本发明涉及纳米抗体制备技术领域，尤其是涉及去除半抗原噬菌体展示纳米抗体文库中表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的方法。
背景技术：
1993年hamers-casterman等人发现在骆驼体内存在一种特殊的抗体，命名为重链抗体(heavy-chainantibodies，hcabs)。这种抗体天然缺失轻链，保守区fc片段与常规抗体相同，而重链上缺失重链恒定区ch1，但是可以表现出完整的抗体结合能力。hcabs的抗原结合可变区可以很容易基因克隆得到，这部分为重链单域抗体(vhh)，vhh是目前发现的最小的抗体结合单体，大小为15kda，仅为常规抗体的1/10，为扁长结构，直径约为25nm，长为4nm，比利时ablynx公司又称其为纳米抗体(nbs)。
目前已有的纳米抗体制备方法是利用噬菌体展示技术将抗体展示于丝状噬菌体表面后进行体外筛选。小分子物质由于没有免疫原性，只有反应原性，因此在进行抗体制备时不能直接用于免疫动物制备抗体。需要通过小分子和载体蛋白进行偶联制备完全抗原，然后将完全抗原用弗式佐剂乳化后免疫骆驼科或鲨鱼科动物。然后提取羊驼外周淋巴细胞总rna，设计两对兼并引物，通过pcr扩增两种羊驼体内自然存在的重链抗体免疫球蛋白亚型igg2和igg3的可变区(vhh)基因片段，重组于噬菌粒中并转化至抑制型e.coli感受态细胞，加入辅助噬菌体后重新组装，分泌到体外，形成噬菌体展示纳米抗体文库。
噬菌体展示纳米抗体文库的筛选可以采用固相筛选法。固相筛选法是将抗原靶分子固定于固相介质(免疫管、酶标板等)，加入噬菌体展示纳米抗体文库进行充分结合反应，然后洗涤除去非特异性和低亲和力的噬菌体，洗脱并回收特异性和高亲和力的噬菌体，在e.coli大肠杆菌中扩增后用于下一轮淘选。经过数轮“吸附-洗脱-富集”的生物淘选方法就能够筛选出特异性结合靶标分子的噬菌体展示纳米抗体。
由于小分子物质的纳米抗体制备使用的是小分子和载体蛋白偶联的完全抗原，因此在羊驼血清中，不仅有针对小分子的抗体，也有针对载体蛋白的抗体，而且由于载体蛋白抗原决定簇众多，羊驼血清中载体蛋白的抗体数量远多于小分子抗体。相应的噬菌体展示纳米抗体文库中，针对载体蛋白的纳米抗体也远远多于针对小分子的纳米抗体，而这些数量众多的载体蛋白纳米抗体会严重干扰文库中小分子纳米抗体的筛选。因此在小分子物质纳米抗体筛选过程中，如何高效去除载体蛋白的纳米抗体对于小分子纳米抗体的筛选具有重要意义。
技术实现要素：
本发明提供了一种去除半抗原噬菌体展示纳米抗体文库中表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的方法，包括(1)偶联所述载体蛋白的磁珠与所述半抗原噬菌体展示纳米抗体文库进行孵育获得结合所述表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的磁珠；(2)采用磁性分离去除所述结合所述表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的磁珠，从而去除半抗原噬菌体展示纳米抗体文库中表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体。
可选地，根据上述的方法，所述磁珠为表面带有羧基的磁珠。
可选地，根据上述的方法，所述偶联所述载体蛋白的磁珠中，所述磁珠的羧基总量和所述载体蛋白的质量比为20∶1至5∶1。
可选地，根据上述的方法，所述方法重复步骤(1)-(2)1次以上，如3-6次。
可选地，根据上述的方法，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(bsa)、卵清白蛋白(ova)、人血清白蛋白(has)或血蓝蛋白(klh)。具体可以小分子物质免疫所用完全抗原的偶联蛋白为准。
可选地，根据上述的方法，所述步骤(1)的孵育条件为25-37℃，例如25℃，反应时间为2-3小时，例如3小时，ph值为7.0-9.0，例如ph值为7.4。
可选地，根据上述的方法，采用骆驼科动物或鲨鱼科动物制备所述半抗原噬菌体展示纳米抗体文库。
可选地，根据上述的方法，偶联所述载体蛋白的磁珠通过将所述磁珠和所述载体蛋白轻柔混匀后，反应3小时获得，期间保持所述磁珠的悬浮状态。
上述方法在制备半抗原纳米抗体中的应用也属于本发明的保护范围之内。
上文中，所述半抗原可为不含氨基酸的小分子。
本发明所提供的方法将载体蛋白与带羧基的磁珠进行化学偶联，将构建好的噬菌体展示纳米抗体文库与偶联载体蛋白的磁珠进行孵育，文库中的表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体就可以与磁珠表面偶联的载体蛋白结合，通过磁性分离结合了表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的磁珠，就可以去除文库中的一部分表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体。用新的载体蛋白磁珠将上述步骤重复3-6次，就可以大大降低小分子纳米抗体文库中表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体数量，为后续高效筛选目标小分子纳米抗体提供帮助。
本发明所提供的偶联所述载体蛋白的磁珠，可以有效去除小分子噬菌体展示纳米抗体文库中的表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体，也就是从小分子物质噬菌体展示纳米抗体文库中反向筛选出不必要的表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体，从而提高小分子纳米抗体的筛选效率。
附图说明
图1为阿特拉津半抗原的合成路径。
图2为阿特拉津小分子完全抗原的合成路径。
图3为实施例1的磁珠偶联载体蛋白检验及其结果，左侧图为磁珠偶联载体蛋白检验图，右侧为检验结果的od450nm读数图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
采用excel软件对数据进行处理，实验结果以平均值表示。
下述实施例所使用的酶标仪购置于thermo公司。
下述实施例中所用的试验材料，其中小鼠抗牛血清白蛋白(bsa)单抗购于百奥莱博，辣根过氧化物酶标记的抗m13鼠单抗购于成都阿帕克生物有限公司，羧基磁珠(货号为：70102-50，平均粒径为2μm，浓度为10mg/ml)购于苏州海狸生物医学工程有限公司，其他试剂如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。
下述使用的免疫原制备方法如下：
1.阿特拉津小分子半抗原的合成
1)取7.0g(38.04mmol)三聚氯氰溶于40ml四氢呋喃(thf)，反应体系冷却至-10℃。4.48g(75.93mmol)异丙胺溶于15mlthf，异丙胺溶液缓慢往三聚氯氰溶液里面滴加，滴毕，反应体系升至室温并继续搅拌3小时，薄层色谱tlc(p/e5∶1)监测原料反应完毕。减压浓缩除去大部分thf，反应体系用乙酸乙酯/水分层，收集有机相，有机相用少量0.1nhcl洗涤，有机相干燥浓缩后用石油醚重结晶得白色固体6.8g，收率86.4％。
2)1.0g化合物h1a溶于15mlthf，0.386g(9.65mmol)naoh和0.497g氨基丁酸(4.83mmol)溶于8ml水并于室温条件下往反应体系里面滴加。滴毕，反应体系室温搅拌5小时，tlc(p/e1∶1)检测原料反应完毕，减压浓缩除去大部分thf，反应体系用6nhcl调节ph到酸性，出现大量白色固体，抽滤得到的白色固体用7ml无水乙醇(etoh)打浆5小时，抽滤得白色固体0.81g，收率61.3％，即为阿特拉津半抗原(hapten)。
该阿特拉津半抗原的合成路径如图1所示。
2.阿特拉津小分子完全抗原的合成
1)阿特拉津-bsa完全抗原的合成
5.5mg(20μmol)阿特拉津半抗原溶于0.6ml二甲基甲酰胺(dmf)中，加入12.4mg(60μmol)二环己基碳二亚胺(dcc)和6.9mg(60μmol)n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，室温搅拌18～24小时得到a液；30mgbsa溶于3.0mlpbs(0.01m，ph7.4)缓冲液中，得到b液，将上述a液滴加到b液中并于4℃搅拌10～12小时，得到c液；c液置于透析袋并于pbs(0.01m，ph7.4)缓冲液中透析，每3小时换液一次，共透析6次，收集透析袋中的溶液并分装，-20℃冷藏，即为阿特拉津-bsa完全抗原。
2)阿特拉津-ova完全抗原的合成
阿特拉津-ova完全抗原的合成需要用阿特拉津半抗原与ova偶联，具体操作过程参考前述阿特拉津-bsa完全抗原合成方法。具体用量不同，ova用量10mg，半抗原用量1.87mg，dcc用量1.4mg，nhs用量为0.78mg。
阿特拉津小分子完全抗原的合成路径如图2所示。
下述实施例所使用的阿特拉津噬菌体展示纳米抗体文库制备方法具体如下：
1.动物免疫
取200ug制备的阿特拉津-bsa完全抗原，初次免疫是与完全弗式佐剂等体积混合，4℃磁力搅拌器搅拌过夜，进行乳化。对三周岁雄性羊驼进行颈部以及背部多点注射，每两周免疫一次。从第二次免疫开始乳化使用的佐剂换成弗式不完全佐剂。从六次免疫开始每次免疫前采血1ml，用于羊驼血清效价检测。选取效价最高的一次，间隔7～10天后进行采血建库。
2.总rna提取
选取效价最高的一次免疫后7～10天采血用于建库，采用lifetechnology公司leukolocktotalrna提取试剂盒按照操作手册分离羊驼血液中总rna。
3.cdna第一链的合成
采用invitrogen公司的反转录试剂盒，以上述羊驼血液中总rna合成cdna第一链
4.重链抗体可变区vhh基因的扩增
取igg2和igg3可变区vhh基因各自的简并引物对，以cdna为模板分别进行聚合酶链式反应(pcr)扩增，引物对f、r2用于克隆igg2亚型，引物对f、r1用于igg3亚型的克隆。
引物
引物r1：
引物r2：
反应体系如下：
10xpcr缓冲液5μl
50mmmgso42μl
10mmdntp1μl
10μm引物f1μl
10μm引物r2/r11μl
dna聚合酶0.2μl
cdna2μl
h2o37.8μl
总50μl
pcr程序为：
94℃预变性2min
30个循环：94℃30s；55℃30s；68℃1min
68℃5min
4℃∞
pcr反应体系为50μl体积一个反应，由于骆驼科体内免疫球蛋白igg2和igg3的存在含量比例为3∶2，因此建库时扩增igg2的vhh基因为6个pcr反应，igg3的vhh基因的pcr反应体系为4个。pcr反应结束后，每个pcr管中的产物都进行琼脂糖凝胶电泳分析。
5.凝胶回收重链抗体可变区vhh基因pcr产物
采用qiagen公司的胶回收试剂盒对上述vhh基因的扩增产物进行凝胶回收。
6.vhh基因与载体的酶切
扩增vhh基因的引物上带有sfii酶切位点，噬菌粒载体pcomb3x(biovectorinc.biovector113372)上也带有2个序列不同的sfii酶切位点，因此vhh基因的pcr产物和载体pcomb3x质粒的dna都通过sfii限制性内切酶的酶切而获得黏性末端，即可进行后续的连接反应获得重组质粒。
选择neb公司的sfii内切酶(20u/μl)分别对pcomb3x质粒dna和vhh片段dna进行酶切。酶切反应体系中sfii内切酶的加入量视加入的dna的质量而定，每μgvhh基因dna加入36usfii限制性内切酶；每μgpcomb3x质粒dna加入6usfii限制性内切酶；根据反应总体积加入10×缓冲液和100xbsa，最后加ddh2o定容。酶切条件为50℃反应16h。
vhh基因的酶切产物直接通过qiagen公司的pcr纯化试剂盒纯化，然后用nanodrop测纯化后的产物浓度；pcomb3x质粒酶切反应结束后需要进行凝胶电泳回收载体片段，电泳结束后于紫外灯下快速切下大小为3400bp左右的载体片段，经凝胶回收试剂盒纯化载体片段，最后电泳检测胶回收效果及测浓度。
7.vhh基因片段与载体的连接
选择neb公司的t4连接酶对vhh基因的酶切产物与pcomb3x载体的酶切片段进行连接，pcomb3x载体与vhh基因的连接摩尔比为1∶3，反应体系如下：
10×缓冲液20μl
vhh片段酶切产物0.495μg
pcomb3x酶切产物1.4μg
加ddh2o至总体积为200μl
16℃过夜连接，
8.重组噬菌粒电转
(1)连接产物利用pcr纯化试剂盒纯化，最后使用30μl无菌去离子水洗脱；
(2)取纯化后的连接产物3μl加入到25μle.colier2738感受态细胞中，轻混后全部吸出转移至预冷电转杯(内径为1mm)中，快速放置于电转仪中进行电转化，电击转化的条件为：200ω，18kv，25μf；
(3)电击后，立即加入975μl37℃预热的soc培养基到电转杯中，用移液枪轻轻吸打混匀，转移至摇菌管中，于37℃摇床中250rpm震荡复苏培养1h；
(4)重复电转了10次，每次3μl连接产物，汇集10次转化的菌液并取1ul用无菌水稀释10倍后涂布在lb-amp平板上，于37℃培养箱培养过夜。
9.纳米抗体文库的库容量与多样性鉴定
过夜培养的lb-氨苄平板，通过计单克隆数目计算库容量，10ml转化菌的总克隆数即为所建纳米抗体文库的库容量，库容量＝克隆数x105。
从lb-amp平板上随机挑取20个单克隆，分别接种于1mlsb液体培养基中，加入终浓度为50μg/ml氨苄青霉素，37℃下250rpm震荡培养过夜，次日，送至测序公司进行测序，以gack引物作为测序引物。
10.噬菌体展示纳米抗体文库的构建
(1)复苏培养后的菌液全部转移至200mlsb培养基中，加入200μl50mg/ml氨苄青霉素和200μl20mg/ml四环素，37℃下250rpm震荡培养至od600为0.6左右；
(2)加入1mlm13ko7辅助噬菌体，37℃静置30mm；
(3)250rpm，37℃继续震摇培养2h，加入200μl70mg/ml卡那霉素，37℃下250rpm培养过夜；
(4)次日，将菌液分装于离心瓶中，10000rpm离心15min，收集上清液，该上清液简称噬菌体上清：
(5)转移噬菌体上清至无菌500ml离心瓶中，加入四分之一体积peg/nacl溶液，混匀后置于冰上静置2h，使沉淀噬菌体；
(6)4℃下10000rpm离心20min，弃上清，用10mlpbs缓冲液(含1×蛋白酶抑制剂、0.5％bsa、0.02％nan3)重悬沉淀；
(7)用0.22μm无菌滤器过滤重悬的噬菌体溶液，收集过滤除菌后的噬菌体溶液即为阿特拉津噬菌体展示纳米抗体文库，以下又称原始噬菌体展示纳米抗体文库。该阿特拉津噬菌体展示纳米抗体文库含有表达抗阿特拉津的纳米抗体的噬菌体和表达抗载体蛋白的纳米抗体的噬菌体。
实施例1、采用偶联载体蛋白的磁珠去除文库中的表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体
一、磁珠表面的羧基活化
1、取100μl混匀后的羧基磁珠到1.5ml离心管中，将离心管置于磁性分离架上磁性分离去除上清液，用200μlmest溶液(100mmmes，ph5.0，0.05％tween20，溶剂是水，)洗涤2次，然后磁性分离去除上清液；
2、迅速加入新鲜配制的100μl1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)溶液(10mg/ml，以上述mest溶液作分散剂)和100μln-羟基丁二酰亚胺(nhs)溶液(10mg/ml，以上述mest溶液作分散剂)到装有磁珠的离心管中，漩涡混匀使磁珠充分悬浮，25℃活化30分钟，该期间利用垂直混合仪进行颠倒混匀，以保持磁珠的悬浮状态；经过上述步骤后，磁珠表面的羧基已经活化，可以与带有氨基的载体蛋白进行偶联。活化状态不能长时间保存，应立即进行偶联。
二、磁珠和载体蛋白的偶联
1、将离心管置于磁性分离架上磁性分离去除上清液，加入200μg牛血清白蛋白(bsa，即载体蛋白)，(合适用量以及浓度根据具体的实验进行优化，保持溶液ph约为8.0，同时加入0.05％tween20以提高磁珠的分散性，避免缓冲体系中除载体蛋白以外含有氨基的试剂)轻柔混匀；
2、25℃偶联3小时，偶联期间保持磁珠的悬浮状态；
3、将偶联好的装有磁珠的离心管置于磁性分离架上磁性分离去除上清液，加入200μlpbst溶液(ph7.2)重悬磁珠。
4、磁性分离去除上清液，每次使用200μlpbs(ph7.2)洗涤3次后，重新悬浮于pbs(ph7.2)中获得偶联载体蛋白的磁珠，保存于4℃。
三、检验磁珠和载体蛋白的偶联效果
1、分别取200μl未偶联载体蛋白的磁珠1管和偶联载体蛋白的磁珠2管于1.5ml离心管中，其中未偶联载体蛋白的磁珠作为空白对照，标记为ck；另外两管为偶联载体蛋白的磁珠，分别标记为bsa和0；
2、向ck管和0管中分别加入100μlpbs溶液，bsa管加入bsa浓度为1mg/ml的100μlpbs溶液，然后再分别向这三个管中加入100μl小鼠抗牛血清白蛋白(bsa)单抗，37℃孵育0.5小时；
3、孵育结束后，使用1％pbst洗涤磁珠4次，然后每管中分别加入200μl辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg，37℃，孵育0.5小时；
4、孵育结束后，使用1％pbst洗涤磁珠4次，然后每管中加入200μl3，3′，5，5′-四甲基联苯胺显色液，避光显色10分钟；
5、最后加入100μl1m盐酸终止反应，酶标仪读数od450nm。
实验结果如图3。
实验结果表明，空白孔(ck)的od450nm读数为0.347，对照孔(0)的od450nm读数为4.183，抑制孔(bsa)的od450nm读数为1.354。空白孔(ck)与对照孔(0)吸光度存在差异，说明bsa已经偶联上磁珠。对照孔(0)和抑制孔(bsa)吸光值也存在差异，说明磁珠偶联上的bsa与加入的bsa标样能够竞争抗牛血清白蛋白(bsa)单抗，进一步说明磁珠已经偶联上载体蛋白。
四、采用偶联载体蛋白的磁珠去除文库中的表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体
1、将200μl偶联载体蛋白的磁珠置于1.5ml离心管中，然后置于磁性分离架上磁性分离去除保存液，然后将1ml构建好的阿特拉津噬菌体展示纳米抗体文库加入离心管中，室温下，孵育30分钟，孵育期间利用垂直混合仪进行颠倒混匀，保持磁珠的悬浮状态。完成第一次孵育，磁性分离收集上清液，该上清液为孵育完成的文库。
2、第一次孵育结束后，取100μl孵育完成的文库用于监测文库去除载体蛋白纳米抗体的情况，然后将剩余的孵育完成加入下一个装有新的偶联载体蛋白磁珠的离心管中，再次进行孵育30分钟，磁性分离收集上清液，依次重复孵育6次。每次孵育后的文库用酶联免疫吸附实验(elisa)检测文库中表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的去除效果。
酶联免疫吸附实验(elisa)方法具体如下：
1、用包被缓冲液(0.05mol/l碳酸盐缓冲液，ph为9.6)配制1μg/ml的载体蛋白bsa，包被酶标板，100μl/孔，然后37℃孵育3小时。
2、弃上清液，用1％pbst洗板4次。
3、将原始噬菌体展示纳米抗体文库以及6轮孵育去除表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的文库用pbst稀释100倍后，加入酶标板中，100μl/孔，37℃孵育1小时。
4、弃上清液，1％pbst洗板4次。
5、加入辣根过氧化物酶标记的抗m13鼠单抗(hrp)(1∶10000)，100μl/孔，37℃孵育1小时。
6、弃上清液，1％pbst洗板4次。
7、加入3，3′，5，5′-四甲基联苯胺显色液，100μl/孔，避光显色10分钟。
8、加入1m盐酸终止反应，50μl/孔，酶标仪读数od450nm。
实验结果见表1。
表1载体蛋白磁珠与文库孵育后文库中载体蛋白抗体的检测
实验结果表明，阿特拉津噬菌体展示纳米抗体文库与偶联载体蛋白的磁珠孵育六轮以后，od450nm值逐步降低，这表明文库中表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体依次减少。证明本发明所提供的偶联载体蛋白的磁珠对去除小分子噬菌体展示纳米抗体文库中的表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体有显著效果。
实施例2、小分子纳米抗体筛选
一、小分子纳米抗体筛选过程
(一)经过磁珠孵育的小分子纳米抗体筛选
1、将阿特拉津噬菌体展示纳米抗体文库与实施例1制备的偶联载体蛋白的磁珠在室温下孵育6次，孵育方式按照实施例1步骤四进行，得到孵育过后的文库；
2、用包被缓冲液(0.05mol/l碳酸盐缓冲液，ph为9.6)配制1μg/ml的阿特拉津-ova包被酶标板，100μl/孔，4℃，包被过夜，次日弃去酶标板中包被过夜的上清，用0.1％pbst洗板3次；
3、在包被阿特拉津-ova的孔中加入用磷酸缓冲液(ph7.4，0.01mol/l)稀释10倍的步骤1的孵育过后的文库，37℃孵育2小时，然后用1％pbst洗板10次；
4、加入100μl1000ng/ml阿特拉津标准品溶液，室温震摇反应1小时；
5、收集上清液即为洗脱产物，将洗脱产物加入2mlod600nm为0.6-1.0的er2738大肠杆菌中，37℃静置30分钟，然后补加6mlsb培养基(其中氨苄终浓度为50μg/ml)，37℃220rpm震荡2小时；
6、然后加入1ml辅助噬菌体m13ko7，补加91mlsb培养基(其中氨苄终浓度为50μg/ml)，37℃培养2小时后，加入卡那霉素(终浓度为70μg/ml)，培养过夜；
7、次日1000rpm离心15分钟，取上清液(该上清液为扩增后的表达阿特拉津纳米抗体的噬菌体，以下简称步骤7的上清液)进行间接酶联免疫吸附实验。
(二)未经过磁珠孵育的小分子纳米抗体筛选
1、用包被缓冲液(0.05mol/l碳酸盐缓冲液，ph为9.6)配制1μg/ml的阿特拉津-ova包被酶标板，100μl/孔，4℃，包被过夜，次日弃去酶标板中包被过夜的上清，用0.1％pbst洗板3次；
2、在包被阿特拉津-ova的孔中加入用磷酸缓冲液(ph7.4，0.01mol/l)稀释10倍的原始噬菌体展示纳米抗体文库，37℃孵育2小时，然后用1％pbst洗板10次；
3、加入100μl1000ng/ml阿特拉津标准品溶液，室温震摇反应1小时；
4、收集上清液即为洗脱产物，将洗脱产物加入2mlod600nm为0.6-1.0的er2738大肠杆菌中，37℃静置30分钟，然后补加6mlsb培养基(其中氨苄终浓度为50μg/ml)，37℃220rpm震荡2小时；
5、然后加入1ml辅助噬菌体m13ko7，补加91mlsb培养基(其中氨苄终浓度为50μg/ml)，37℃培养2小时后，加入卡那霉素(终浓度为70μg/ml)，培养过夜；
6、次日1000rpm离心15分钟，取上清液(该上清液为扩增后的表达阿特拉津纳米抗体的噬菌体，以下简称步骤8的上清液)进行间接酶联免疫吸附实验。
二、上清液间接酶联免疫吸附实验
分为4个处理组，对照组、抑制组、ova组和bsa组。
1、对照组用包被缓冲液(0.05mol/l碳酸盐缓冲液，ph为9.6)配制1μg/ml阿特拉津-ova包被酶标板的反应孔，100μl/孔，37℃孵育3小时；抑制组用包被缓冲液(0.05mol/l碳酸盐缓冲液，ph为9.6)配制1μg/ml阿特拉津-ova包被酶标板的反应孔，100μl/孔，37℃孵育3小时；ova组用包被缓冲液(0.05mol/l碳酸盐缓冲液，ph为9.6)配制1μg/mlova(卵白蛋白)包被酶标板的反应孔，100μl/孔，37℃孵育3小时；bsa组用包被缓冲液(0.05mol/l碳酸盐缓冲液，ph为9.6)配制1μg/ml载体蛋白bsa包被酶标板的反应孔，100μl/孔，37℃孵育3小时。
2、1％pbst洗板4次。
3、ova组、bsa组以及对照组的反应孔中分别加入50μl磷酸缓冲液(ph7.4，0.01mol/l)，抑制组的反应孔中加入50μl含有1000ng/ml阿特拉津标准品的磷酸缓冲液(ph7.4，0.01mol/l)，再向对照组、抑制组、ova组和bsa组的反应孔中分别加入上述制备的步骤7的上清液和步骤8的上清液，50μl/孔，37℃孵育1小时。
4、弃去上清液，1％pbst洗板4次。
5、每反应孔加入100μl辣根过氧化物酶标记的小鼠抗m13抗体(hrp)(1∶10000)，37℃孵育1小时。
6、弃去上清液，1％pbst洗板4次。
7、加入3，3′，5，5′-四甲基联苯胺显色液，100μl/孔，避光显色10分钟。
8、加入1m盐酸终止反应，50μl/孔，酶标仪读数od450nm。
实验结果见表2。
表2上清液检测(吸光值od450nm)
注：步骤7的上清液为去除载体蛋白抗体文库竞争筛选、扩增后上清液；步骤8的上清液为未去除载体蛋白抗体文库竞争筛选、扩增后上清液。
实验结果表明，在经过载体蛋白磁珠孵育、竞争筛选、扩增后文库上清液的对照组、抑制组、bsa组吸光值与未经载体蛋白磁珠孵育、竞争筛选、扩增后的文库上清液各组吸光度值之间差异明显。bsa组的显色值从3.122降到1.011，表明经载体蛋白磁珠处理过的文库淘洗、扩增后，上清液中载体蛋白抗体的数量大大下降，这进一步印证了实施例1中的去除载体蛋白抗体的效果。相应的ova组的显色值也由1.784降低为0.529。抑制率((对照组od450nm-抑制组od450nm)/对照组od450nm)从11.30％上升到22.20％。说明处理后的上清液中小分子纳米抗体数量相对含量更高。上清液中载体蛋白纳米抗体的去除有利于之后阿特拉津纳米抗体的筛选。
三、文库阳性克隆鉴定
1、从经过磁珠孵育以及未经过磁珠孵育的阿特拉津噬菌体展示纳米抗体文库竞争筛选后的文库滴度平板上分别随机选取20个克隆菌落(即完成步骤(一)的1-5处理的大肠杆菌梯度稀释后涂布的平板上的菌落和完成步骤(二)的1-4处理的大肠杆菌梯度稀释后涂布的平板上的菌落)，将克隆菌落接种于3mlsb培养基中活化，加入3μl100mg/ml氨苄青霉素溶液，37℃下，220rpm培养至od600nm为0.6至0.8，分别加入10μl辅助噬菌体m13ko7静置30分钟之后，继续震荡培养2小时，加入3μl70mg/ml卡那霉素溶液，37℃220rpm培养过夜。次日4℃，10000rpm离心5分钟，然后取上清液备用。
2、分为4个处理组，对照组、抑制组、ova组和bsa组。对照组用包被缓冲液(0.05mol/l碳酸盐缓冲液，ph为9.6)配制1μg/ml阿特拉津-ova包被酶标板的反应孔，100μl/孔，37℃孵育3小时；抑制组用包被缓冲液(0.05mol/l碳酸盐缓冲液，ph为9.6)配制1μg/ml阿特拉津-ova包被酶标板的反应孔，100μl/孔，37℃孵育3小时；ova组用包被缓冲液(0.05mol/l碳酸盐缓冲液，ph为9.6)配制1μg/mlova包被酶标板的反应孔，100μl/孔，37℃孵育3小时；bsa组用包被缓冲液(0.05mol/l碳酸盐缓冲液，ph为9.6)配制1μg/ml载体蛋白bsa包被酶标板的反应孔，100μl/孔，37℃孵育3小时。
3、弃去上清液，1％pbst洗板4次。
4、ova组、bsa组以及对照组的反应孔中分别加入50μl磷酸缓冲液(ph7.4，0.01mol/l)，抑制组的反应孔中加入50μl含有1000ng/ml阿特拉津标准品的磷酸缓冲液(ph7.4，0.01mol/l)。再向对照组、抑制组、ova组和bsa组的反应孔中加入步骤1中的上清液，50μl/孔，37℃孵育1小时。
5、弃去上清液，1％pbst洗板4次。
6、加入辣根过氧化物酶标记的小鼠抗m13抗体(hrp)(1∶10000)，100μl/孔，37℃孵育1小时。
7、弃去上清液，1％pbst洗板4次。
8、加入3，3′，5，5′-四甲基联苯胺显色液，100μl/孔，避光显色10分钟。
9、加入1m盐酸中止反应，50μl/孔，读od450nm，统计对阿特拉津有抑制的单克隆数量。
实验结果见表3。
表3载体蛋白磁珠孵育、未孵育之后竞争筛选滴度平板挑取的单克隆鉴定
实验结果表明，经过载体蛋白磁珠孵育、竞争筛选之后的文库滴度平板上随机挑取的20个克隆中显示有抑制的单克隆(即为阿特拉津纳米抗体)数量为16个，占比80％；未经过载体蛋白磁珠孵育、竞争筛选之后的文库滴度平板上随机挑取的20个克隆中有抑制的单克隆数量为5个，占比25％。这说明在经过载体蛋白磁珠孵育去除载体蛋白纳米抗体之后，能够大大提高随后小分子纳米抗体的筛选效率，更有利于筛选得到目标小分子的纳米抗体。小分子噬菌体纳米抗体库中载体蛋白纳米抗体的去除减少了筛选过程中载体蛋白抗体的干扰，有利于筛选得到小分子纳米抗体，提高筛选效率。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
1.去除半抗原噬菌体展示纳米抗体文库中表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的方法，其特征在于：包括
(1)偶联所述载体蛋白的磁珠与所述半抗原噬菌体展示纳米抗体文库进行孵育获得结合所述表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的磁珠；
(2)采用磁性分离去除所述结合所述表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的磁珠，从而去除半抗原噬菌体展示纳米抗体文库中表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述磁珠为表面带有羧基的磁珠。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述偶联所述载体蛋白的磁珠中，所述磁珠的羧基总量和所述载体蛋白的质量比为20∶1至5∶1。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法重复步骤(1)-(2)1次以上。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)的孵育条件为25-37℃，反应时间为2-3小时，ph值为7.0-9.0。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：采用骆驼科动物或鲨鱼科动物制备所述半抗原噬菌体展示纳米抗体文库。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法在制备半抗原纳米抗体中的应用。
技术总结