本发明涉及肿瘤分子生物学领域，更具体地，涉及一种三阴性乳腺癌顺铂耐药诊断用长链非编码rna及其应用。
背景技术：
三阴性乳腺癌(triplenegativebreastcancer，tnbc)是一种特殊的分子亚型乳腺癌，约占乳腺癌患者15％左右。tnbc患者的预后较差，其病理学特点为恶性度高、发病年龄比较早、早期易发生内脏和骨骼等器官转移。tnbc缺少er(雌激素受体)、pr(孕酮受体)和her2(表皮生长因子受体-2基因)的表达，而包括激素治疗等在内的常见乳腺癌治疗方案往往又是针对这两种激素受体与her基因，所以此类疗法对三阴性乳腺癌患者一般无效。目前tnbc的系统治疗仍以化疗为主，但大多数患者很快发生耐药，一旦肿瘤发生转移，生存期通常只有12到15个月。在三阴性乳腺癌的化疗中，顺铂类药物是一种较为常用也较为有效的化疗药物，但如果化疗前或化疗中患者即产生顺铂耐药性，不仅会浪费患者的治疗时间，且随着化疗治疗效果的显著降低，还会直接影响到患者的生存期限，不利于患者生存。虽然能通过试药的方式获取患者的顺铂耐药性，但该方式可能会耗费患者生存期中较长的时间，且一旦在化疗过程中而不是化疗前产生顺铂耐药性，则同样直接影响患者的整体治疗效果。若不清楚是否顺铂耐药，也不利于及时调整治疗方案，不利于提高患者的治疗效果、生存期。所以，亟需一种标志物或标志物的应用以获取三阴性乳腺癌的顺铂耐药性结果，从而方便在治疗前、治疗过程中给予有效的治疗方案，以便提高治疗效果、延长患者生存期。同时，往往该类标志物与耐药性的产生相关，所以，该类标志物的存在也有助于后续进行顺铂耐药逆转的研究，为三阴性乳腺癌顺铂耐药患者的治疗提供新的方向。
brca1/2是两种具有抑制恶性肿瘤发生的优良基因(称为"抑癌基因")，在损伤修复、细胞的正常生长方面有重要作用；如果brca1/2基因的结构发生了某些改变(称为"突变")，那么它所具有的抑制肿瘤发生的功能就会受影响。已发现的brca1/2的突变有数百种之多，除了与遗传性乳腺癌和卵巢癌有关。brca1/2突变肿瘤还可导致三阴性乳腺癌肿瘤细胞对dna双链断裂药物的敏感度较高，诸如顺铂等铂类药物，使铂类药物或可成为有效的治疗药物；即现有技术存在可以预测三阴性乳腺癌顺铂药物治疗有效的检测诊断方法-brca1/2突变。但是，并不说明未发生brca1/2突变的乳腺癌就对顺铂药物治疗耐药，brca1/2突变检测以预测乳腺癌顺铂治疗有效并不一定适用所有患者。本申请意在寻找可以预测或诊断三阴性乳腺癌顺铂耐药的标志物，从而方便在预测、诊断顺铂类药物治疗无效的方向上为治疗过程及治疗药物方案提供指导，也能基于对顺铂耐药的诊断对等实现对顺铂治疗敏感三阴性乳腺癌的诊断。
长非编码rna是近年来发现与肿瘤的发生、发展和转移密切相关的分子。人类基因组当中只有大约3％的转录本是编码蛋白的，其他97％的转录本并不翻译成蛋白。但是，这些不编码蛋白的基因组在各种状态下依然会被转录，被称为非编码。其中，长非编码rna(longnoncodingrna,lncrna)是一组不翻译蛋白，长度大于200nt的rna。过去，lncrna被认为是基因组转录过程中的“噪音”，不发挥生物学功能。然而，近来已经发现lncrna参与多种生物学过程，在多个病理、生理过程中均发挥着重要的作用，其与肿瘤的发生、发展和转移过程也密切相关。随着对lncrna的研究逐渐深入，研究开始关注lncrna与肿瘤治疗耐药之间的关系。2017年，lin等人报道长非编码rnahoxd-as1促进了前列腺癌的化疗耐药。2019年，jiang等人报道长非编码rnalnc-talc通过与mir-20b-3p的结合，促进脑胶质瘤的tmz耐药。本申请在此基础上，意在从长非编码rna层面研究三阴性乳腺癌的顺铂耐药性以及相关的长非编码rna，从而以获取有效的诊断标志物或应用，解决现有技术中所存在的技术问题。
技术实现要素：
本发明首次发现核苷酸序列如seqidno.1所示的长链非编码rna(以下记作linc01778v2)在顺铂耐药三阴性乳腺癌中的表达水平较顺铂敏感三阴性乳腺癌高。本发明人通过顺铂药物进行诱导，建立起对顺铂药物耐药的顺铂耐药三阴性乳腺癌稳定细胞株后，提取顺铂药物耐药三阴性乳腺癌细胞株和顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株的总rna进行lncrna芯片检测并通过生物信息学的分析得到差异表达的新的长链非编码rna，验证发现linc01778v2在顺铂药物耐药三阴性乳腺癌细胞株表达水平高，而在顺铂药物敏感三阴性乳腺癌细胞株中表达水平较低。随后，通过race实验技术获取长链非编码rnalinc01778v2的全长序列。linc01778v2能作为判断三阴性乳腺癌顺铂耐药或顺铂敏感的分子标志物，同时，也为顺铂耐药三阴性乳腺癌的治疗提供了新的靶点。此外，linc01778v2还可以应用于三阴性乳腺癌顺铂治疗的疗效预测、预后评估。
本发明首次运用5′race和3′race技术鉴定长链非编码rnalinc01778v2的序列为1542bp，长非编码rna在不同的细胞、组织中可有变异，本申请中所指的linc01778v2序列为本发明人在人乳腺癌细胞中通过race实验证实的长非编码rnalinc01778全长序列，其核苷酸序列如seqidno.1所示，即：
aaggaactctcactgcgcccttgtttggacaagacgaggaggcgcactcagagtcagagaccccggggcagagacaggggcaagaagaaggggccaccgagaccccaagagagtcagggagacagacgcaccaaacgaccgacacaaccagggacagatatccttcgagttggatttcgactgggttctgccagtgggatgtatccatgcgagattctggaactaacatcagagagagtccaagcttctaacttttatcagcggcagtgacaatagtcaagcagcattgatgacaaacggcaagagtttagaaagtaccagtgacgtgcctgatagaatctcaccacaagatggaagccaactcgtcagaagcctggaaagcccacccagcgtgggacctctgtgggtccaggatcttggaatggtatcccatggttcaatcttctggattcaaccacataaatttaccccacccatgtcgtggacccaagcttcctaccatgtatacttagcttaaatgcaagatagtactattttgttcatcttgattggagtgagaaatgaataggtccatgcacatatatttcttttaccacaacaagatgatgaagaaataaatccataatatcgatacttttgtataagttgtgtttacagttgcggtaagaaattttataattgttgatttgctttatataatttctgcttgctttttatgatatttaaaacaaaatctaagcaacaaattttatgtctgattagatttacagaagctgcttaagtgcttagggataatttgttcatcatatttgtaagtctcccttgttaggtgtttgaagtgtttgaattggctaaattaaatttgtaattgtagtttgaaatatctaaaggaattttcttaattaagtgtttaaatgatgttaaaagtttgtgggaatttaatctatcaaatttatgagttaattgaatatgaatcaatgaacaagtaaatgtgatcttgcttttatataaaaactactaagttcataaataaaatacaaagatccataagttgagaggaaaagcaaaagagccagattctaagatctataacttaaaaaaattaaatattgattgaaatgtaagtcattgcaattatccccactagctgaaatctcacatctgagtgcttacacacaaaacaaaatgttaccctgaacatactaaacaaataaaaaaccacgtggtaattactatacacatgctcactgctggaagcattcatactgcactcaaatccaggtgggagaatgcagcgtgtgctacaggtgaatctcggctgttctcttatggggatcaggtctttttcttaattatcttccacggatttttcttcctttacccagagacctggaggccctcccagcccaggtccaattcagatggatacatacttaacatcactaacctattgatttgcttgtttatttacactgcagcacatgtttgttgtggtgcagaaggaaaacctccttcacatcttatactgaataatatcaatgc。
本发明首次克隆了linc01778v2的cdna序列，其cdna的序列如seqidno.1所示。现有技术中还未公开如本申请所获得的linc01778v2，也未公开本申请所获得的长度的linc01778v2。通过本申请中的linc01778v2序列设计的检测引物，有助于减少检测过程中的干扰，从而提高检测准确率。同时，基于linc01778v2的cdna序列，能为进一步研究linc01778在三阴性乳腺癌顺铂耐药性的发生、发展过程中的功能奠定基础。当linc01778v2作为基因标志物时，基于本申请所公开的序列设计的引物能够提高检测linc01778v2基因表达的准确率，从而提高linc01778v2作为基因标志物提供检测信息的可靠性。当linc01778v2作为治疗靶点时，基于本申请所公开的linc01778v2序列也有助于准确的设计抑制剂，如sirna，从而实现精准的抑制，提高治疗效果。基于linc01778v2的cdna序列设计的靶位点序列具有更高的靶向准确性，为顺铂类药物耐药三阴性乳腺癌治疗药物的研发和治疗提供了更多以及更为有效的功能靶点，有助于显著提高治疗药物的靶向治疗效果。
本发明提供了一种三阴性乳腺癌顺铂耐药性诊断标志物，包括上述的长链非编码rna，所述长链非编码rna的核苷酸序列如seqidno.1所示。所述长链非编码rna是能够用于三阴性乳腺癌顺铂耐药检测的标志物，可以精确筛选出顺铂化疗药物有效或者顺铂化疗药物无效的三阴性乳腺癌患者，所述长链非编码rna即长链非编码rnalinc01778v2。当linc01778v2应用于三阴性乳腺癌顺铂耐药检测时，能通过检测linc01778v2的表达水平以获取当前三阴性乳腺癌患者是否具有对顺铂类药物的耐药特性。通过对linc01778v2的检测，有助于及时在治疗前、治疗中进行治疗方案的调整，从而有助于实现针对性的治疗，一方面能节省患者的试药时间，避免浪费患者的生存期时间；另一方面，在获取到三阴性乳腺癌对顺铂类药物耐药时可及时采用其他有效的治疗方案、治疗药物进行治疗，从而把握患者紧张的生存期限，以促进患者的治疗效果，从而延长生存期限。在治疗前检测则便于预测顺铂类药物治疗效果，从而针对性的拟定治疗方案。在治疗过程中，通过对患者的定期检测，则能及时获取患者的耐药情况，从而有针对性的施加其他药物或可逆转顺铂耐药性药物或采取其他治疗方案，从而使患者得到有效的治疗。更进一步地，当本申请所述的长链非编码linc01778v2检测结合brca1/2突变检测时，能更为有效的获取顺铂类药物治疗患者所可能发生的状况，从而实现后续更为精准的用药和治疗。所述linc01778v2应用于三阴性乳腺癌顺铂耐药的检测具有特异性强、灵敏度高的优势，其检测结果的准确度高，能为三阴性乳腺癌顺铂耐药的诊断、顺铂类药物治疗三阴性乳腺癌的预测、预后或疗效监测提供可靠信息。
本发明提供了上述三阴性乳腺癌顺铂耐药性诊断标志物在制备三阴性乳腺癌疗效预测、预后评估和/或治疗的产品中的用途。通过治疗前对三阴性乳腺癌患者的linc01778v2基因表达量检测，有助于预测三阴性乳腺癌采用顺铂类药物治疗产生的效果；在三阴性乳腺癌各个阶段治疗后或整体治疗后对linc01778v2基因表达量检测，则能获取患者对顺铂类药物的耐药性，从而基于该结果进行后续阶段治疗的调整或进行预后评估；linc01778v2作为标志物具有其敏感性、特异性的特点，能提高早期疗效预测、诊断和预后评估的效率和准确性。由于长非编码rna与三阴性乳腺癌的顺铂耐药性发生密切相关，所以该长非编码rna也可以作为一个治疗靶点，从而通过调整linc01778v2表达而改善顺铂耐药三阴性乳腺癌的耐药程度或实现耐药性的逆转，从而便于调节linc01778v2表达的试剂与顺铂类药物联合治疗，提高治疗效果。且以标志物作为顺铂耐药三阴性乳腺癌治疗靶点研发抗癌药物，具有特异性强、靶向效果和治疗效果好的优势。
本发明提供了一种用于三阴性乳腺癌顺铂耐药性诊断的引物对，所述引物对包括基于如seqidno.1所示的核苷酸序列设计的引物。基于seqidno.1所示的核苷酸序列设计的引物对能通过cdna末端快速扩增技术(race)克隆得到linc01778v2的cdna序列，cdna序列结果准确，且克隆过程步骤简单、易操作。利用该引物对，能通过实时荧光定量pcr技术实现linc01778v2在细胞和组织中的高精度检测，从而为三阴性乳腺癌的顺铂耐药诊断、顺铂药物治疗预后评估、顺铂药物治疗效果预测、监测提供可靠信息。
进一步地，所述引物对包括如下所述引物：
linc01778-forward，其核苷酸序列如seqidno.2所示；
linc01778-reverse，其核苷酸序列如seqidno.3所示。
采用linc01778-forward和linc01778-reverse对linc01778v2进行扩增具有特异性强、效率高和扩增结果准确的优势，通过rt-pcr技术能够实现对linc01778v2表达的准确定量。
本发明提供了一种长链非编码rna的检测试剂在制备用于三阴性乳腺癌顺铂耐药性诊断的试剂中的应用，所述长链非编码rna的核苷酸序列如seqidno.1所示。进一步地，所述检测试剂为检测长链非编码rnalinc01778v2表达量的检测试剂。通过检测长链非编码的检测试剂能够检测三阴性乳腺癌患者的linc01778v2表达等情况，由于linc01778v2在顺铂耐药三阴性乳腺癌和顺铂敏感三阴性乳腺癌中的表达状况不同，所以基于该试剂有助于制备用于诊断三阴性乳腺癌顺铂耐药性诊断的试剂，从而及时诊断是否具有或后天产生的对顺铂类药物的耐药性。
进一步地，所述用于三阴性乳腺癌顺铂耐药诊断的试剂包括实时荧光定量pcr检测试剂。通过实时荧光定量pcr能够直接检测三阴性乳腺癌患者linc01778v2表达情况，从而进行疗效预测、顺铂耐药诊断、预后评估，且便于实现针对性的治疗。结合rt-pcr和实时荧光定量pcr能够准确、快速的获取对应患者的linc01778v2表达情况，简化诊断过程的同时还能保证准确率。有助于实际应用于临床治疗上，从而为现有的三阴性乳腺癌患者提供有效的诊断技术。
进一步地，用于三阴性乳腺癌顺铂耐药性诊断的试剂包括用于检测所述长链非编码rna的特异性探针；和/或，基于如seqidno.1所示的核苷酸序列设计的用于检测所述长链非编码rna的特异性引物。当试剂涉及到pcr扩增时，利用基于seqidno.1所示的核苷酸序列设计的能克隆完整linc01778v2序列的特异性引物，有助于结合定量pcr技术实现诊断目的。除了利用引物和rt-pcr、定量pcr实现诊断目的外，还能通过探针实现对linc01778v2的检测，同样能基于检测结果获取诊断结果，达到诊断目的。
更进一步地，所述特异性引物包括如下所述引物：
linc01778-forward，其核苷酸序列如seqidno.2所示；
linc01778-reverse，其核苷酸序列如seqidno.3所示。
采用上述引物能克隆出如seqidno.1所示的linc01778v2序列，从而便于结合rt-pcr、定量pcr实现linc01778v2检测，进一步实现三阴性乳腺癌患者是否对顺铂类药物耐药的诊断目的。
本发明提供了一种如seqidno.1所示的长链非编码rna的检测方法，包括步骤：
(1)样品rna的提取：采用rna提取试剂盒进行样本细胞总rna的提取；
(2)样品cdna的制备：基于逆转录酶和步骤(1)获得的总rna进行逆转录以获取cdna；
(3)实时荧光定量pcr：基于包括步骤(2)获取的cdna和用于克隆seqidno.1所示序列的引物对的荧光定量pcr体系进行荧光定量pcr反应，并获取样本中linc01778v2表达的分析结果。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：基于长非编码rnalinc01778v2在顺铂药物耐药三阴性乳腺癌细胞与顺铂药物敏感三阴性乳腺癌细胞中表达显著不同，在顺铂药物耐药三阴性乳腺癌细胞中高表达，在顺铂药物敏感三阴性乳腺癌细胞中低表达，通过检测三阴性乳腺癌患者样本中长非编码rnalinc01778v2能够帮助判断三阴性乳腺癌患者是否对顺铂类药物具有耐药性，从而基于是否耐药的判断实施更为有效的治疗方法，而不是进行盲目的治疗；有助于对症下药，提高治疗效果，避免盲目使用带来较多副作用或降低治疗效果。同时，由于顺铂类药物对敏感患者、耐药患者所产生的疗效具有显著差别，所以长非编码rnalinc01778v2还能应用于对三阴性乳腺癌顺铂治疗效果的预测、顺铂药物治疗的预后评估。有助于获取准确的预测、预后结果，从而方便后续采用针对性、有效的治疗方案进行治疗，避免浪费无效治疗所消耗的时间，有助于延长患者的生存期。同时，由于长非编码rnalinc01778v2与顺铂类药物耐药的产生、发展相关，所以研究长非编码rnalinc01778v2作为改变顺铂耐药性的靶点，有助于为现有的顺铂耐药三阴性乳腺癌患者提供有效的治疗药物或方案，尤其是对于部分只能采用化疗治疗的患者，顺铂类药物具有的有效性若能同样出现于该类患者治疗过程中，则能基于顺铂类药物显著的治疗效果而提高整体治疗效果。以linc01778v2作为治疗靶点，有助于改善顺铂耐药患者的耐药情况或逆转耐药情况，从而结合顺铂类药物得到有效治疗。即将长非编码rnalinc01778v2作为新的三阴性乳腺癌顺铂耐药标志物和顺铂耐药治疗靶点，具有诊断、预后和/或治疗中的靶点的特异性以及高效性，为耐药性诊断和治疗三阴性乳腺癌提供有力的技术手段。
附图说明
图1为顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株和顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株的lncrna表达谱；
图2为经race实验验证的linc01778v2转录本全长示意图；
图3为基于mfold和rnafold软件包预测的rna二级结构示意图；
图4为linc01778v2在231cisr中的荧光原位杂交结果图。
图5为顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株(mda-mb-231cisr)和顺铂敏感三阴性乳腺癌菌株(mda-mb-231parental)在顺铂药物下的细胞活性折线图(左)和linc01778v2在顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株(mda-mb-231cisr)和顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株(mda-mb-231parental)中的表达水平柱状图(右)；
图6为顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株(mda-mb-468cisr)和顺铂敏感三阴性乳腺癌菌株(mda-mb-468parental)在顺铂药物下的细胞活性折线图(左)和linc01778v2在顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株(mda-mb-468cisr)和顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株(mda-mb-468parental)中的表达水平柱状图(右)。
图7为原位杂交实验检测linc01778v2分别在顺铂化疗不敏感患者乳腺癌组织(右)、顺铂化疗敏感患者乳腺癌组织(左)中的表达情况。
具体实施方式
下面结合具体的实施案例对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。除非另外说明，实施例所公开的实验方法均采用本领域常规技术，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施。
实施例1
筛选长链非编码rnalinc01778v2
使用顺铂药物进行诱导，建立对顺铂药物耐药的三阴性乳腺癌稳定细胞株。本实施例中是通过浓度梯度递增法，从低浓度开始，经过两年时间，建立对顺铂完全耐药的三阴性乳腺癌稳定耐药细胞株。然后，通过lncrna的芯片检测，对比顺铂药物耐药三阴性乳腺癌细胞株和顺铂药物敏感三阴性乳腺癌细胞株，筛选出一批差异表达的lncrna；所述的顺铂药物敏感即对顺铂药物不耐药；具体的，利用华大基因测序基于illumina四代高通量测序平台的lncrna高通量测序进行准确筛选，lncrna高通量测序包括lncrna鉴定、lncrna定量及差异分析、lncrna表达聚类、lncrna靶基因分析、转录本mrna鉴定、mrna定量及差异分析、mrna表达聚类、mrna功能及结构分析、circrna鉴定、circrna定量及差异分析、circrna表达聚类，并基于上述分析结果获取包括靶基因分析、cerna互作网络分析、蛋白互作网络分析、共表达互作网络分析、关键驱动基因网络分析的分析结果。通过华大公司lncrna高通量测序筛选出一批差异表达的lncrna后，本发明人进行了差异lncrna表达的验证，基于表达谱发现长非编码rnalinc01778v2在顺铂药物耐药细胞株表达水平高，而在敏感三阴性乳腺癌细胞株中表达水平较低，从而初步筛选出该长链非编码rnalinc01778v2。具体的，表达谱如图1所示，linc01778在两种细胞株中表达差异明显，为此，本申请基于linc01778进行了后续的进一步分析。本实施例以及后续实施例所采用的顺铂药物为sigma的顺铂。
实施例2
利用race对筛选出的长链非编码rnalinc01778v2进行序列分析
race(rapidamplificationofcdnaends)是一种获得rna转录本全长序列的技术。利用race技术可以根据转录本中的一小段已知序列获得转录本的5′端(5′race-pcr)或3′端(3′race-pcr)序列。本实施例中通过smarterrace方法(clontech公司专利技术)，扩增长链非编码rna(longnon-codingrna,lncrna)的末端未知序列。
具体包括以下步骤：
1、从顺铂耐药乳腺癌细胞中提取总rna
采用普洛麦格的totalrna抽提试剂盒(svtotalrnaisolationsystemstart-upkit),利用改进型重组dna酶i从细胞样品中高效快速除掉基因组dna，分离纯化和富集包括有长非编码rna在内的总rna。
2、基于race技术获取完整cdna
(1)利用smarterrace5’/3’试剂盒，完整地反转录包括linc01778v2在内的总rna的带有完整5’和3’序列的cdna。
(2)根据ncbi数据库中已知的长linc01778v2的部分序列，设计与其互补配对的特异性引物，并进行pcr扩增。
引物序列如下：linc01778-forward：5’-gtcagaagcctggaaagccc-3’；linc01778-reverse：5’-cacgacatgggtggggtaaat-3’；
(3)通过dna凝胶电泳判断和分离pcr的扩增长度。使用胶回收试剂盒回收和纯化扩增后的cdna。
3、利用一代测序技术鉴定linc01778v2的序列并与ucsc的基因序列进行比对，从而获取验证后的linc01778v2全长序列。
过程及结果如图2所示，通过race实验验证了linc01778v2的转录本全长。
实施例3
利用结构预测软件预测linc01778v2的二级结构
在基于实施例2的race实验获得linc01778v2的序列全长后，利用mfold和rnafold软件包对linc01778v2的rna二级结构进行预测，结果如图3所示，linc01778v2具有茎环结构。
实施例4
利用rna荧光原位杂交(rna-fish)实验定位linc01778v2
基于实施例3的race实验获得linc01778v2的序列全长后，设计并通过exiqon公司合成具有5’地高辛标记的锁核酸(lna)探针，并利用lna探针原位检测细胞中linc01778v2的表达。
包括以下步骤：
1、用多聚甲醛将乳腺肿瘤细胞固定于载玻片上，通过0.5％triton冰上破膜5分钟，0.05％胰蛋白酶消化蛋白，暴露rna位点，通过linc01778v2特异的地高辛标记探针于52℃杂交炉杂交过夜。
2、严格清洗后用带绿色荧光的抗地高辛抗体在4℃孵育过夜。
3、在dapi孵育后封片，在荧光显微镜下观察linc01778v2在乳腺肿瘤细胞中的定位，结果如图4所示，显示其主要分布于细胞浆，有助于基于linc01778v2制备的药物设置为靶向细胞浆，从而提高检测准确率或靶向作用效率。
实施例5
基于mda-mb-231细胞系检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞在顺铂药物作用下的活性变化，并采用荧光定量pcr(qpcr)检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞中linc01778v2的表达
1、检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞在顺铂药物作用下的活性变化
顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株为mda-mb-231cisr，顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株为mda-mb-231parental，在同一时间分别施加同剂量的顺铂药物，并观察2d内mda-mb-231cisr和mda-mb-231parental的细胞活性变化，结果如图5(左)所示，mda-mb-231cisr细胞活性在2d内总体上仍然是保持升高，而顺铂药物治疗mda-mb-231parental则能获取有效的治疗效果，mda-mb-231parental细胞组2d内的细胞活性在顺铂药物起效后显著下降。表明构建的mda-mb-231cisr对顺铂药物耐药，而mda-mb-231parental不耐药。
2、荧光定量pcr(qpcr)检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞中linc01778v2的表达
其中，荧光定量pcr检测顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株mda-mb-231cisr中linc01778v2的表达的步骤如下所示：
(1)利用ncbi数据库的primerblast功能，基于如seqidno.1所示序列设计linc01778v2的引物。引物序列如下：
linc01778-forward：5’-gtcagaagcctggaaagccc-3’
linc01778-reverse：5’-cacgacatgggtggggtaaat-3’
(2)提取顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株mda-mb-231cisr的总rna。
(3)样品cdna的制备：采用takara公司的primescriptrt逆转录酶，并按说明书操作:①rt-pcr体系：提取的总rna500ng、primescriptrt逆转录酶2ul，利用无rna酶的ddh2o补到10μl；②置于pcr仪中37℃孵育15min，85℃孵育5s以灭活逆转录酶，获得cdna。
(4)荧光定量pcr
①采用takara公司的tbgreenpremixextaqii试剂盒，其反应体系如下：tbgreen5ul、linc01778v2正向引物0.4μl、linc01778v2反向引物0.4μl、cdna1μl、ddh2o3.2μl，总体积10μl。
②基于①反应体系在罗氏pcr系统lightcycler480system中进行反应并分析数据。
荧光定量pcr检测顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株mda-mb-231parental中linc01778v2的表达的步骤与上述荧光定量pcr检测顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株中linc01778v2的表达步骤相同；最后，荧光定量pcr(qpcr)检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞中linc01778v2的结果如图5(右)所示。图5(右)显示了顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株中linc01778v2表达的显著差异，mda-mb-231cisr中linc01778v2的表达水平是mda-mb-231parental的linc01778v2表达水平的4倍多，足以显示其在对顺铂不同反应的三阴性乳腺癌中的差别，结合图5(左)对细胞株的验证结果，证明linc01778v2能作为标志物判断三阴性乳腺癌的顺铂耐药性，且基于其差异的显著，基于检测linc01778v2表达的诊断也具备充足的诊断准确性。
实施例6
基于mda-mb-468细胞系检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞在顺铂药物作用下的活性变化，并采用荧光定量pcr(qpcr)检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞中linc01778v2的表达
1、检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞在顺铂药物作用下的活性变化
顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株为mda-mb-468cisr，顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株为mda-mb-468parental，在同一时间分别施加同剂量的顺铂药物，并观察2d内mda-mb-468cisr和mda-mb-468parental的细胞活性变化，结果如图6(左)所示，mda-mb-468cisr细胞活性在2d内总体上仍然是保持升高，而顺铂药物治疗mda-mb-468parental则能获取有效的治疗效果，mda-mb-468parental细胞组2d内的细胞活性在顺铂药物起效后显著下降。表明构建的mda-mb-468cisr对顺铂药物耐药，而mda-mb-468parental不耐药。
2、荧光定量pcr(qpcr)检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞中linc01778v2的表达
其中，荧光定量pcr检测顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株mda-mb-468cisr中linc01778v2的表达的步骤如下所示：
(1)利用ncbi数据库的primerblast功能，基于如seqidno.1所示序列设计linc01778v2的引物。引物序列如下：
linc01778-forward：5’-gtcagaagcctggaaagccc-3’；
linc01778-reverse：5’-cacgacatgggtggggtaaat-3’。
(2)提取顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株mda-mb-468cisr的总rna；
(3)样品cdna的制备：采用takara公司的primescriptrt逆转录酶，并按说明书操作:①rt-pcr体系：提取的总rna500ng、primescriptrt逆转录酶2ul，利用无rna酶的ddh2o补到10μl；②置于pcr仪中37℃孵育15min，85℃孵育5s以灭活逆转录酶，获得cdna。
(4)荧光定量pcr
①采用takara公司的tbgreenpremixextaqii试剂盒进行，反应体系如下：tbgreen5ul、linc01778v2正向引物0.4μl、linc01778v2反向引物0.4μl、cdna1μl、ddh2o3.2μl，总体积10μl。
②基于①反应体系在罗氏pcr系统lightcycler480system中进行反应并分析数据。
荧光定量pcr检测顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株mda-mb-468parental中linc01778v2的表达的步骤与上述荧光定量pcr检测顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株中linc01778v2的表达步骤相同；最后，荧光定量pcr(qpcr)检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞中linc01778v2的结果如图6(右)所示。
通过对基于不同的三阴性乳腺癌细胞系检测，进一步验证了实施例5的结论，且通过不同细胞系能证明linc01778v2作为标志物或靶点是具有三阴性乳腺癌广谱性的，能够适用不同三阴性乳腺癌患者。
实施例7
在获得linc01778v2对应的全长序列后，除了上述对多种细胞系的检测外，本发明人同时还对顺铂化疗敏感患者乳腺癌组织及对顺铂化疗不敏感患者乳腺癌组织进行linc01778v2基因表达的检测。
1、原位杂交检测ffpe样本中的linc01778v2表达。
本实施例中采用的原位杂交检测方法为常规检测方法，主要包括步骤：脱蜡和补液，然后使用20μg/ml罗氏蛋白酶k进行消化，消化过程完成后通过4％多聚甲醛进行固定，再基于exiqon公司的双(5’和3’)digoxin-labeled(dig-labeled)lna-modifiedcreila探针实现杂化作用，并于52℃下孵育过夜；随后在4℃下与anti-dig单克隆抗体结合，基于碱性磷酸酶(罗氏,目录11093274910)、硝基蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(roche)实现染色显示，最后将切片裱起来观察。ish中使用的探针序列为5’-agattctatcaggcacgtcact-3’。强度记录为0(无染色)，1(浅紫色)，2(紫蓝色)和3(深紫色)。且本实施例中乳腺癌组织为三阴性乳腺癌组织。
如图7所示，检测发现在顺铂化疗不敏感患者乳腺癌组织表达量较顺铂化疗敏感患者乳腺癌组织中高，见图7(右)，所以linc01778v2可以作为一种对顺铂化疗不敏感乳腺癌患者的标志物。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
sequencelisting
<110>中山大学孙逸仙纪念医院
<120>一种三阴性乳腺癌顺铂耐药诊断用长链非编码rna及其应用
<130>
<160>3
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>1542
<212>dna
<213>未知
<400>1
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ctgggttctgccagtgggatgtatccatgcgagattctggaactaacatcagagagagtc240
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ccactagctgaaatctcacatctgagtgcttacacacaaaacaaaatgttaccctgaaca1200
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<213>人工序列
<400>2
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<210>3
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
cacgacatgggtggggtaaat21
1.一种长链非编码rna分子，其核苷酸序列如seqidno.1所示。
2.一种三阴性乳腺癌顺铂耐药诊断标志物，其特征在于，包括一种长链非编码rna，所述长链非编码rna的核苷酸序列如seqidno.1所示。
3.权利要求2所述的三阴性乳腺癌顺铂耐药诊断标志物在制备三阴性乳腺癌疗效预测、预后评估和/或治疗的产品中的用途。
4.一种用于三阴性乳腺癌顺铂耐药诊断的引物对，其特征在于，所述引物对包括基于如seqidno.1所示的核苷酸序列设计的引物。
5.根据权利要求4所述的引物对，其特征在于，所述引物对包括如下所述引物：
linc01778-forward，其核苷酸序列如seqidno.2所示；
linc01778-reverse，其核苷酸序列如seqidno.3所示。
6.一种长链非编码rna的检测试剂在制备用于三阴性乳腺癌顺铂耐药诊断的试剂中的应用，所述长链非编码rna的核苷酸序列如seqidno.1所示。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述用于三阴性乳腺癌顺铂耐药诊断的试剂包括实时荧光定量pcr检测试剂。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述用于三阴性乳腺癌顺铂耐药诊断的试剂包括用于检测所述长链非编码rna的特异性探针；和/或，基于如seqidno.1所示的核苷酸序列设计的用于检测所述长链非编码rna的特异性引物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述特异性引物包括如下所述引物：
linc01778-forward，其核苷酸序列如seqidno.2所示；
linc01778-reverse，其核苷酸序列如seqidno.3所示。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，长链非编码rna的检测方法包括步骤：
(1)样品rna的提取：采用rna提取试剂盒进行样本细胞总rna的提取；
(2)样品cdna的制备：基于逆转录酶和步骤(1)获取的总rna进行逆转录以获取cdna；
(3)荧光定量pcr：基于包括步骤(2)获取的cdna和用于克隆seqidno.1所示序列的引物对的荧光定量pcr体系进行荧光定量pcr反应，并获取样本中linc01778v2表达的分析结果。
技术总结