施例3293t细胞中luciferase的表达利用双荧光素酶报告子法测定pptyr启动子的活性。首先取293t细胞在添加有10％胎牛血清(fcs)的dmem培养基中37℃培养，然后将0.4μg的tyr-promoter-luc重组载体和0.04μg的prl-cmv载体与1μl的lipofectamine2000(invitrogen)混合，在24孔板中转染入细胞，同时转染pgl3-basic空载体和prl-cmv载体作为阴性对照。48h后，收集细胞并使用双荧光素酶报告分析系统(promega)进行裂解，具体操作步骤参照系统说明书进行，荧光强度用junior-lb9509光度计测定，荧光素酶活性以萤火虫荧光与renilla荧光的相对光单位(rlu)表示。荧光素酶活性检测结果如图2所示，转染pgl3-basic空载体的细胞显示低水平的荧光素酶活性，而转染tyr-promoter-luc重组载体的细胞显示高荧光素酶活性，表明这是一个强启动子。实施例4tyr转录因子的鉴定下面以鉴定mitf是否为tyr转录因子为例，说明tyr启动子在鉴定tyr转录因子中的应用。以企鹅珍珠贝总rna逆转录所得cdna为模板，用引物mitf-f和mitf-r扩增mitf序列。然后将扩增所得目的片段与质粒pcdna3.1连接，构建mitf-pcdna3.1重组表达载体。mitf序列的上游酶切位点为nheⅰ，下游酶切位点为ecorⅰ。随后将mitf-pcdna3.1重组载体和tyr-promoter-luc重组载体共转染进293t细胞系，另外将pcdna3.1和tyr-promoter-luc重组载体共转染进293t细胞系作为阴性对照。48h后，收集细胞并使用双荧光素酶报告分析系统进行裂解。检测双荧光素酶的试剂和方法同实施例3。荧光素酶活性检测结果如图2所示，过表达mitf-pcdna3.1的细胞表现出高荧光素酶活性，是pcdna3.1阴性对照细胞的3.02倍，显著高于pcdna3.1细胞荧光素酶活性(p<0.05)。这说明mitf对tyr具有明显的调控作用，证实mitf是tyr的上游转录因子，能激活tyr的表达。使用类似的方法，可以鉴定企鹅珍珠贝的其它黑色素相关基因是否为黑色素合成关键基因tyr的转录因子。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<120>企鹅珍珠贝tyr基因的启动子及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1943<212>dna<213>企鹅珍珠贝(pteriapenguin)<400>1actaatgggactctagcaggattcgaactcggacattcccgaatctaacacttggaccac60agtaaggcttaacttcagtaacattcgtttttgatcacatgaaacagtgttatacagggt120gtttttcatatatttattcattatcataatacaattatgagcatgaatatgaagtacatg180tgtatatacattcaaagttttcatactctcttgtgttctagaatttaacttttgtcacaa240aaacggtggtgttataatctttttgaaagttttactcttcagtaacgttatccaattgtc300ccataagacttaaagctgtcgtaaatgtcccatgtgttttgtttctgtttgaatttaaga360taatcttgtttccactaactaacctatgtataagagggatggacctaatgatgtatagtc420ctcatttaatgaattgtcattgtccgtgaatccactctagcactttgttgttagtgccat480tatcgttggacaccgcttacttttgtattttacattgtataatttaacatacgttgagat540ttactaagacggtttcggtctttgcaatctttggcggcgagcaagatttctgaaatcatc600acataacccgaggtcgtcgttagatatctgacactgcattgagttcaatgttttttgttt660ttttttcgatagagaatttcattatatacacaactatgaaattccagtcagagtgtgcat720accaaatatgaagtttatatctctcacagatcaatagttggcaaaagacacacaaaataa780acaaacagatatgccaaatccaacatgcccccgatctatctataagaattaattattatt840tatcaatacacaagtgcattttcgataattataatgtttgataaagtataactgttgatt900actgcaacatctcgccataaaacccatataaatacatgattatactgttattaatgctac960agaactcagctttacataaagtcgtccccctacattaaggctgagtgaaagttaagtttg1020agaacatattacatttctgacgaattccttaattactatatcattgtcgtttctatacgt1080ctaattcctattattcttatttcttaattgcatttatgttgtgttgtgatgtctaatgag1140ggcataattgttaaattactagttataaccatgcacatttttattgaagagctcaagaca1200gaatgtaaattgtggattcccgaataacatgaacttctcctcggataatcgaaagtaaaa1260tcttgttcgcgacaattattagaattgaacaaaactcgtgcaggaaatctttcatacctg1320caaatatctacgttaatgtgttatcaaatggaattgttttaattggcgatcattgtaaaa1380ctggcctctgaacattacaactggcttaaggaaaaaatagatttagatttagagcagtcg1440acagctcgagaaaacagtctgagagtgtaaaaccatgttgcgaatctgtgtttttttact1500cgccgagacgaaagttcggagatctattgtcatatcctcggtattgttatcgtcatccgt1560agacaaacacgttcacctgaaaaataacttcagaaccattagagacagggctttaatatt1620ttcacatattccttgtgctctcgcttttcattaggtaccaattgttttttaccttatgat1680tttgaagtttgacctacttcttggtcatatcgtaataacagtaagggatagggcttaaat1740atatctttgtgcattccttgtgaaacgacctttccttacgcatcatttttttttttgttt1800tgaccttgaagattgacttatttacaaaaggccttttctatttaaatttgattgccaccg1860gcgagttctgttgtcttctgacaattcttgttacaaatacctattaccgtttcattggta1920acatttacttttattataatatt1943当前第1页1 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技术特征：1.一种企鹅珍珠贝tyr基因的启动子，其特征在于，所述启动子的序列如seqidno.1所示。
2.一种重组载体，其特征在于，所述载体中含有包含权利要求1的启动子序列。
3.根据权利要求2所述重组载体，其特征在于，所述重组载体为pgl3-basic荧光素报告基因载体。
4.一种重组细胞系，其特征在于，所述细胞系中含有权利要求2或3所述重组载体。
5.根据权利要求4所述重组细胞系，其特征在于，所述细胞系为293t细胞系。
6.权利要求1所述启动子，权利要求2或3所述重组载体，权利要求4或5所述重组细胞系在鉴定企鹅珍珠贝tyr转录因子中的应用。
7.一种鉴定企鹅珍珠贝tyr转录因子的方法，其特征在于，包含以下步骤：
s1.构建含待鉴定目的基因的重组载体；
s2.将步骤s1所得载体与权利要求2所述重组载体共同转染细胞，收集细胞进行双荧光素酶报告分析；
s3.结果判定，若过表达目的基因的细胞的荧光素酶活性高于对照，则表明所鉴定的目的基因为企鹅珍珠贝tyr转录因子。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤s1所述表达载体为pcdna3.1。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤s2所述细胞为293t细胞系。
10.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤s3结果判定中以pcdna3.1和权利要求2所述重组载体共转染的293t细胞系作为阴性对照。
技术总结本发明公开了企鹅珍珠贝Tyr基因的启动子及其应用。具体公开了一种企鹅珍珠贝Tyr基因的启动子，以及相应的重组载体和重组293T细胞系。在此基础上，本发明还提供了一种鉴定企鹅珍珠贝Tyr转录因子的方法。通过将构建的Tyr‑promoter‑luc重组载体与含待鉴定转录因子基因序列的表达载体共转染293T细胞系，测定细胞中荧光素酶活性的方法，可以确定企鹅珍珠贝的其它黑色素相关基因是否为黑色素合成关键基因Tyr的转录因子。本发明克服了尚未有用于筛选鉴定企鹅珍珠贝Tyr转录因子的启动子及质粒的缺陷，对Tyr转录因子的鉴定和企鹅珍珠贝的黑色素合成信号通路的构建具有重要意义。
技术研发人员：于非非;曲炳良;钟智明;刘永;余祥勇;王梅芳;陈家宇
受保护的技术使用者：广东海洋大学
技术研发日：2021.05.06
技术公布日：2021.08.03
