本发明涉及基因工程领域，更具体地，涉及一种长非编码rnabdnf-as及其作为标志物和治疗靶点的应用。
背景技术：
乳腺癌是当今全球范围内发病率最高的女性恶性肿瘤，每年发病约为30.4万，发病率呈现持续上升的趋势，严重影响女性健康。而乳腺癌中又有将近70％为激素受体阳性乳腺癌，所以基于激素受体阳性乳腺癌的治疗方法和药物显得至关重要。内分泌治疗就是现有技术中常见的治疗该类乳腺癌的方法，其虽然是现有技术中较有效的治疗方法，但其仍存在较大缺陷，即内分泌治疗中的原发或继发内分泌耐药，该类耐药特性会严重影响患者的治疗效果，使得治疗效果无法达到预期。
虽然现有技术基于对原发性或继发性内分泌耐药机制研发出mtor抑制剂、pi3k抑制剂及cdk4/6抑制剂等药物并应用于临床，但总体来说，少量的肿瘤靶向药物仍远远不能满足临床治疗的需求，用药选择上存在空缺。同时，目前临床的肿瘤治疗存在一定的盲目性，只能对肿瘤进行分期分级或利用有限的分子标志物对肿瘤进行简单的分类，无法有效甄别预后好和预后差的肿瘤，部分预后较好的肿瘤可能被过度治疗，导致治疗效果不佳、患者的依从性降低；而且，现有技术也无法有效判断肿瘤对药物的敏感性，治疗方案的制定有一定的盲目性。因此，亟待开发一种治疗肿瘤的靶向药物或靶点，以及用于判断肿瘤预后、治疗效果以及肿瘤敏感性的分子标志物。
近年来以非编码rna为核心的表观遗传调控机制在生命活动中的作用越来越受到重视。长非编码rna是一类转录本长度在200nt以上的非编码rna分子，通常被认为不具备编码蛋白功能。但越来越多研究显示长非编码rna的表达在不同的组织具有高度特异性，不仅其表达水平与肿瘤发展的不同阶段、不同组织学类型密切相关，可以作为肿瘤检测的特异标志物；而且长非编码rna在肿瘤发生发展中的重要的调控作用也显示其作为肿瘤治疗靶点的可能性。
技术实现要素：
本发明旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种长非编码rnabdnf-as及其作为标志物和治疗靶点的应用，通过将本发明的长非编码rnabdnf-as作为标志物并检测其在乳腺癌中的表达，能够基于其表达水平对乳腺癌耐药以及预后进行准确、特异的预测或判断，从而基于预测或判断结果进行针对性治疗以提高治疗效果；且通过敲低本发明长非编码rnabdnf-as表达能使内分泌耐药乳腺癌对药敏感，并抑制肿瘤生长。
本发明提供了一种长非编码rnabdnf-as，其核苷酸序列如seqidno.1所示。
seqidno.1为：
5’-gtcatcgctgtctggaacagcgatgactcgatcgcgagatcaggaaggtggccgagtgtgtcgccgcggccatcaggcacttctccttcctgcccttgtatgaagaaggatgtgtttgcttccccttgtgccatgattgtaaatttcctgaggcctcctcagccctgcagaactggggttatagccatgtgactgatcttcgtccaagaatatgtaaagaaaaagtgttgagttggcttttagggctagagcaatgtatcttaggctcacttaaggaagctgtagagatgagcccaaggagggaaaccagaagagccccccaggctcaccagttgtttgttggctccctacaaacatgtcattcaagtggctaatcttacaacagcacaaattcatctaaccagaaagagaagaggaggctccaaaggcacttgactactgagcatcaccctggacgtgtacaagtctgcgtccttattgttttcttcattgggccgaactttctggtcctcatccaacagctcttctatcacgtgttcgaaagtgtcagccaatgatgtcaagcatcttgaacctgccttgggcccattcacgctctccagagtcccatgggtccgcacacctggagatactctattatagcaaagaagaaagataatttcattgagccatcctgttttacagtattgaattattaccacaaggtaccaaccatatatgcatacttaatagggtattttgtcaaaactatgcatgaaggtcatttgtttgagatgtcagaacattttcccgtgagaagatctcattgggcattgaaacagaaccacatgctcttcagaccagcaaccgcgactaccaaatactcctctgtcaactctacttgagtaagaacgctttcaattaaggcctaagtgtcaacatgcctttaaaaaaaatcgtggtgacacaaaatctttctttttagcacccaacagaatcccttcaaagcctcgtggtctgacaccctatgctacgtgacttgtgacccatccatttgtcatgttcttcgggaatgtggctaaggggctaagatgtgacttgaaaagaaaggtagaacaagatcatctcaaatttattatcaaggaatagttcagaaaacgacttcagaccacagagacagcagaacagatggtccggcatggatagagcatcagacactcacagactgtgccaacaagagccatcgagtcaaaacagccaaaggaaggagggtcatggaatgggttctctcacaccaaactgatgcccagaggccctcagcatgaataacaaaggcaaccagacccacaagccatactgagtggatacaaaacctatacctaggctgacatcccaaatgtgtgtggcaagttagatgatgatggcacaaaagacagaacaccttgcttctggccattgtcagctcttggaagagagcacacttttagaggagcagctgcaaggagcctgagaacaaaactggaaatgtctgttatgaaagccttcacaggaaattctgcaagtggcaacgtgggtccattccgtgtgtgtcactagagctggcgcaagcccatggccatggtgaggcagcgtttccactggaactaatctgatacctgcaccaactcttgcaactgtgcagtgttcccactgcaaactacggatggggtaaaagactgctcacctcctatttctcatctaatctcacacactctgtttgatgaggctatggagaaacaggtcttctcatacactaaaggtgggagtacaaacaattcaagccctgtgcaggacaattaggcaatacctatcaaaattatacatgatttttcctgctgacccagcaattccacttttgggaataattgacagatataggtgcatatgtacaaaatgatggaaagctctctggtatatattagtaagtgataaaacaaggtgtaaaatagtgtatatatggctactaccttttgttttaaaaatgggggaaaatggtggagcttgcggtgagccgagatcgtgccactgcactccagcctgggcgacagagcgagactccgtctcaaaaaaaaaacagggtggggtgggggggaaataatagtacatactcatatttacctgtatctatataaaacacactatcaaggattcacaagaaactaatacaaatgatccccttatagatggtatgtattgggggatactgaggtgagcagggtataagtggggcaagacttttcagtgtaaacttcttttaaattttattttgatttttgaataatgtaaattaactgtcaaataattaaattaaaaataaccaatttattaacaaaaaaaaaaaaaaaa-3’
本发明一个以上实施例表示：长非编码rnabdnf-as在内分泌耐药乳腺癌组织中高表达并且与mtor信号通路活化状态正相关；同时，还发现长非编码rnabdnf-as表达水平与乳腺癌预后紧密相关；所以长非编码rnabdnf-as可以作为乳腺癌内分泌治疗敏感与否的诊断指标，同时也可以作为乳腺癌发生、发展的独立预后标志。且本发明还发现抑制该长非编码rna的功能能够逆转耐药特性为敏感并抑制肿瘤的发展。所以，本发明所述的长非编码rnabdnf-as可以作为一种肿瘤诊断标志物和治疗靶点。
本发明还提供了一种所述长非编码rnabdnf-as在制备诊断肿瘤或判断乳腺癌治疗预后情况或判断乳腺癌内分泌治疗耐药的产品的应用。
进一步的，能通过所述产品检测样本中的长非编码rnabdnf-as基因表达水平以预测或判断乳腺癌治疗预后情况；且高表达的bdnf-as与乳腺癌的不良预后相关。同时，也能通过产品检测样本中的长非编码rnabdnf-as基因表达水平判断乳腺癌内分泌治疗的耐药性，所述长非编码rnabdnf-as在内分泌耐药的乳腺癌组织中表达水平明显高于内分泌治疗敏感的乳腺癌组织。此外，现有技术研究显示，长非编码rna的表达在不同的组织具有高度特异性，不仅其表达水平与肿瘤发展的不同阶段、不同组织学类型密切相关，可以作为肿瘤检测的特异标志物，而本发明中至少依据长非编码rnabdnf-as在内分泌耐药乳腺癌组织中的高表达能将所述长非编码rnabdnf-as作为一种肿瘤诊断的特异性标志物，以获取是否为内分泌耐药乳腺癌的诊断结果。
在基于长非编码rnabdnf-as预测或判断乳腺癌治疗预后情况的前提下，有助于提高判断预后的准确率，从而有效甄别预后好和预后差的肿瘤，有助于基于判断的预后结果进行针对性治疗，从而避免过度治疗等不适当的治疗方案，提高治疗效果。而基于长非编码rnabdnf-as判断肿瘤对药物的敏感性，有助于针对性的进行治疗，如，使用区别于当前治疗药物的其他治疗药物、方案等，避免盲目的治疗。
进一步的，所述判断乳腺癌治疗预后情况包括判断使用他莫昔芬的乳腺癌患者的预后情况。在本发明的一个实施例中，bdnf-as的表达与使用他莫昔芬的乳腺癌患者的生存率密切相关。
进一步的，所述判断乳腺癌内分泌治疗耐药包括判断乳腺癌他莫昔芬耐药。在本发明的一个实施例中，bdnf-as在他莫昔芬耐药乳腺癌细胞系中的表达明显高于他莫昔芬敏感乳腺癌细胞系中的表达。
进一步的，产品包括芯片、制剂或试剂盒，所述芯片、制剂或试剂盒均为现有技术较为常见的检测产品类型，有助于快速的投入和生产以实际应用在检测长非编码rnabdnf-as表达上。
进一步的，本发明还提供了一种长非编码rnabdnf-as在制备治疗肿瘤的产品的应用。在本发明的一个实施例中，敲低内分泌治疗耐药乳腺癌中的bdnf-as，能使耐药性降低，使原耐药乳腺癌组织对药敏感，从而结合其他治疗肿瘤的药物提高治疗肿瘤的效果。且本发明的另一实施例中，敲低内分泌治疗耐药乳腺癌中的bdnf-as能够抑制肿瘤增殖，即敲低bdnf-as也能直接抑制肿瘤的发展。更进一步的，所述产品包括以长非编码rnabdnf-as为靶点的反义核苷酸lna1和/或反义核苷酸lna2，所述反义核苷酸lna1序列如seqidno.2所示，所述反义核苷酸lna2序列如seqidno.3所示，所述反义核苷酸与长非编码rnabdnf-as上对应的靶序列反向互补。通过反义核苷酸lna1和lna2靶向作用于长非编码rnabdnf-as能够进行bdnf-as的敲低，实现抑制肿瘤增殖的效果。
本发明还提供了一种用于判断乳腺癌预后情况或判断乳腺癌内分泌治疗敏感性的基因标志物，所述基因标志物包括长非编码rnabdnf-as。进一步的，所述长非编码rnabdnf-as序列如seqidno.1所示。基于该基因标志物表达能够预测当前样本中乳腺癌预后情况、判断乳腺癌内分泌治疗敏感性。
本发明还提供了一种组合物，包括以权利要求1所述长非编码rnabdnf-as为靶点的反义核苷酸lna1和/或反义核苷酸lna2，所述反义核苷酸lna1序列如seqidno.2所示，所述反义核苷酸lna2序列如seqidno.3所示。所述反义核苷酸lan1和lan2是针对于长非编码rnabdnf-as的两个靶序列形成的，所述反义核苷酸作用于长非编码rnabdnf-as并敲低，减少bdnf-as的表达，从而逆转乳腺癌内分泌治疗耐药性，恢复其对药敏感性，并抑制肿瘤组织生长。
所述反义核苷酸与长非编码rnabdnf-as上对应的靶序列反向互补。反义核苷酸序列如seqidno.2、seqidno.3所示：
seqidno.2：
lna1:5’-atcgagtcatcgctgt-3’；
seqidno.3：
lna2:5’-cgaacacgtgatagaa-3’；
进一步的，所述组合物还包括他莫昔芬。因为组合物中的反义核苷酸能使对内分泌药物治疗耐药的乳腺癌组织或细胞恢复对药敏感性，从而结合他莫昔芬有助于在提高对药敏感性的同时提供药物，以达到协同治疗肿瘤的目的。
进一步的，组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。即将针对于长非编码rnabdnf-as的两个反义核苷酸作为治疗肿瘤的药物成分之一，有助于通过提高肿瘤组织对药敏感性而提高治疗效果；且仅敲低bdnf-as也会直接抑制肿瘤的增殖，所以基于所述反义核苷酸还能方便与其他药物结合显著提高治疗效果。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：基于长非编码rnabdnf-as在不同乳腺癌组织中的异常表达，尤其是对内分泌治疗耐药的乳腺癌组织与对内分泌治疗敏感的乳腺癌组织之间，通过检测样本中长非编码rnabdnf-as能够帮助判断样本中乳腺癌细胞是否耐药，从而基于耐药的判断实施更为有效的治疗方法，而不是进行盲目的治疗；有助于对症下药，提高治疗效果，避免盲目使用药物带来的较多副作用。同时，由于长非编码rnabdnf-as的表达水平与不良预后紧密相关，所以基于长非编码rnabdnf-as的检测能够实现更为准确的、特异的预后判断，从而基于判断获得的预后结果拟定后续治疗方案，从而避免无效的治疗以及对应花费的资源，同时还能提供适度的治疗，以提升治疗效果和治疗体验。此外，本发明还提供一种敲低长非编码rnabdnf-as的反义核苷酸，通过敲低长非编码rnabdnf-as表达实现乳腺癌耐药的逆转，使其对内分泌治疗药物的敏感性上升，从而提升药物治疗效果；且敲低肿瘤组织中长非编码rnabdnf-as表达还会直接抑制肿瘤生长，结合其他内分泌治疗药物，能够实现协同治疗效果。使得在给药量相同的前提下，提高治疗效果。也有助于减少药量达到同样的治疗效果，从而减少药物对患者的毒害作用，进一步提升治疗效果。即将长非编码rnabdnf-as作为新的肿瘤标志物和治疗靶点，具有肿瘤诊断和/或治疗中的靶点的特异性以及高效性，为肿瘤预后判断和治疗恶性肿瘤提供有力的手段。
附图说明
图1为bdnf-as在乳腺癌内分泌敏感/耐药细胞系中的表达水平示意图；
图2为bdnf-as在内分泌敏感乳腺癌及内分泌耐药乳腺癌组织中的原位杂交图(左)及对应的bdnf-as信号统计图(右)；
图3显示bdnf-as对内分泌耐药乳腺癌的诊断效能(左)以及bdnf-as与乳腺癌总生存率的相关分析(右)；
图4为反义核苷酸对长非编码rnabdnf-as的敲降效果示意图；
图5显示在在他莫昔芬耐药细胞株mcf-7r中敲降bdnf-as后可逆转对他莫昔芬的耐药和抑制肿瘤细胞的生长；
图6显示对mcf-7r移植瘤的荷瘤裸鼠腹腔注射针对长非编码rnabdnf-as的反义核酸可以明显抑制肿瘤的生长。
具体实施方式
下面结合具体的实施案例对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照j.sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及f.m.ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，johnwiley&sons，inc.，1995中所述的方法进行；增殖检测试剂盒的使用依照产品制造商推荐的条件。
实施例1
qpcr检测长非编码rnabdnf-as的表达情况
(1)引物设计：从基因文库ncbi中查到长非编码rnabdnf-as的序列，用primer软件设计引物。
forward：5’-tcacatcttagccccttagcc-3’(seqidno:4)
reverse：5’-tttagcacccaacagaatccc-3’(seqidno:5)
(2)qpcr检测(采用常规的实验条件及步骤)：
检测在乳腺癌内分泌敏感细胞系、乳腺癌内分泌耐药细胞系中长非编码rnabdnf-as的表达水平。如图1所示，其中mcf-7、t47d为他莫昔芬敏感乳腺癌细胞系；mcf-7r、t47dr为他莫昔芬耐药乳腺癌细胞系；长非编码rnabdnf-as在乳腺癌内分泌耐药细胞系中表达明显增高，高于乳腺癌内分泌敏感细胞系中乳腺癌内分泌敏感细胞系的表达。bdnf-as具有特异性，即基于bdnf-as的表达水平，能够检测是否有乳腺癌以及乳腺癌是否为内分泌耐药乳腺癌。有助于实际将bdnf-as作为一种基因标志物，利用其本身或检测其表达的产品至实际临床诊断中，以特异、准确的获取是否耐药的结果，从而便于进行针对性治疗。
实施例2
原位杂交检测长非编码rnabdnf-as在在内分泌敏感乳腺癌及内分泌耐药乳腺癌组织中的表达情况。
步骤包括：
s1、将石蜡包埋的乳腺组织制备组织芯片，进行常规石蜡切片，经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化；
s2、将0.05％胰蛋白酶在室温下作用于s1获得的切片10min以酶解蛋白，然后添加4％多聚甲醛并维持20min以进行固定，最后进行pbs冲洗；
s3、切片在预杂交液中处理2小时，弃预杂交液，用20nm的探针52℃孵育过夜；第二天先用2×ssc洗2遍，每遍5min，再用含50％甲酰胺的2×ssc洗3遍，每遍25min，最后再用pbst洗5遍，每遍5min；
s4、用10％正常山羊血清室温封闭1小时，然后加入抗地高辛抗体(1：1000)，4℃过夜。第三天先用pbst洗5遍，加入相应免疫原的hrp标记二抗并于室温下孵育30min，再用pbst洗3遍；
s5、使用dab显色3min，苏木素复染核1min,纯水冲洗，封片，显微镜下观察结果。
在乳腺癌组织芯片中染色如图2(左)所示，其中棕色为bdnf-as杂交信号显色；对应的bdnf-as信号统计图如图2(右)所示。由图2可以看出，所述长非编码rnabdnf-as的表达在内分泌耐药的乳腺癌组织中明显升高，进一步验证实施例1中的结论，证实了使用bdnf-as作为诊断乳腺癌内分泌治疗耐药的标志物的可靠性。
实施例3
原位杂交检测联合临床病理数据分析长非编码rnabdnf-as在乳腺癌中与肿瘤预后的关系以及对乳腺癌内分泌耐药的诊断效能。
具体的，结果如图3所示，其中图3左图表示bdnf-as诊断内分泌耐药乳腺癌的效能，右图为bdnf-as与乳腺癌总生存率的相关分析(p值具有统计学意义)。
从图3(右)可以看出，在乳腺癌中，与长非编码rnabdnf-as低表达组相比，高表达组的预后明显较差，在天数逐渐增加的状态下，高表达组存活率下降较快，且在同一时间段内存活率显著低于低表达组。而从图3(左)可以看出，bdnf-as对乳腺癌内分泌耐药的诊断具有特异性和高效性(auc＝0.92)。
实施例4
用反义核酸转染肿瘤细胞，24小时后qpcr检测反义核酸对长非编码rnabdnf-as的敲降效果，结果如图4所示，其中scramble为对照组。
如图4显示，两条反义核酸均能够明显减少长非编码rnabdnf-as的表达量。
实施例5
mtt细胞增殖实验检测敲降长非编码rnabdnf-as后对肿瘤细胞增殖及肿瘤细胞对他莫昔芬敏感性的影响。
采用靶向长非编码rnabdnf-as的反义核酸(lna-1:atcgagtcatcgctgt，lna-2:cgaacacgtgatagaa)瞬时转染他莫昔芬耐药乳腺癌细胞mcf-7r；在采用lna-1和lna-2转染肿瘤细胞24h后，按照不同时间点加入mtt试剂，以多功能酶标仪检测细胞增殖活力的变化。检测结果如图5所示，靶向长非编码rnabdnf-as的反义核酸瞬时转染他莫昔芬耐药乳腺癌细胞mcf-7r能逆转对他莫昔芬的耐药和显著抑制细胞的增殖。具体的，图5中sibdnf-as1为lna1，sibdnf-as2为lna2，tam为他莫昔芬，sictl为lna对照组。
从图5中可以看出，通过反义核酸lna-1、lna-2能够降低长非编码rnabdnf-as的表达量，抑制肿瘤的发展。且sictl、sictl tam、sibdnf-as1(2)、sibdnf-as1(2)-tam对应曲线之间的比较清晰的表示：反义核酸能够高效、特异地使肿瘤细胞恢复对内分泌药物的敏感性，逆转对他莫昔芬的耐药并显著抑制肿瘤细胞的增殖活力。
实施例6
动物实验检测敲降长非编码rnabdnf-as后对移植瘤生长的影响。
本实施例主要研究长非编码rnabdnf-as对于肿瘤细胞体内生长的影响；具体的，肿瘤细胞以5×106/0.1mlpbs接种于每只雌性裸鼠第二对乳腺脂肪垫，每组7只。并在肿瘤细胞接种后第7天，当可触及肿瘤时，将反义核酸以10mg/kg的剂量腹腔注射至荷瘤小鼠，其后每3天注射一次，连续治疗三周；然后获得检测结果。
如图6所示，lna1、lna2均表现为敲降长非编码rnabdnf-as后能够显著抑制mcf-7r移植瘤生长。
综上，通过结合临床病理资料、mtt细胞增殖实验和动物实验检测分析发现，长非编码rnabdnf-as在内分泌耐药乳腺癌中特异性高表达，可以作为肿瘤发生发展的独立预后标志物以及内分泌耐药乳腺癌的诊断标志物；且通过反义核酸降低长非编码rnabdnf-as的表达量，能够逆转对他莫昔芬的耐药、显著抑制细胞的增殖，如，在mcf7r移植瘤中显著抑制肿瘤生长。因此，长非编码rnabdnf-as能够作为一种新的肿瘤标志物和治疗靶点，为肿瘤的诊断或者治疗提供新的方法。对应的，lna1、lna2也作为一种新的靶向药物，通过敲低bdnf-as表达实现肿瘤的治疗，或结合其他药物实现协同治疗，其中，肿瘤可以为乳腺癌。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
sequencelisting
<110>中山大学孙逸仙纪念医院
<120>一种长非编码rnabdnf-as及其作为标志物和治疗靶点的应用
<130>
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<213>未知
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tttagcacccaacagaatccc21
1.一种长非编码rnabdnf-as，其特征在于，核苷酸序列如seqidno.1所示。
2.权利要求1所述的长非编码rnabdnf-as在制备诊断肿瘤或判断乳腺癌治疗预后情况或判断乳腺癌内分泌治疗耐药的产品的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述判断乳腺癌内分泌治疗耐药包括判断乳腺癌对他莫昔芬耐药。
4.权利要求1所述的长非编码rnabdnf-as在制备治疗肿瘤的产品的应用。
5.一种用于判断乳腺癌预后情况或判断乳腺癌内分泌治疗敏感性的基因标志物，其特征在于，所述基因标志物包括长非编码rnabdnf-as。
6.根据权利要求5所述的一种基因标志物，其特征在于，长非编码rnabdnf-as序列如seqidno.1所示。
7.一种组合物，其特征在于，包括以权利要求1所述长非编码rnabdnf-as为靶点的反义核苷酸lna1和/或反义核苷酸lna2，所述反义核苷酸lna1序列如seqidno.2所示，所述反义核苷酸lna2序列如seqidno.3所示。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，还包括他莫昔芬。
9.权利要求7所述的组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
技术总结