本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种单链向导rna(sgrna)在制备治疗宫颈癌等靶向药物上的用途。
背景技术：
目前研究证实癌症的发生发展与表观遗传学的调控密切相关。其中，dna甲基化(dnamethylation)是表观遗传学调控的最重要修饰方式之一,某些抑癌基因启动子区发生甲基化修饰，可降低其转录活性，使基因表达沉默，导致细胞异常增殖而产生恶性肿瘤。因此，dna异常甲基化不仅有望成为识别和诊断疾病的生物标志物，而且靶向dna甲基化进行治疗，重置甲基化失衡状态，调控癌基因转录从而调节影响疾病进展的基因表达，也可为临床研发基于表观遗传学的治疗法提供动力。但是，目前无论基础研究还是临床实践都缺乏特异有效的靶向调控dna甲基化基因表达的工具。虽然，fda(foodanddrugadministration)已批准阿扎胞苷和地西他滨等甲基化酶抑制剂类药物应用于临床，而且这些药物在急性髓系白血病患者也有一定的效果，但常见获得性耐药，且这些药物对实体肿瘤的效果不明显。此外，以上甲基化酶抑制剂类药物仅靶向于dna甲基化转移酶，不能靶向于特定的基因，不可避免的会影响其他基因的甲基化状态及转录水平，使得疗效和安全性更为复杂。
因此，既往制约甲基化基因功能的深入研究和临床转化的主要技术壁垒是缺乏敏感特异的靶向特定基因甲基化的调控工具，而crispr(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，成簇规律间隔短回文重复序列)靶向基因编辑工具的诞生则为解决以上这个技术壁垒带来了曙光。相比于锌指核酸酶(zfns)和类转录激活因子效应物核酸酶(talens)等其他基因调控方法，crispr技术更精确，操作更快捷简便，成本也更低廉。
近年来，pax1和epha7的甲基化异常升高与宫颈癌发生的相关性已被证实，pax1是一种重要的转录因子，参与骨骼发育形成。pax1的基因突变会导致严重的脊柱缺陷。此外,pax1基因甲基化与头颈癌，口腔鳞癌，乳腺癌，卵巢癌也证实有相关性。
epha7基因定位于染色体6q16.1，其基因同源性较高且在人体内广泛分布。epha7受体与其配体结合，参与脊椎动物胚胎的早期发育和轴突导向等许多重要的生理过程，其在中枢神经系统发育、大脑连接处的形成、神经嵴细胞导向以及运动神经轴突形成过程中发挥着关键作用。除了生理方面的作用，epha7基因与肿瘤的发生亦相关，但其基因表达呈现组织特异性，如在肝细胞癌，多形性胶质母细胞瘤，胰腺腺癌，胆囊癌，舌鳞癌及非小细胞肺癌均呈现高表达，与肿瘤的侵袭及预后不良相关。而在胃癌，前列腺癌，结直肠癌，非霍奇金淋巴瘤及口腔鳞癌中均呈现低表达，并与其基因启动子的dna甲基化相关。且该基因甲基化程度与癌症的严重程度相关，可做为肿瘤分型的分子标志。
因此，本发明旨在通过crispr技术筛选构建特异的靶向于pax1/epha7基因调控区的sgrna，再结合dcas9-tet1/dmnt3a对宫颈癌细胞系的pax1/epha7基因甲基化进行干扰，从而进一步内源性的调控pax1/epha7基因的转录表达，为临床研发基于表观遗传学的靶向治疗提供思路和工具。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种单链向导rna(sgrna)在制备治疗宫颈癌等靶向药物上的用途。具体涉及一种内源性调控逆转pax1/epha7基因转录表达水平的单链向导rna及其靶序列和用途。
本发明的第一个目的在于,提供一种单链向导rna(singleguiderna，sgrna)在制备调控pax1/epha7基因功能和治疗宫颈癌及与基因功能相关的靶向药物上的用途。
在本发明一实施例中，所述sgrna包括可以靶向激活调控pax1/epha7基因转录表达水平的sgrna，所述激活调控pax1/epha7基因转录表达水平的sgrna基因序列为：seqidno：1～seqidno：6；用于有效降低pax1/epha7基因甲基化水平，激活pax1/epha7基因表达，抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移。与seqidno：1～seqidno：6互补结合的序列为seqidno：7～seqidno：12。
在本发明一实施例中，所述sgrna包括可以靶向抑制pax1/epha7基因转录表达水平的sgrna，所述抑制pax1/epha7基因转录表达水平的sgrna基因序列为：seqidno：13～seqidno：19；用于有效增加pax1/epha7基因甲基化水平，抑制pax1/epha7基因的表达。与seqidno：13～seqidno：19互补结合的序列为seqidno：20～seqidno：26。
本发明的第二个目的在于，提供一种利用所述用途中sgrna的内源性调控逆转pax1和epha7基因甲基化水平及其转录表达水平的方法，所述内源性调控逆转pax1和epha7基因甲基化水平及其转录表达水平的方法包括：
降低基因甲基化水平，激活基因转录表达：
(1)sgrna的设计合成：设计靶向于激活pax1/epha7表达水平的sgrna，序列为seqidno:1-seqidno:6；体外两步pcr合成并纯化；
(2)细胞系构建：将sgrna和去甲基化重组质粒dcas9-tet1(addgene#84475)导入宫颈癌细胞caski，siha；
(3)筛选验证；
增加基因甲基化水平，抑制基因转录表达：
(i)sgrna的设计合成：设计靶向于抑制pax1/epha7表达水平的sgrna，序列为seqidno:13-seqidno:19；体外两步pcr合成并纯化；
(ii)细胞系构建：将sgrna和甲基化重组质粒dcas9-dnmt3a(addgene#84476)导入正常宫颈上皮细胞h8，人胚肾上皮细胞hek293t；
(iii)筛选验证。
在本发明一实施例中，所述步骤(1)sgrna的设计合成方法包括：
(1-1)根据sgrna和基因转录表达的特征，设计靶向于激活pax1/epha7基因表达水平的sgrna，并通过生信网站挑选评分较高的sgrna,包括靶向于激活pax1/epha7转录表达水平的seqidno：1～seqidno：6；
(1-2)sgrna的合成纯化，基于合成的靶向sgrna序列,采用带有u6启动子的u6-sgrna骨架表达重组质粒，通过两步pcr进行完整sgrna的合成，合成后进行纯化，存于-20℃。
所述步骤(i)sgrna的设计合成包括：
(i-1)根据sgrna和基因转录表达的特征，设计靶向于抑制pax1/epha7基因表达水平的sgrna，并通过生信网站挑选评分较高的sgrna,包括靶向于抑制pax1/epha7转录表达水平的seqidno：13～seqidno：19；
(i-2)sgrna的合成纯化，基于合成的靶向sgrna序列,采用带有u6启动子的u6-sgrna骨架表达重组质粒，通过两步pcr进行完整sgrna的合成，合成后进行纯化，存于-20℃。
在本发明一实施例中，所述步骤(2)细胞系构建：
(2-1)在宫颈癌细胞系siha和caski共转染sgrna及dcas9-tet1(addgene#84475)降低甲基化水平的质粒工具，比例为1:1，激活pax1/epha7基因转录表达水平；
(2-2)应用的sgrna序列包括3个pax1转录激活的序列，3个epha7基因转录激活的序列；24h后换液，48h后加含博来霉素的培养基进行筛选，4天收细胞；
所述步骤(ii)细胞系构建包括：
(ii-1)在正常宫颈上皮细胞h8和人胚肾上皮细胞hek293t共转染sgrna及dcas9-dmnt3a增加甲基化水平的质粒工具，比例为1:1，抑制pax1/epha7基因转录表达水平；
(ii-2)应用的sgrna序列包括3个pax1转录抑制的序列，4个epha7转录抑制的序列；24h后换液，48h后加含博来霉素的培养基进行筛选，4天收细胞。
在本发明一实施例中，所述步骤(3)筛选验证包括：
(3.1)rt-pcr检测转录水平表达；
(3.2)焦磷酸测序检测基因甲基化水平；
(3.3)调控后宫颈癌细胞生长情况及迁移能力改变；
(3.4)与采用甲基化酶抑制剂(aza)和转录激活重组质粒(dcas9-vp160addgene#48226)两种干扰调控方法比较。
所述步骤(iii)筛选验证包括：
(iii-1)rt-pcr检测转录水平表达；
(iii-2)焦磷酸测序检测基因甲基化水平。
本发明的第三个目的在于,提供一种用于内源性调控逆转pax1和epha7基因甲基化水平及其转录表达水平的试剂盒，包含所述seqidno：1～seqidno：12以及seqidno：13～seqidno：26。
本发明的第四个目的在于,提供一种靶向于调控逆转pax1基因甲基化水平及其转录表达水平的头颈癌，口腔鳞癌，乳腺癌，卵巢癌药物。
本发明的第五个目的在于,提供一种靶向于调控逆转epha7基因甲基化水平及其转录表达水平的胃癌，前列腺癌，结直肠癌，非霍奇金淋巴瘤及口腔鳞癌药物。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：
本发明获得了针对pax1及epha7基因甲基化调控，从而逆转其基因表达水平的有效sgrna序列，并通过重组质粒(sgrna dcas9-tet1/dnmt3a)靶向作用于pax1及epha7基因的调控区域，使其甲基化水平降低/增加，从而内源性调控了pax1和epha7基因的转录表达。
本发明解决上述基因甲基化酶抑制剂等去甲基化药物的非特异性影响,提供一种有效靶向干扰调控pax1/epha7基因表达的sgrna序列及其靶序列，以及相关的检测方法。
本发明通过获得可特异性的降低宫颈癌甲基化基因pax1/epha7基因的甲基化水平方法，以及内源性激活上述基因的转录表达水平得方法，从而抑制了宫颈癌细胞的增殖和迁移。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明sgrna两步pcr合成图，其中，图1a.sgrna合成示意图；图1b.pcr法合成的sgrna的琼脂糖凝胶验证图。
图2是本发明实施例提供的宫颈癌细胞里通过去甲基化重组质粒(dcas9-tet1)与不同的sgrna组合共转染后激活pax1/epha7基因转录表达图。其中，图2a靶向于降低pax1基因甲基化水平后，pax1基因在caski细胞中转录水平的变化图。图2b靶向于降低pax1基因甲基化水平后，pax1基因在siha细胞中转录水平的变化图。图2c靶向于降低epha7基因甲基化后，epha7基因在caski细胞中转录水平的变化图。图2d靶向于降低epha7基因甲基化后，epha7基因在siha细胞中转录水平的变化图
图3是本发明实施例提供的在宫颈癌细胞里通过dcas9-tet1与不同的sgrna组合共转染后降低pax1/epha7基因甲基化水平结果图。其中，图3a焦磷酸测序检测调控后宫颈癌caski细胞中pax1基因甲基化水平改变图。图3b焦磷酸测序检测调控后宫颈癌siha细胞中pax1基因甲基化水平改变图。图3c焦磷酸测序检测调控后宫颈癌caski细胞中epha7基因甲基化水平改变图。图3d焦磷酸测序检测调控后宫颈癌siha细胞中epha7基因甲基化水平改变图。
图4是本发明实施例提供的降低pax1/epha7基因甲基化水平，激活其基因表达的调控后抑制宫颈癌细胞的增殖及迁移能力结果图。其中，图4a激活pax1基因的表达，siha细胞生长受抑制；图4b激活epha7基因表达后，siha细胞生长受抑制。图4c激活pax1基因的表达后，可抑制细胞迁移；图4d激活epha7基因表达后，可抑制细胞迁移。图5是本发明实施例提供的采用去甲基化(dcas9-tet1)逆转pax1基因转录与通过采用转录激活重组质粒(dcas9-vp160)和去甲基化酶抑制剂药物(aza)逆转基因表达水平的比较结果图。
图6本发明实施例提供的在正常细胞里通过dcas9-dnmt3a与不同的sgrna组合共转染后抑制pax1/epha7基因转录表达结果图。其中，图6a靶向于pax1增加甲基化水平后，pax1基因在h8细胞中转录水平的改变图。图6b靶向于pax1增加甲基化水平后，pax1基因在hek293t细胞中转录水平的改变图。图6c靶向于epha7增加基因甲基化后，epha7基因在hek293t细胞中转录水平的改变图。
图7是本发明实施例提供的在正常细胞里通过dcas9-dnmt3a与不同的sgrna组合增加pax1/epha7基因甲基化水平结果图。其中，图7a.焦磷酸测序检测调控后hek293t细胞中pax1基因甲基化水平改变图；图7b焦磷酸测序检测调控后hek293t细胞中epha7基因甲基化水平改变图。
图8是本发明实施例提供的内源性调控逆转pax1和epha7基因甲基化水平及其转录表达水平的方法流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的方案作进一步描述。
本发明提供一种sgrna及受调控的pax1/epha7基因序列在制备靶向调控基因功能和治疗宫颈癌等靶向药物上的用途。
本发明提供的sgrna虽然称为rna，但是是一段单链dna序列(这个序列与基因序列在细胞外是一致的)；而之所以称之为rna序列，是因为，本发明体外通过两步pcr的方法，给这个sgrna前面加了启动子，后面加了rna折叠，这样，这个完整的sgrna进入细胞里就自动形成了rna序列，就可以和目标的靶基因的dna序列结合了。所以，虽然sgrna和单链dna基因的序列一样，但是它们是两个概念。本发明实际上是找到了几段对这个基因的转录调控有活性的区域，但是，要想使这个有活性的区域有功能，就得通过crispr这种sgrna dcas9 效应子的方法。
本发明提供的内源性调控逆转pax1和epha7基因甲基化水平及其转录表达水平的方法(如图8)包括以下内容：
降低基因甲基化水平，激活基因转录表达：
(1)sgrna的设计合成：设计靶向于激活pax1/epha7表达水平的sgrna，序列为seqidno:1-seqidno:6，体外两步pcr合成并纯化；
(2)细胞系构建：将sgrna和重组质粒dcas9-tet1(addgene#84475)导入宫颈癌细胞caski，siha；
(3)筛选验证：(3.1)rt-pcr检测转录水平表达；(3.2)焦磷酸测序检测基因甲基化水平；(3.3)调控后宫颈癌细胞生长情况及迁移能力改变；(3.4)与采用甲基化酶抑制剂(aza)和转录激活重组质粒(dcas9-vp160)两种干扰调控方法比较。
增加基因甲基化水平，抑制基因转录表达：
(i)sgrna的设计合成：设计靶向于抑制pax1/epha7表达水平的sgrna，序列为seqidno:13-seqidno:19,体外两步pcr合成并纯化；
(ii)细胞系构建：将sgrna和重组质粒dcas9-dnmt3a(addgene#84476)导入正常宫颈上皮细胞h8，人胚肾上皮细胞hek293t；
(iii)筛选验证：(iii-1)rt-pcr检测转录水平表达；(iii-2)焦磷酸测序检测基因甲基化水平。
在本发明一实施例中，提供一种可以靶向激活pax1/epha7基因转录表达水平的sgrna及受调控的pax1/epha7基因序列在制备治疗宫颈癌等靶向药物上的用途，sgrna可有效降低pax1/epha7基因甲基化水平，激活其基因表达，抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移，所述激活pax1/epha7基因转录表达水平的sgrna基因序列为：seqidno：1～seqidno：6。
在本发明一实施例中，提供一种可以靶向抑制pax1/epha7基因转录表达水平的sgrna及受调控的pax1/epha7基因序列在制备靶向治疗药物上的用途，sgrna可有效增加pax1/epha7基因甲基化水平，抑制其基因表达，所述抑制pax1/epha7基因转录表达水平的sgrna基因序列为：seqidno：13～seqidno：19。
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步描述。
实施例
一、降低基因甲基化水平，激活基因转录表达：
(一)sgrna的设计合成
1.sgrna的设计
根据sgrna的设计原则，在pax1/epha7启动子区域共设计了6个可激活基因表达的sgrna，序列如下，
2.sgrna的合成纯化
基于合成的sgrna序列,采用带有u6启动子的u6-sgrna骨架表达重组质粒，通过两步pcr进行完整sgrna的合成(图1a)，合成后进行纯化，并通过琼脂糖凝胶验证sgrna的质量(图1b)，存于-20℃。
(二)细胞系的构建
提前一天将处于对数生长期的宫颈癌细胞系caski及siha细胞接种于6孔板中，密度达到75-80％时进行转染。
将2μg重组质粒dcas9-tet1(addgene#84475)，2μgsgrna(激活pax1-sgrna1(seqidno:1)，2(seqidno:2)，3(seqidno:3)单独或组合(seqidno:1～seqidno:3)；激活epha7-sgrna1(seqidno:4),2(seqidno:5)，3(seqidno:6)单独或组合(seqidno:4～seqidno:6))和12μlomnifect的转染试剂分别用250μlopti-mem进行稀释，静置5分钟后将其混匀，室温静置15分钟后均匀加至细胞中，轻轻摇匀，48h后用含博来霉素(zeocin)的培养基进行筛选，4天后收集细胞。
(三)筛选验证sgrna
1.调控后pax1和epha7基因转录水平的改变
(1.1)提取总rna
收取的细胞加1mltrizol提取总rna，冰上静置5min后加200ul核酸提取液进行萃取，充分混匀后静置3min，12000rpm，4℃离心15min，将上清与等体积的异丙醇混合后，静置15min，12000rpm,4℃离心10min，弃上清，用75％的乙醇重悬沉淀后12000rpm,4℃离心5min，将乙醇充分弃掉并晾干，加20ul无酶水溶解后，用nanodrop2000c检测浓度及质量。取1800ngrna，加2ul5xgdna,用无酶水补充为10ul，42℃3min，按照下表体系配制反转录体系混合液，充分混匀后，每孔加10ul，42℃，孵育15min，95℃，孵育3min。
表2.逆转录pcr反应体系
(1.2)荧光定量pcr
进行荧光定量pcr检测调控后pax1基因和epha7基因表达水平的改变，引物如下：seqidno:27
pax1-mrna-f：gctcgctatggagcagacg；
pax1-mrna-r：agctgccgactgatgtcac。
seqidno:28
epha7-mrna-f:cagattcgggcttttactgc；
epha7-mrna-r:agccaaagaccatgaacacc。
seqidno:29
gapdh-mrna-f：gaaatcccatcaccatcttccagg；
gapdh-mrna-r:gagccccagccttctccatg。
表3.荧光定量pcr反应体系
pcr循环反应条件95℃15分钟；95℃,20s,60℃,20s,72℃,20秒，50个循环。
(1.3)结果
在caski和siha细胞系中，pax1基因的sgrna1,2,3组均具有激活基因转录表达的作用(图2a，b)，其中，sgrna2组效果最明显，在caski细胞系中，sgrna2的实验组相对于对照组pax1基因的转录水平上调了35.95倍(图2a)，在siha细胞系中上调了19.62倍(图2b)。
而epha7基因在caski细胞系中sgrna1，3组有激活基因表达的作用，其中sgrna1组的效果较稳定，其基因的转录表达水平上调了2.92倍，在siha细胞系中sgrna1，2组有激活基因表达的作用，其中sgrna1组的效果明显优于其它组，其基因的转录表达水平上调了7.4倍(图2c,d)。
2.调控后pax1和epha7基因甲基化水平改变
(2.1)dna提取及重亚硫酸盐处理
收取的细胞用1mlpbs重悬后，4℃，14000离心1min后,加555ul配制好的dna裂解液(500ultne,5ul20mg/ml蛋白酶k，50ul10％sds)，混匀后56℃孵育12-16h，加入预热好的186ul6mnacl混匀，加736ul氯仿，震荡45min后4℃，12000rpm，离心15min，收上清在新管中，加736ul异丙醇，-20℃放置2h,4℃，15000rpm，离心30min,弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，4℃，15000rpm，离心5min，弃多于液体晾干，加30ulte室温溶解dna，检测浓度及质量。采用ezdnamethylationtmkit试剂盒(美国zymoresearch公司)对提取的基因组dna进行重亚硫酸盐转化，取1μg样本dna，采用试剂盒中的稀释缓冲液(dilutionbuffer)变性样本dna，加入“ct”碱基转换试剂(ctconversionreagent)，过夜孵育，将样品和结合缓冲液(bindingbuffer)一起加入试剂盒中的dna吸附柱，离心，洗涤柱子，再加入脱硫缓冲液(desulphonationbuffer)，然后再经洗涤缓冲液清洗柱子两次，最后用洗脱液洗脱dna吸附柱上的dna，收集洗脱的经重亚硫酸盐转化的dna(bs-dna)，存于-20℃。
(2.2)焦磷酸测序：pcr扩增及测序引物采用pyromarkassaydesignsoftware2.0设计，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，扩增引物如下:
表4.焦磷酸测序pcr引物
优化后进行扩增，体系及条件如下
pcr循环反应条件95℃15分钟；94℃,30s,56℃,30s,72℃,30s,40个循环；72℃10分钟。
产物按照pyromarkq24焦磷酸测序仪中甲基化分析要求进行测序。采用pyromarkq24(version2.0.6)program设计焦磷酸测序的cpg实验，将模板序列输入程序，按软件说明设定仪器(pyromarkq24)运行模拟程序。
(2.3)结果
在宫颈癌caski细胞系中，在pax1基因转录激活水平最高的sgrna2组其基因各位点甲基化水平与总体均值水平均明显下降，实验组(57.67％)比对照组(79.87％)的平均甲基化水平下降了22.21％(图3a,表6)，在siha细胞系中，sgrna2组pax1基因启动子甲基化水平亦下降，其实验组(67.71％)比对照组(79.95％)的平均甲基化水平下降了12.25％(图3b,表7)。
同样，epha7基因各位点甲基化水平与总体均值水平亦有明显下降，在caski细胞中，sgrna1组的epha7基因启动子的平均甲基化水平下降了19.10％(图3c,表8)，在siha细胞中下降了17.23％(图3d,表9)。
表6pax1基因在caski细胞中各位点的甲基化定量百分比(％)
表7pax1基因在siha细胞中各位点的甲基化定量百分比(％)
表8epha7基因在caski细胞中各位点的甲基化定量百分比(％)
表9epha7基因在siha细胞中各位点的甲基化定量百分比(％)
3.调控后宫颈癌细胞生长情况和迁移能力改变
实施方案
(3.1)细胞增殖曲线
将1×10^5个宫颈癌siha细胞接种于24孔板，实验组(dcas9-tet1(addgene#84475))与对照组均铺15孔(每组3个复孔，共计5天)，将靶向于pax1的sgrna组合和靶向于epha7的sgrna组合分别等比例与dcas9-tet1(addgene#84475)共转染到实验组的宫颈癌siha细胞，24h后开始进行消化计数，每天每组消化3孔每隔24h计数细胞数量。
(3.2)迁移实验
提前一天将处于对数生长期的siha细胞接种于6孔板中，密度达到70％时，将靶向于pax1的sgrna组合和靶向于epha7的sgrna组合分别等比例与dcas9-tet1(addgene#84475)共转染到siha细胞系中，24h后进行划痕，并换用含1％血清的培养基，分别在0h，6h，24h，48h拍照记录划痕宽度。
(3.3)结果
采用graphad统计连续计算5天的细胞数量后发现，内源性激活pax1基因后siha细胞生长受抑制；同理，相对于对照组细胞，激活epha7基因表达后，其生长明显受到抑制(图4a,b)。
划痕实验结果显示，激活pax1/epha7基因的转录表达后48h，调控激活实验组与对照组的划痕宽度出现明显差异(图4c,d)。以上这些结果表明内源性激活pax1/epha7基因转录后，可有效的抑制宫颈癌细胞siha的生长和迁移能力。
4.采用去甲基化重组质粒(dcas9-tet1)调控与采用甲基化酶抑制剂(aza)和转录激活重组质粒(dcas9-vp160)两种干扰调控方法比较。
(4.1)甲基化酶抑制剂(aza)调控
将处于对数生长期的caski细胞接种于12孔板中，24小时后密度达到75％-85％，用2.5μm的去甲基化药物进行干扰，4天后收取细胞，提取rna，逆转后通过荧光定量pcr检测pax1基因转录水平。
(4.2)转录激活重组质粒(dcas9-vp160)调控
将处于对数生长期的caski细胞接种于6孔板中，24小时后密度达到75％-85％，将pax1激活的sgrna2(seqidno:2)2μg，与转录激活子(dcas9-vp160，addgene#48226)共转染到caski细胞中，48h后用含嘌呤霉素的培养基进行筛选，4天后收取细胞，提取rna，逆转后通过荧光定量pcr检测pax1基因转录水平。
(4.3)去甲基化重组质粒(dcas9-tet1)调控
将处于对数生长期的caski细胞接种于6孔板中，24小时后密度达到75％-85％，将pax1激活的sgrna2(seqidno:2)2μg，与重组质粒dcas9-tet1(addgene#84475)共转染到caski细胞中，48h后用含博来霉素的培养基进行筛选，4天后收取细胞，提取rna，逆转后通过荧光定量pcr检测pax1基因转录。
(4.4)结果
在caski细胞系中，采用sgrna与去甲基化重组质粒(dcas9-tet1addgene#84475)结合调控降低pax1基因甲基化水平，激活其转录表达水平的效果明显优于另外两组，其激活基因转录表达的水平是直接转录激活组的14.52倍，是aza药物的92.23倍(图5)。
二、增加基因甲基化水平，抑制基因转录表达
(一)sgrna的设计合成
根据sgrna的设计原则，在第一外显子区域设计了3个抑制pax1基因转录的sgrna，4个抑制epha7基因转录的sgrna，序列如下，
2.sgrna的合成纯化
基于合成的sgrna序列,采用带有u6启动子的u6-sgrna骨架表达重组质粒，通过两步pcr进行完整sgrna的合成(图1a)，合成后进行纯化，并通过琼脂糖凝胶验证sgrna的质量(图1b)，存于-20℃。
(二)细胞系的构建
提前一天将处于对数生长期的宫颈正常细胞h8和人胚肾上皮细胞hek293t细胞接种于6孔板中，密度达到75-80％时进行转染，2μg重组质粒dcas9-dnmt3a(addgene#84476)，2μgsgrna(抑制pax1-sgrna1(seqidno:13)，2(seqidno:14)，3(seqidno:15),单独或组合(seqidno:13～no:15)；抑制epha7sgrna:1(seqidno:16)；2(seqidno:17)，3(seqidno:18),4(seqidno:19)单独或组合(seqidno:16～no:19)和12μlomnifect的转染试剂分别用250μlopti-mem进行稀释，静置5分钟后将其混匀，室温静置15分钟后均匀加至细胞中，轻轻摇匀，48h后用含博来霉素(zeocin)的培养基进行筛选，4天后收集细胞。
(三)筛选验证sgrna
1.调控后pax1/epha7基因转录水平的改变
(1.1)总rna的提取及逆转
收取的细胞加1mltrizol提取总rna，冰上静置5min后加200ul核酸提取液进行萃取，充分混匀后静置3min，12000rpm，4℃离心15min，将上清与等体积的异丙醇混合后，静置15min，12000rpm,4℃离心10min，弃上清，用75％的乙醇重悬沉淀后12000rpm,4℃离心5min，将乙醇充分弃掉并晾干，加20ul无酶水溶解后，用nanodrop2000c检测浓度及质量。取1800ngrna，加2ul5xgdna,用无酶水补充为10ul，42℃3min，按照表2体系配制反转录体系混合液，充分混匀后，每孔加10ul，42℃，孵育15min，95℃，孵育3min。
(1.2)荧光定量pcr
按照表3体系进行荧光定量pcr检测调控后pax1基因和epha7基因表达水平的改变，引物同前，如下：
seqidno:27
pax1-mrna-f：gctcgctatggagcagacg；
pax1-mrna-r：agctgccgactgatgtcac。
seqidno:28
epha7-mrna-f:cagattcgggcttttactgc；
epha7-mrna-r:agccaaagaccatgaacacc。
seqidno:29
gapdh-mrna-f：gaaatcccatcaccatcttccagg；
gapdh-mrna-r:gagccccagccttctccatg。
pcr循环反应条件95℃15分钟；95℃,20s,60℃,20s,72℃,20秒，50个循环。
(1.3)结果
在宫颈上皮细胞h8中，pax1基因加甲基的3个sgrna均可以起到抑制其转录表达的作用，其中sgrna2的效果最明显，pax1基因的转录水平下降了67.61％(图6a)。在人胚肾上皮细胞hek293t细胞系中，pax1基因加甲基的sgrna1,2可以起到抑制其转录表达的作用，其中sgrna2的效果最明显，下降了63.88％(图6b)
在人胚肾上皮细胞hek293t细胞中，4个sgrna均可以起到增加epha7基因甲基化水平，下调其转录表达的作用，相对于对照组sgrna2对epha7下调较明显，下调了72.75％(图6c)。
2.调控后pax1/epha7基因甲基化水平的状态
(2.1)dna提取及重亚硫酸盐处理
收取的细胞用1mlpbs重悬后，4℃，14000离心1min后,加555ul配制好的dna裂解液(500ultne,5ul20mg/ml蛋白酶k，50ul10％sds)，混匀后56℃孵育12-16h，加入预热好的186ul6mnacl混匀，加736ul氯仿，震荡45min后4℃，12000rpm，离心15min，收上清在新管中，加736ul异丙醇，-20℃放置2h,4℃，15000rpm，离心30min,弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，4℃，15000rpm，离心5min，弃多于液体晾干，加30ulte室温溶解dna，检测浓度及质量。采用ezdnamethylationtmkit试剂盒(美国zymoresearch公司)对提取的基因组dna进行重亚硫酸盐转化，取1μg样本dna，采用试剂盒中的稀释缓冲液(dilutionbuffer)变性样本dna，加入“ct”碱基转换试剂(ctconversionreagent)，过夜孵育，将样品和结合缓冲液(bindingbuffer)一起加入试剂盒中的dna吸附柱，离心，洗涤柱子，再加入脱硫缓冲液(desulphonationbuffer)，然后再经洗涤缓冲液清洗柱子两次，最后用洗脱液洗脱dna吸附柱上的dna，收集洗脱的经重亚硫酸盐转化的dna(bs-dna)，存于-20℃。
(2)焦磷酸测序：pcr扩增及测序引物采pyromarkassaydesignsoftware2.0设计，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，扩增引物如下:
表4.焦磷酸测序pcr引物
优化后进行扩增，体系及条件同表5。pcr循环反应条件：95℃15分钟；94℃,30s,56℃,30s,72℃,30s,40个循环；72℃10分钟。产物按照pyromarkq24焦磷酸测序仪中甲基化分析要求进行测序。采用pyromarkq24(version2.0.6)program设计焦磷酸测序的cpg实验，将模板序列输入程序，按软件说明设定仪器(pyromarkq24)运行模拟程序。
(2)结果：在人胚肾上皮细胞hek293t细胞系中，pax1基因甲基化水平在sgrna2实验组(42.44％)比对照组(17.10％)增加了25.33％(图7a,表10)，而epha7基因甲基化在sgrna2实验组(26.92％)比对照组(3.25％)增加了23.67％(图7b,表11)。
表10pax1基因在hek293t细胞各位点的甲基化定量百分比(％)
表11epha7基因在hek293t细胞各位点的甲基化定量百分比(％)
应当理解的是，本公开并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本公开的范围应由所附的权利要求来限制。
序列表
<110>天津医科大学
<120>单链向导rna在制备治疗宫颈癌等靶向药物上的用途
<160>37
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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gatcccgatctgctgctaag20
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agggaattttggattagtaa20
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>37
aaaaatttaagatttaagataattg25
1.一种单链向导rna(singleguiderna，sgrna)在制备调控pax1/epha7基因功能和治疗宫颈癌及与基因功能相关的靶向药物上的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述sgrna为靶向激活pax1/epha7基因转录表达水平的sgrna；
所述激活pax1/epha7基因转录表达水平的sgrna靶序列为：seqidno：1～seqidno：6；用于有效降低pax1/epha7基因甲基化水平，激活pax1/epha7基因表达，抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移；与seqidno：1～seqidno：6互补结合的序列为seqidno：7～seqidno：12。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述sgrna为靶向抑制pax1/epha7基因转录表达水平的sgrna；
所述抑制pax1/epha7基因转录表达水平的sgrna基因序列为：seqidno：13～seqidno：19；用于有效增加pax1/epha7基因甲基化水平，抑制pax1/epha7基因的表达；与seqidno：13～seqidno：19互补结合的序列为seqidno：20～seqidno：26。
4.一种利用权利要求1所述用途中sgrna的内源性调控逆转pax1和epha7基因甲基化水平及其转录表达水平的方法，其特征在于，所述内源性调控逆转pax1和epha7基因甲基化水平及其转录表达水平的方法包括：
降低基因甲基化水平，激活基因转录表达：
(1)sgrna的设计合成：设计靶向于激活pax1/epha7表达水平的sgrna，序列为seqidno:1-seqidno:6；体外两步pcr合成并纯化；
(2)细胞系构建：将sgrna和去甲基化重组质粒dcas9-tet1(addgene#84475)导入宫颈癌细胞caski，siha；
(3)筛选验证；
增加基因甲基化水平，抑制基因转录表达：
(i)sgrna的设计合成：设计靶向于抑制pax1/epha7表达水平的sgrna，序列为seqidno:13-seqidno:19,体外两步pcr合成并纯化；
(ii)细胞系构建：将sgrna和甲基化重组质粒dcas9-dnmt3a(addgene#84476)导入正常宫颈上皮细胞h8，人胚肾上皮细胞hek293t；
(iii)筛选验证。
5.根据权利要求4所述内源性激活pax1和epha7基因甲基化水平及其转录表达水平的方法，其特征在于，
所述步骤(1)sgrna的设计合成方法包括：
(1-1)根据sgrna和基因转录表达的特征，设计靶向于激活pax1/epha7基因表达水平的sgrna，并通过生信网站挑选评分较高的sgrna,包括靶向于激活pax1/epha7转录表达水平的seqidno：1～seqidno：6；
(1-2)sgrna的合成纯化，基于合成的靶向sgrna序列,采用带有u6启动子的u6-sgrna骨架表达重组质粒，通过两步pcr进行完整sgrna的合成，合成后进行纯化，存于-20℃；
所述步骤(i)sgrna的设计合成方法包括：
(i-1)根据sgrna和基因转录表达的特征，设计靶向于降低pax1/epha7基因表达水平的sgrna，并通过生信网站挑选评分较高的sgrna,包括靶向于抑制pax1/epha7转录表达水平的seqidno：13～seqidno：19；
(i-2)sgrna的合成纯化，基于合成的靶向sgrna序列,采用带有u6启动子的u6-sgrna骨架表达重组质粒，通过两步pcr进行完整sgrna的合成，合成后进行纯化，存于-20℃。
6.根据权利要求4所述内源性调控逆转pax1和epha7基因甲基化水平及其转录表达水平的方法，其特征在于，
所述步骤(2)细胞系构建：
(2-1)在宫颈癌细胞系siha和caski转染完整sgrna及dcas9-tet1(addgene#84475)降低甲基化水平的质粒工具，比例为1:1，激活pax1/epha7基因转录表达水平；
(2-2)应用的sgrna序列包括3个pax1转录激活的序列，3个epha7转录激活的序列；24小时后换液，48小时后加含博来霉素(zeocin)的培养基进行筛选，4天收细胞；
所述(ii)细胞系构建包括：
(ii-1)在正常宫颈上皮细胞h8和人胚肾上皮细胞hek293t共转染sgrna及dcas9-dmnt3a增加甲基化水平的质粒工具，比例为1:1，抑制pax1/epha7基因转录表达水平；
(ii-2)应用的sgrna序列包括3个pax1转录抑制的序列，4个epha7转录抑制的序列；24小时后换液，48小时后加含博来霉素的培养基进行筛选，4天收细胞。
7.根据权利要求4所述内源性调控逆转pax1和epha7基因甲基化水平及其转录表达水平的方法，其特征在于，
所述(3)筛选验证包括：
(3.1)rt-pcr检测转录表达水平；
(3.2)焦磷酸测序检测基因甲基化水平；
(3.3)调控后宫颈癌细胞生长情况及迁移能力改变；
(3.4)与采用甲基化酶抑制剂(aza)和转录激活重组质粒(dcas9-vp160)两种干扰调控方法比较；
所述步骤(iii)筛选验证包括：
(iii-1)rt-pcr检测转录表达水平；
(iii-2)焦磷酸测序检测基因甲基化水平。
8.一种用于内源性调控逆转pax1和epha7基因甲基化水平及其转录表达水平的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述seqidno：1～seqidno：12以及权利要求3所述seqidno：13～seqidno：26。
9.一种靶向于调控逆转pax1基因甲基化水平及其转录表达水平的头颈癌，口腔鳞癌，乳腺癌，卵巢癌药物。
10.一种靶向于调控逆转epha7基因甲基化水平及其转录表达水平的胃癌，前列腺癌，结直肠癌，非霍奇金淋巴瘤及口腔鳞癌药物。
技术总结