本发明涉及水产动物疾病防治技术及环保型抗生素类药物替代品开发领域，具体涉及一种mir-210模拟物、制备方法及作为养殖用抗生素替代品的应用。
背景技术：
病原菌引起的水产养殖病害一直是制约我国水产养殖业发展的核心问题，目前的主要应对策略是使用各类抗生素类药物。由于不规范使用抗生素类药物而导致产生水产养殖强耐药和多耐药致病菌，使得抗生素类药物在水产养殖中呈现使用剂量越来越高、投放种类越来越多等特点。有研究显示，水产养殖产业中投放到水体中的抗生素仅有20%左右为生物所利用，残留的抗生素长期存在于水体中，对水体质量、水域生态多样性以及生物种群的分布与丰度等都会产生深刻而复杂影响，此外，目前水产养殖中所使用的抗生素均为人兽共用药物，其抗生素残留也会对人类的身体健康产生潜在的威胁。因此，开发环保、高效的抗生素类药物替代品是目前推进水产绿色健康养殖的迫切需求之一。
micrornas（mirnas）是一类普遍存在于动植物体内的由21-25个核苷酸组成的内源性小分子非编码rna（non-codingrna），可以通过与靶基因3'非编码序列（3'untranslatedregions，3'utr）中的种子区（seedregion）相结合，使mirna降解或者抑制相关蛋白质的翻译，从而在转录后层面调控靶基因的表达。mirnas模拟物是人工合成的一种小分子化合物，通过模拟机体内源性的mirna来调节靶基因的生物学功能，从而在机体内的多种生命活动中发挥重要调控作用，对环境和人类健康没有影响。在水产动物的病害防治研究中利用mirnas模拟物作为抗生素替代品，从而应用到绿色、健康、无污染的经济水产动物抗菌药物开发中的研究尚未见报道。
技术实现要素：
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种mir-210模拟物、制备方法及作为养殖用抗生素替代品的应用。
本发明的技术解决方案是：一种mir-210模拟物，其特征在于：所述mir-210模拟物的rna序列为5'-ususgugcgugcgacagcgacsusgsas-chol-3'。
一种上述mir-210模拟物的制备方法，依次按照如下步骤进行：
步骤1：利用刺参或海胆成体mir-210的rna序列合成寡核苷酸单链，所述成体mir-210的rna序列如seqidno.1所示；
步骤2：对寡核苷酸单链的3'端进行胆固醇修饰；
步骤3：对寡核苷酸单链的5'端进行两个硫代骨架修饰，对寡核苷酸单链的3'端进行四个硫代骨架修饰，对寡核苷酸单链全链进行甲氧基修饰；
步骤4：纯化产物，获得rna序列为5'-ususgugcgugcgacagcgacsusgsas-chol-3'的mir-210模拟物。
一种上述mir-210模拟物作为养殖用抗生素替代品的应用，是作为养殖刺参用抑制腐皮综合症致病菌药物的应用或作为养殖海胆用抑制红斑病致病菌药物的应用。
本发明是采用刺参或中间球海胆成体的mir-210序列制备mir-210模拟物，体外合成简单、使用方便。尤其是所采用的mir-210与包括人类的其他物种中的mir-210序列不同，不会干扰其他生物正常的基因表达，对生态多样性和人类的健康不会产生影响。通过将mir-210模拟物分别转染进刺参以及海胆的体腔液中，能够显著提高刺参以及海胆的吞噬活性，故mir-210模拟物可替代抗生素发挥抗菌药物的功能，避免使用抗生素而产生的种种弊病。
附图说明
图1是本发明实施例mir-210模拟物的序列结构示意图。
图2是刺参吞噬细胞形态以及吞噬过程示意图。
图3是感染腐皮综合症致病菌灿烂弧菌后转染mir-210模拟物对刺参吞噬细胞吞噬能力的影响实验结果示意图。
图4是感染腐皮综合症致病菌灿烂弧菌后转染mir-210模拟物对刺参吞噬细胞吞噬率的影响实验结果示意图。
图5是中间球海胆吞噬细胞形态以及吞噬过程示意图。
图6是感染红斑病致病弧菌后转染mir-210模拟物对中间球海胆吞噬细胞吞噬能力的影响实验结果示意图。
图7是感染红斑病致病弧菌后转染mir-210模拟物对中间球海胆吞噬细胞吞噬率的影响实验结果示意图。
具体实施方式
本发明的mir-210模拟物的制备方法，依次按照如下步骤进行：
步骤1：利用刺参或海胆成体mir-210的rna序列合成寡核苷酸单链，所述成体mir-210的rna序列如seqidno.1所示；
步骤2：对寡核苷酸单链的3'端进行胆固醇修饰；
步骤3：对寡核苷酸单链的5'端进行两个硫代骨架修饰，对寡核苷酸单链的3'端进行四个硫代骨架修饰，对寡核苷酸单链全链进行甲氧基修饰；
步骤4：利用高效液相色谱法纯化产物，获得rna序列为5'-ususgugcgugcgacagcgacsusgsas-chol-3'的mir-210模拟物，结构如图1所示。
实验：
实验1：mir-210模拟物提高刺参抵抗灿烂弧菌（vibriosplendidus）感染的免疫活性实验
1.mir-210模拟物的转染
将10μlmir-210模拟物、10μllipofetamine2000及80μlpbs均匀混合作为mir-210转染剂，10μl阴性对照、10μllipofetamine2000及80μlpbs均匀混合作为对照，使用针管注射器（1ml量程）从刺参身体侧面分别将mir-210模拟物转染剂及对照注射进刺参体腔内，分别为mir-210转染组及对照组。
2.刺参体腔细胞吞噬活性的测定
（1）刺参体腔细胞中的一类细胞为吞噬细胞，吞噬细胞的吞噬作用是刺参进行细胞免疫的主要策略，在识别、抵御细菌及病毒等外来非己物质中最为活跃，通常以刺参体腔液中吞噬细胞吞噬作用的强弱衡量刺参免疫应答水平的高低。如图2所示，正常情况下，刺参体腔液中的吞噬细胞大致呈圆形，隐约可见细胞核，可以伸出伪足变成各种形状。用吞噬能力和吞噬率这两个指标来指示吞噬活性的强弱，其中吞噬能力以伸出伪足开始向酵母细胞靠近的吞噬细胞数量和吞噬酵母细胞的吞噬细胞数量的总和占吞噬细胞总数的比例来表示，吞噬率以吞噬酵母细胞的吞噬细胞数量占吞噬细胞总数的比例来表示。
（2）酵母悬液的制备：将过滤沉降的海水，用0.45μm醋酸纤维滤膜抽滤后高压灭菌，制备无菌海水；称取20mg食用干酵母，加入200ml无菌海水，3000rpm离心，弃上清；加入无菌海水重悬，离心，弃上清，获得浓度为2mg/ml的酵母悬液；加入刺参自体体腔上清液于室温下调理2h以上，3000rpm离心，弃上清；最后加入10ml酵母悬液，分装于聚乙烯离心管中，于-20℃冰冻贮存，使用前融化。
（3）吞噬能力和吞噬率的计算：在转染24h后，将mir-210转染组和对照组的刺参均浸泡于含有1×107cfu/ml灿烂弧菌（菌株号为d4501）的海水中，分别于浸泡后的第4h和第24h取样，每个采样时间点从每组中随机选取3头个体（n=3），分别收集每个个体的体腔液待用。将5ml的体腔液与等量调理好的酵母悬液混合，在反应后的第30min时抽取50μl混合液观察其吞噬情况并拍照。在光镜下，分别记录处于不同状态下的吞噬细胞的数量并计算吞噬能力及吞噬率，计算公式为：
吞噬能力（%）＝（伸出伪足接近酵母的吞噬细胞总数 吞噬酵母的吞噬细胞总数）／被计数的吞噬细胞总数×100%；
吞噬率（%）＝吞噬酵母的吞噬细胞总数／被计数的吞噬细胞总数×100%。
结果如图4和图5所示：在感染灿烂弧菌的第4h和24h，酵母吞噬实验的结果表明，与转染阴性对照的对照组相比，mir-210转染组中刺参的吞噬细胞的吞噬能力及吞噬率均极显著增强（p<0.01）。其中，在感染灿烂弧菌的第4h时，mir-210转染组中刺参的吞噬细胞的吞噬能力相较于对照组增强了52.82%，吞噬率相较于对照组增强了47.69%（图4）。在感染灿烂弧菌的第24h时，mir-210转染组中刺参的吞噬细胞的吞噬能力相较于对照组增强了36.24%，吞噬率相较于对照组增强了32.45%（图5）。故mir-210模拟物可作为养殖刺参用抑制腐皮综合症致病菌药物。
实验2：mir-210模拟物提高中间球海胆抵抗红斑病致病弧菌（hd-1）感染的免疫活性实验
方法同实验1，区别是以中间球海胆替代刺参，注意注射时从中间球海胆口面的围口膜处注射进体腔中，在转染24h后，将mir-210模拟物转染组和对照组的中间球海胆均浸泡于含有1×104cfu/ml红斑病致病弧菌hd-1（ncbi登录号为mh820372）的海水中。
中间球海胆吞噬细胞形态以及吞噬酵母细胞的过程如图3所示，吞噬活性检测的结果如图6和图7所示：在感染红斑病致病弧菌的第4h和24h，酵母吞噬实验的结果表明，与转染阴性对照的对照组相比，mir-210转染组中中间球海胆的吞噬细胞的吞噬能力及吞噬率均极显著增强（p<0.01）。其中，在感染红斑病致病弧菌的第4h时，mir-210模拟物转染组中，中间球海胆的吞噬细胞的吞噬能力相较于对照组增强了24.16%，吞噬率相较于对照组增强了48.87%（图6）。在感染红斑病致病弧菌的第24h时，mir-210转染组中中间球海胆的吞噬细胞的吞噬能力相较于对照组增强了24.15%，吞噬率相较于对照组增强了32.09%（图7）。故mir-210模拟物作为养殖海胆用抑制红斑病致病菌药物的应用。
序列表
<110>大连海洋大学
<120>mir-210模拟物、制备方法及作为养殖用抗生素替代品的应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>22
<212>rna
<213>micrornas（mirnas）
<400>1
uugugcgugcgacagcgacuga22
1.一种mir-210模拟物，其特征在于：所述mir-210模拟物的rna序列为5'-ususgugcgugcgacagcgacsusgsas-chol-3'。
2.一种如权利要求1所述mir-210模拟物的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
步骤1：利用刺参或海胆成体mir-210的rna序列合成寡核苷酸单链，所述成体mir-210的rna序列如seqidno.1所示；
步骤2：对寡核苷酸单链的3'端进行胆固醇修饰；
步骤3：对寡核苷酸单链的5'端进行两个硫代骨架修饰，对寡核苷酸单链的3'端进行四个硫代骨架修饰，对寡核苷酸单链全链进行甲氧基修饰；
步骤4：纯化产物，获得rna序列为
5'-ususgugcgugcgacagcgacsusgsas-chol-3'的mir-210模拟物。
3.一种权利要求1所述mir-210模拟物作为养殖用抗生素替代品的应用，其特征在于：作为养殖刺参用抑制腐皮综合症致病菌药物的应用或作为养殖海胆用抑制红斑病致病菌药物的应用。
技术总结