谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体及其应用的制作方法

专利2022-05-09 125

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体及其应用。

背景技术：
：

氨基酸，包括谷氨酸、赖氨酸、脯氨酸等是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，被广泛应用于医药、健康、食品、动物饲料和化妆品等行业中，主要采用微生物发酵法来生产。目前，主要的生产菌株包括肠杆菌属、棒杆菌属等的微生物，而由于棒杆菌的生理优越性，棒杆菌已成为工业中最重要的生产菌株。随着生物技术的不断发展，对棒杆菌进行代谢工程改造提高其氨基酸产量的报道逐渐增多，这些改造包括加强氨基酸合成途径相关酶的表达，减弱竞争性途径相关酶的表达等等。

谷氨酸脱氢酶(glutamatedehydrogenase，由gdh基因编码)，可催化α-酮戊二酸生成谷氨酸，是谷氨酸生物合成的关键酶，同时由于谷氨酸是脯氨酸、赖氨酸等的合成前体或重要代谢物，已有文献报道，增强谷氨酸脱氢酶的表达可以提高菌株的谷氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸等的产量(wo0053726a1，jp61268185a，cn1262640c，keleshyan,sketal.,influenceofglutamatedehydrogenaseactivityonl-prolinesynthesis,appliedbiochemistryandmicrobiology,2017,53(5):518-523)。本领域技术人员都知晓，增强酶的表达的方法有很多，如增加拷贝数、替换强启动子等等。由于增加拷贝数会在一定程度上增加菌株的负担，可能导致菌株的基因组不稳定，而启动子对基因的表达调控不存在以上缺陷，因此，对于提高棒杆菌氨基酸的生产效率来说，本领域需要开发丰富的启动子元件，以便适度增强gdh等目标基因的表达，从而提高菌株氨基酸的生产效率。

技术实现要素：
：

第一方面，本发明提供了谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体，其核苷酸序列在对应于seqidno:30的479-482位置发生突变且在对应于seqidno:30的499-501位置发生突变。

进一步地，在对应于seqidno:30的479-482位置发生突变是指在对应于seqidno:30的479、480、481、或482位置的一个或多个碱基发生突变，且在对应于seqidno:30的499-501位置发生突变是指在对应于seqidno:30的499、500、501位置的一个或多个碱基发生突变。

更进一步地，所述谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体，其启动子核心区的核苷酸序列为如下序列之一：

(1)aattctttgtcagtatatctgtgcgacactggtataattgaacgtg；

(2)aattctttgtctagatatctgtgcgacactggtataattgaacgtg；

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(29)aattctttgtggcgatatctgtgcgacacttgtataattgaacgtg。

更进一步地，所述其核苷酸序列如seqidno:1-29任一所示的序列。

其中谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体是具有启动子活性的核苷酸分子。所述“启动子”是指一种核酸分子，通常位于目的基因编码序列的上游，为rna聚合酶提供识别位点，并位于mrna转录起始位点的5’方向的上游。它是不被翻译的核酸序列，rna聚合酶与这一核酸序列结合后启动目的基因的转录。

所述“启动子核心区”是指原核生物中位于启动子上的一段核酸序列，是发挥启动子功能的核心序列区，主要包括-35区、-10区、-35区和-10区之间的区域以及转录起始位点，-35区是rna聚合酶的识别位点，-10区是rna聚合酶的结合位点。本发明的启动子的突变体是改进的谷氨酸棒杆菌的gdh基因的启动子，它比野生型启动子具有更高的启动子活性，如提高至少2.3倍以上，优选3.3倍、5倍、8倍以上，更优选10倍、11倍、12倍、13倍、14倍以上，最优选40倍、45倍以上。

本发明的启动子核酸分子可以使用标准的分子生物学技术分离或制备。例如，可以使用合适的引物序列通过pcr来分离本发明的启动子核酸分子。此外，也可以使用自动dna合成仪通过标准合成技术来制备本发明的启动子核酸分子。

第二方面，本发明提供了包含所述谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体的表达盒、重组载体。

所述“表达盒”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即含有启动子、目的基因并且能够将目的基因进行表达的元件。

术语“载体”指的是dna构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的dna序列，从而在合适的宿主中表达目的基因。本发明所使用的载体并没有特别的限制，可为本领域中已知的任何载体，只要它能够在宿主中进行复制即可。即所述载体包括但不限于质粒，噬菌体，例如本发明具体实施例中使用的pec-xk99e质粒。一旦转化入合适的宿主之后，所述载体可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在某些情况下整合入基因组本身。

第三方面，本发明提供了含有所述谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体的重组宿主细胞。

重组宿主细胞具体通过转化来实现。此处“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的dna导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(capo4)沉淀法、氯化钙(cacl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(peg)法、deae-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-dmso法。

本发明所述“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够导入本发明的具有启动子活性的核酸的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要其细胞中含有本发明的具有启动子活性的核酸，并且与某一基因可操作性地连接介导该基因的转录。本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选肠杆菌或棒杆菌，更优选谷氨酸棒杆菌，包括但不限于谷氨酸棒杆菌atcc13032、谷氨酸棒杆菌atcc13869、谷氨酸棒杆菌b253、谷氨酸棒杆菌atcc14067，以及由上述菌株制备的产生l-氨基酸的突变体或菌株。

在本发明中，所述宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的ph值等。

第四方面，本发明提供了一种增强目的基因表达的方法，所述方法包括将所述谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体与目的基因可操作地连接。

本发明中的术语“可操作地连接”是指本发明的谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体与编码基因功能性连接，以启动和介导所述基因的转录，表明本发明的谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体与编码基因可操作地连接以控制操纵子基因的转录活性。所述可操作地连接的方式可以采用本领域技术人员所述的任何方式。本发明所述的增强目的基因表达的方法中，利用本发明的所述谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体的基础上，采用包括本领域技术人员通常使用的方法实现。

在一个具体实施方式中，所述编码基因是谷氨酸脱氢酶的基因，其可催化α-酮戊二酸生成谷氨酸，是谷氨酸生物合成的关键酶，同时由于谷氨酸是脯氨酸、赖氨酸等的合成前体，已有大量文献报道增强谷氨酸脱氢酶的表达，可以提高菌株的谷氨酸、脯氨酸和赖氨酸等的产量(wo0053726a1，jp61268185a，cn1262640c，keleshyan,sketal.,influenceofglutamatedehydrogenaseactivityonl-prolinesynthesis,appliedbiochemistryandmicrobiology,2017,53(5):518-523)。本发明的所述的系列强度启动子元件，可用于适度调控目标基因的表达，实现目标产物的高效生产。

本发明的谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体可以被用作棒杆菌或肠杆菌中其他基因的表达，包括但不限于氨基酸合成相关的基因，如天冬氨酸激酶lysc、苏氨酸操纵子thrabc、天冬氨酸半醛脱氢酶asd、天冬氨酸氨裂合酶aspb、高丝氨酸脱氢酶hom、高丝氨酸o-乙酰基转移酶metx、二氢吡啶二羧酸合成酶dapa、二氢吡啶甲酸还原酶dapb、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶ddh、谷氨酸激酶prob、谷氨酸-5-半醛脱氢酶proa、吡咯-5-羧酸脱氢酶proc、脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶puta等等。

进而，第五方面，本发明提供了一种生产氨基酸的方法，所述方法包括培养含有所述谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体与编码谷氨酸脱氢酶的基因可操作地连接的宿主细胞，收集产生的氨基酸。其中，所述氨基酸包括脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、鸟氨酸、谷氨酸酰胺等。更优选地，所述氨基酸生产相关的基因包括但不限于gdh基因，lysc基因、thrabc基因、asd基因、aspb基因、hom基因、metx基因、dapa基因、dapb基因、ddh基因、prob基因、proa基因、proc基因、puta基因、hema基因等。通过本发明的方法，可以提高菌株的氨基酸，特别是脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、鸟氨酸、谷氨酸酰胺的产量。

本发明所述的生产氨基酸的方法中，利用本发明的所述谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体的基础上，采用包括本领域技术人员通常使用的方法，同时也包括从细胞或培养液中回收氨基酸的步骤。从细胞或培养基中回收氨基酸的方法是本领域公知的，包括但不限于：过滤、阴离子交换色谱、结晶和hplc。

在本发明的一个具体实施方式中，所述宿主细胞是谷氨酸棒杆菌，进一步地经过改良，具体地是在所述菌中的谷氨酸激酶prob编码基因引入g149k突变编码序列，以解除脯氨酸的反馈抑制，更进一步地利用pyc启动子过表达谷氨酸激酶prob^g149k、谷氨酸-5-半醛脱氢酶proa和吡咯-5-羧酸脱氢酶proc的表达盒整合至脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶puta基因上，获得脯氨酸生产菌株；优选地，所述pyc启动子是其增强的突变启动子，进一步优选地，其核心区序列如seqidno：68所示，更优选地，所述pyc启动子的序列如seqidno：69所示。如此能够更高效的产生脯氨酸。

本发明的有益效果：本发明提供的具有增强的启动子活性的核酸分子表现出比野生型更高的启动子活性，可用于增强目的基因的表达，例如与gdh基因可操作地连接，可以增强谷氨酸脱氢酶的表达强度，由此提高了重组菌株的氨基酸生产效率，具有较高的应用价值。

附图说明

图1：pec-xk99e-pgdh-rfp质粒的质粒图谱。

图2：gdh启动子突变体的荧光筛选平板。

具体实施方式

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选此处提供的方法和材料。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

实施例1.谷氨酸棒杆菌gdh基因启动子强度表征质粒的构建

为了表征谷氨酸棒杆菌gdh基因启动子的强度，本发明首先构建一个表征载体，在pec-xk99e质粒骨架基础上，由gdh基因启动子表达gdh基因n端60个氨基酸、一个连接肽和红色荧光蛋白基因。根据已公开的谷氨酸棒杆菌atcc13032基因组序列及gdh基因注释信息，设计引物gdh-f/r，以atcc13032基因组为模板，通过pcr扩增获得gdh基因启动子和n端180bp的dna片段。以文献报道的pec-xk99e-rfp(王迎春等.基于时间序列转录组筛选谷氨酸棒杆菌内源高效组成型启动子[j].生物工程学报，2018,34(11):1760～1771)质粒为模板，以pec-f/r引物，扩增pec-xk99e质粒骨架、连接肽和红色荧光蛋白基因的dna片段。以上两个片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得pec-xk99e-pgdh-rfp表征载体，其质粒图谱如图1所示。以上所用引物序列如表1所示。

表1

实施例2.谷氨酸棒杆菌gdh基因启动子突变体筛选及强度表征

(1)谷氨酸棒杆菌gdh基因启动子突变体文库的构建

本发明对谷氨酸棒杆菌gdh基因启动子的核心区“aattctttgtggtcatatctgtgcgacactgccataattgaacgtg”进行突变，其中下划线处分别为该启动子的-35区和-10区主要序列。本发明在以上核心区对应位置进行突变“aattctttgtnnnnatatctgtgcgacactnnnataattgaacgtg”，分别采用gdh-m1/m2和gdh-m3/m4引物扩增质粒的两个片段，通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，对获得的所有克隆菌进行收集并提取质粒，获得gdh基因启动子突变体文库。将以上文库和实施例1中获得野生型对照pec-xk99e-pgdh-rfp分别转化谷氨酸棒杆菌atcc13032，涂布tsb平板，通过荧光成像系统对长有数百个克隆的平板进行荧光拍照，根据克隆的荧光亮度初步筛选表达强度提高的突变体。tsb平板培养基成份为(g/l)：葡萄糖，5g/l；酵母粉，5g/l；大豆蛋白胨，9g/l；尿素，3g/l；丁二酸，0.5g/l；k2hpo4·3h2o，1g/l；mgso4·7h2o，0.1g/l；生物素，0.01mg/l；维生素b1，0.1mg/l；mops，20g/l；琼脂粉，15g/l。本发明对大于1万个克隆进行初步筛选，获得约40个荧光强度增强的突变体(筛选平板如图2所示)。以上所用引物序列如表2所示。

表2

(2)谷氨酸棒杆菌gdh基因启动子突变体文库的强度表征

对以上平板观察荧光强度增强的所有突变体进行96孔板培养表征启动子的强度，tsb液体培养基成份为(g/l)：葡萄糖，5g/l；酵母粉，5g/l；大豆蛋白胨，9g/l；尿素，3g/l；丁二酸，0.5g/l；k2hpo4·3h2o，1g/l；mgso4·7h2o，0.1g/l；生物素，0.01mg/l；维生素b1，0.1mg/l；mops，20g/l。将平板获得的菌株用牙签接种至每孔含有200μltsb液体培养基的96孔板中，每个菌株3个平行，孔板摇床转速为800rpm，30℃培养24h后检测菌株的荧光强度，并对荧光强度较野生型对照提高的菌株进行测序。结果如表3所示，部分启动子突变体序列相同，最终本发明成功获得29个表达强度较野生型启动子提高的不同启动子突变体，提高倍数范围为2.3-46.4倍，其中按顺序编号为pgdh-1至pgdh-29，可为改造gdh等基因的表达提供丰富的元件。

表3

实施例3.谷氨酸棒杆菌gdh基因启动子突变体应用于脯氨酸生产

(1)评价用脯氨酸生产基础菌株slcgp2的构建

根据文献报道，谷氨酸激酶prob引入g149k突变可以解除脯氨酸的反馈抑制，谷氨酸棒杆菌atcc13032菌株基因组上引入该突变可以产生脯氨酸，本发明将谷氨酸棒杆菌atcc13032菌株引入g149k突变，密码子从ggt突变为aag，获得slcgp1菌株。

本发明人进一步应用将ppyc-20启动子(其核心区的核苷酸序列为cgggccttgattgtaagataagacatttagtataattag，如seqidno：68所示，启动子的核苷酸序列如seqidno：69所示)过表达解除反馈抑制的谷氨酸激酶prob^g149k、谷氨酸-5-半醛脱氢酶proa和吡咯-5-羧酸脱氢酶proc的表达盒整合至脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶puta基因上，获得脯氨酸生产菌称为slcgp2菌株。

slcgp2菌株具体构建如下：1)首先，在pec-xk99e质粒上构建ppyc-20启动子表达prob^g149k、proa和proc的表达盒。以包含ppyc-20启动子的质粒为模板，以pyc-a/b为引物，扩增ppyc-20启动子片段；以slcgp1菌株基因组为模板，分别以prob-1/2、proa-1/2和proc-1/2为引物扩增prob^g149k、proa和proc的片段；同时以pec-1/2引物扩增pec-xk99e的骨架。以上5个片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得pec-prob^g149kproaproc质粒。2)构建将以上表达框在puta基因上插入染色体的重组载体。以scgl30-ppyc-20菌株基因组为模板，分别以puta-1/2和puta-3/4引物扩增puta基因上插入的上下游同源臂；以pec-prob^g149kproaproc质粒为模板，以abc-f/r为引物扩增表达框片段；同时以pk18-1/2引物扩增pk18mobsacb的骨架。上述pcr片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得pk18-prob^g149kproaproc重组载体。3)pk18-prob^g149kproaproc重组载体转化slcgp1菌株，涂布含有5g/l葡萄糖和25μg/ml卡那霉素的lbhis固体培养基上，30℃培养获得第一次重组的转化子。正确的一次重组转化子分别接种含有5g/l葡萄糖的lb培养基，过夜培养，然后1％转接含有100g/l蔗糖的lb培养基，30℃培养过夜后分别涂布添加100g/l蔗糖的lb固体培养基平板进行筛选，通用特异引物pcr及测序确认正确突变体，分别获得slcgp2菌株。以上所用引物序列如表4所示。

表4

(2)谷氨酸棒杆菌gdh基因启动子突变体的重组载体构建

根据已报道的谷氨酸棒杆菌atcc13032基因组序列，分别以atcc13032基因组为模板，以gdh-uf/gdh-ur为引物扩增上游同源臂，分别以gdh-df1/gdh-dr、gdh-df7/gdh-dr、gdh-df16/gdh-dr、gdh-df23gdh-dr、gdh-df26/gdh-dr、gdh-df29/gdh-dr为引物扩增pgdh-1、pgdh-7、pgdh-16、pgdh-23、pgdh-26和pgdh-29启动子突变体的下游同源臂；同时以pk18-1/2引物扩增pk18mobsacb的骨架。上述pcr片段回收后，通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，分别获得启动子突变的重组载体pk18-pgdh-1、pk18-pgdh-7、pk18-pgdh-16、pk18-pgdh-23、pk18-pgdh-26和pk18-pgdh-29。以上所用引物序列如表5所示。

表5

(3)谷氨酸棒杆菌脯氨酸生产菌的gdh基因启动子突变体构建

将上述构建的重组载体pk18-pgdh-1、pk18-pgdh-7、pk18-pgdh-16、pk18-pgdh-23、pk18-pgdh-26和pk18-pgdh-29分别转化谷氨酸棒杆菌脯氨酸生产菌slcgp2，涂布含有5g/l葡萄糖和25μg/ml卡那霉素的lbhis固体培养基上，30℃培养获得第一次重组的转化子。正确的一次重组转化子分别接种含有5g/l葡萄糖的lb培养基，过夜培养，然后1％转接含有100g/l蔗糖的lb培养基，30℃培养过夜后分别涂布添加100g/l蔗糖的lb固体培养基平板进行筛选，通过pcr和测序确认正确突变体，分别获得的gdh启动子突变的菌株slcgp3、slcgp4、slcgp5、slcgp6、slcgp7和slcgp8。

(4)谷氨酸棒杆菌脯氨酸生产菌gdh基因启动子突变体的脯氨酸生产能力评价

为了测试谷氨酸棒杆菌中gdh启动子突变对菌株产脯氨酸的影响，分别对slcgp2、slcgp3、slcgp4、slcgp5、slcgp6、slcgp7和slcgp8进行发酵测试，发酵培养基成份为：葡萄糖，72g/l；酵母粉，1g/l；大豆蛋白胨，1g/l；nacl，1g/l；硫酸铵，1g/l；尿素，10g/l；k2hpo4·3h2o，1g/l；mgso4·7h2o，0.45g/l；feso4·7h2o，0.05g/l；生物素，0.4mg/l；维生素b1，0.1mg/l；mops，40g/l；初始ph7.2。首先将菌株接种到tsb液体培养基中培养8h，培养物作为种子接种到每孔含有800μl发酵培养基的24孔板中，接种量为12μl，30℃培养18h，孔板摇床转速为800rpm，每个菌株3个平行，发酵结束后检测脯氨酸产量。结果如表6所示，gdh启动子突变后菌株的脯氨酸产量均有提高。

表6

以上结果表明增强gdh基因启动子表达强度的突变体可应用至依赖于从α-酮戊二酸到谷氨酸反应的目标产物的生产，例如脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、鸟氨酸、谷氨酸酰胺等以谷氨酸为产物或重要合成前体的氨基酸的生物法生产。asakuray等报道利用gdh启动子突变体增强gdh的活性可以提高谷氨酸产量(asakuray,kimurae,usuday,etal.alteredmetabolicfluxduetodeletionofodhacausesl-glutamateoverproductionincorynebacteriumglutamicum[j].applenvironmicrobiol,2007,73(4):1308-1319.)。xu,j等报道采ptac-m启动子替换gdh基因的启动子增强gdh的活性可以提高赖氨酸产量(xu,j.,wu,z.,gao,s.etal.rationalmodificationoftricarboxylicacidcycleforimprovingl-lysineproductionincorynebacteriumglutamicum.microbcellfact17,105(2018).)羟脯氨酸是以脯氨酸为前体，经过一步羟化即可以生产，本发明用于提高脯氨酸合成的改造也可用于羟脯氨酸生产。

序列表

<110>中国科学院天津工业生物技术研究所

<120>谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体及其应用

<160>69

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>799

<212>dna

<213>corynebacteriumglutamicum

<400>1

gtgtcagtatgcctttctgttatggcgttattgtggcacatcgcggtgggaaacaagcca60

ggtggcctgtgtaaataaggctccaaatgggaatccatgaggagactctttagttaaaat120

ctctagccttagtgtttcaagtctaacggtcgcccaattgaggagtgggtccatggcata180

tacggctatcgaaaaggtcggaaagtgcccgaatgtgcgttgttctagctagcctcggga240

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