本发明涉生物化工
技术领域：
，尤其涉及一种表面改性材料及其制备方法和在酵母细胞吸附与聚集生长中的应用。
背景技术：
：固定化技术是一种通过物理或化学的方法将游离于培养基中的细胞或酶限定在特定的空间区域内，使其既能保持原本的代谢催化能力又具有反复利用的优势。固定化技术根据其固定化方法的区别可分为吸附固定法、交联固定法和包埋固定法。与传统的游离发酵相比，固定化技术以其高效的处理效率、极强的稳定性、极高的生物密度、优秀的环境抗性、良好的分离能力和可持续使用等优点开辟了生物发酵生产的新篇章。基于生物被膜固定化连续发酵技术，其特征是基于微生物细胞具有在固定化载体表面形成生物被膜的能力，微生物细胞主动吸附到固定化载体表面，在载体表面进行生长，成熟，扩散，瓦解，如此循环往复，实现生物被膜的自我更新，实现真正意义上的可循环、连续化发酵。与传统固定化连续发酵相比，基于生物被膜固定化连续发酵的优势如下：(1)细胞的固定化方式不同，生物被膜细胞直接吸附在载体表面，自行合成胞外聚合物，不断发展生长，形成生物被膜，而传统包埋固定化的细胞处于载体内部，其生长发育受制于载体的空间大小；(2)细胞的空间环境不同，生物被膜细胞粘附在固定化载体表面，直接与发酵液接触，在工业生产中不存在传质的问题，而包埋固定化由于细胞被海藻酸钙、卡拉胶、琼脂等物质包埋，在发酵过程中因为浓度极差的影响而导致细胞处于相对饥饿的状态；(3)细胞的发酵能力不同，无论是在环境抗性还是在最终产量和发酵效率上，生物被膜固定化细胞的发酵能力是传统固定化细胞远远达不到的。现有的生物被膜固定化技术中，通常是通过对微生物进行改造以改善微生物细胞在固定化载体表面的吸附能力，鲜有通过对固定化载体进行修饰的方式提高细胞吸附能力的尝试。本发明通过对固定化载体材料表面进行改性修饰，从而提高固定化载体对微生物细胞的吸附能力，进而提升微生物细胞固定化的效率，提升产能。技术实现要素：发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种表面改性材料。本发明还要解决的技术问题是提供上述表面改性材料的制备方法。本发明进一步要解决的技术问题是提供上述表面改性材料的应用。发明思路：基于酿酒酵母细胞具有在载体表面吸附生长并形成生物被膜的能力，本发明通过对材料表面进行改性修饰，改性修饰后的材料更有利于酵母细胞吸附与聚集生长，在酵母细胞吸附培养过程中加入经过表面改性修饰的材料，可以使更多的酵母细胞在材料表面吸附和聚集，这一优势可应用于酵母细胞固定化连续发酵过程中，进而缩短每一批次发酵时长，降低生产成本，提高终产物的产率。为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种表面改性材料，其具有巯基官能团、苯环官能团和氨基官能团中的任意一种或几种组合；优选地，所述表面改性材料的表面具有巯基官能团和/或苯环官能团；进一步优选地，所述表面改性材料的表面具有巯基官能团。其中，所述巯基官能团优选为巯基。其中，所述苯环官能团优选为苯环。其中，所述氨基官能团优选为氨基。其中，所述材料为玻璃片、棉纤维、聚酯纤维、尼龙纤维、木浆棉、聚乳酸、活性炭、聚乙烯、聚乙烯醇、聚氨酯、粘土、金属和陶瓷中的任意一种；优选地，所述材料为玻璃片和棉纤维；进一步优选地，所述材料为棉纤维。为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述表面改性材料的制备方法，即利用生物法、化学法、物理法中的任意一种或几种的组合法对所述材料表面进行改性修饰，使材料表面具有巯基官能团、苯环官能团、氨基官能团中的任意两种或三种的组合。其中，所述表面改性材料的制备方法具体为采用改性化合物对材料进行改性。其中，所述改性化合物为含巯基官能团的化合物、含苯环官能团的化合物、含氨基官能团的化合物中的任意一种或几种组合，和/或含有巯基官能团、苯环官能团和氨基官能团中任意两种或三种组合的化合物。其中，所述含巯基官能团的化合物优选为含巯基的硅烷，进一步优选为巯丙基三乙氧基硅烷。其中，所述含苯环官能团的化合物优选为含苯环的硅烷，进一步优选为苯基三乙氧基硅烷。其中，所述含氨基官能团的化合物优选为含氨基的硅烷，进一步优选为3-氨丙基三乙氧基硅烷。其中，当所述材料为玻璃片时，所述表面改性材料的制备方法包括如下步骤：(1)将玻璃片浸泡于硫酸与双氧水的混合溶液中，浸泡后取出洗净；(2)将步骤(1)所得玻璃片浸入乙醇溶液中，加入改性化合物，震荡，取出洗净，即得。步骤(1)中，所述玻璃片先通过乙醇超声清洗。步骤(1)中，所述混合溶液中硫酸与双氧水的体积比为4-10：3；优选地，所述硫酸与双氧水的比为7：3。步骤(1)中，所述浸泡的时间为1-5h；优选地，所述浸泡的时间为3h。步骤(2)中，所述乙醇溶液的溶剂为水。步骤(2)中，所述乙醇溶液中乙醇的体积占比为90％-99％；优选地，所述乙醇溶液中乙醇的体积占比为95％。步骤(2)中，所述改性化合物的用量为0.1-3.9ml/6片玻璃片；优选地，所述改性化合物的用量为2ml/6片玻璃片。步骤(2)中，所述震荡的温度为20-40℃；优选地，所述震荡的温度为30℃。步骤(2)中，所述震荡的转速为20-180rpm。步骤(2)中，所述震荡的时间为12-36h；优选地，所述震荡的时间为24h。其中，当所述材料为棉纤维时，所述表面改性材料的制备方法包括如下步骤：将棉纤维浸润后与改性化合物震荡反应。其中，所述棉纤维通过乙醇溶液浸润；其中，所述乙醇溶液的溶剂为水；其中，所述乙醇溶液中乙醇的体积占比为90％-99％；优选地，所述乙醇溶液中乙醇的体积占比为95％。其中，所述棉纤维与乙醇溶液的用量比为1：5-15g/ml；优选地，所述棉纤维与乙醇溶液的用量比为1：10g/ml。其中，所述棉纤维与改性化合物的质量比为2-8：1；优选地，所述棉纤维与改性化合物的质量比为5：1。其中，所述震荡的温度为20-40℃；优选地，所述震荡的温度为30℃。其中，所述震荡的转速为20-180rpm。其中，所述震荡的时间为12-36h；优选地，所述震荡的时间为24h。为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了上述表面改性材料的应用。其中，所述应用为所述表面改性材料在酵母细胞吸附与聚集生长中的应用，因为所述表面改性材料有利于酵母细胞吸附生长即表面改性的材料表面可以吸附更多的酵母细胞。优选地，所述应用为将所述表面改性材料在酵母细胞固定化发酵中的应用。进一步优选地，所述应用为将所述表面改性材料在酵母细胞固定化发酵产乙醇中的应用。更进一步优选地，所述应用为将所述表面改性材料在酿酒酵母细胞固定化发酵产乙醇中的应用。其中，所述酿酒酵母包括但不限于保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心的编号为cgmcc1308。其中，所述表面改性材料作为固定化载体进行固定化发酵。其中，所述表面改性材料的用量为1-100g/l发酵培养基；优选地，所述表面改性材料的用量为40-60g/l发酵培养基；进一步优选地，所述表面改性材料的用量为40g/l发酵培养基。其中，所述固定化发酵为将酵母细胞种子液按1％-10％的体积比接种于含有表面材料的发酵培养基中进行发酵。其中，所述固定化发酵为固定化连续发酵；所述固定化连续发酵为在发酵的起始阶段向发酵液中加入固定化材料，待每一批发酵结束后，放出发酵液并保留固定化载体，之后补入新鲜的发酵培养基，开始下一批发酵，如此循环往复至固定化连续发酵结束。其中，所述的固定化连续发酵可连续进行20-30批次；优选地，所述的固定化连续发酵可连续进行25批次。其中，所述放出发酵液为放出部分或全部的发酵液；优选地，所述放出发酵液为放出95％v/v以上的发酵液；进一步优选地，所述放出发酵液为放出全部发酵液。其中，所述补入新鲜的发酵培养基与放出发酵液的体积相同。其中，所述固定化发酵过程中，葡萄糖的含量为5-300g/l；优选地，葡萄糖的含量为60-200g/l；进一步优选地，葡萄糖的含量为200g/l；更进一步优选地，所述固定化发酵过程中，发酵培养基的配方为：葡萄糖200g/l、胰蛋白胨4g/l、酵母粉3g/l、磷酸二氢钾3g/l、硫酸铵4g/l、硫酸镁0.5g/l、七水合硫酸锌0.05g/l、七水合硫酸亚铁0.05g/l，溶剂为水。其中，所述固定化发酵的温度为25-35℃；优选地，所述固定化发酵的温度为28-30℃。其中，所述固定化发酵过程中，所述发酵培养基中留糖的含量为1g/l以下时，表示该批次发酵结束。有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：(1)本发明将酵母细胞与表面改性材料共培养时，表面改性材料更有利于酵母细胞吸附和聚集生长。(2)本发明将表面改性材料应用于固定化连续发酵过程中，可有效提升酵母细胞在固定化载体表面吸附生长的能力。(3)本发明所提供的表面改性材料可缩短每一批次的发酵时间，同时提高终产物的产率，前五批的平均发酵时间为30h，乙醇的产率为2.611g·l-1·h-1(巯基改性)、2.51g·l-1·h-1(苯环改性)、2.55g·l-1·h-1(氨基改性)，且在发酵第25批次时，乙醇的产率分为6.38g·l-1·h-1(巯基改性)、5.40g·l-1·h-1(苯环改性)、4.70g·l-1·h-1(氨基改性)。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。图1为40×显微镜下，酿酒酵母1308分批培养中酵母细胞在载玻片上的吸附与聚集状况，其中a为未改性的材料，b为经巯基修饰改性的材料，c为经苯环修饰改性的材料，d为经氨基修饰改性的材料。图2为酿酒酵母1308固定化连续发酵过程中乙醇的产量。图3为酿酒酵母1308固定化连续发酵25批次后，在40×显微镜下观察固定化载体材料上所吸附的酵母细胞，其中a为未改性的材料，b为经巯基修饰改性的材料，c为经苯环修饰改性的材料，d为经氨基修饰改性的材料。具体实施方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下述实施例中所选用的酵母细胞为工业生产乙醇常用的酿酒酵母，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心的编号为cgmcc1308。下述实施例中所述培养基组分如表1和表2所示。表1.液体ypd培养基组分(溶剂为水)液体ypd培养基组分浓度(g/l)胰蛋白胨20酵母粉10葡萄糖20表2.发酵培养基组分(溶剂为水)发酵培养基组分浓度(g/l)葡萄糖200胰蛋白胨4酵母粉3磷酸二氢钾3硫酸铵4硫酸镁0.5七水合硫酸锌0.05七水合硫酸亚铁0.05下述实施例中所述乙醇的“％”均指体积百分比。下述实施例中所述浓h2so4为质量分数为70％。下述实施例中所述残留糖浓度的测定方法为dns法：(1)将所取的样品进行离心，取500μl上清液，置于10ml离心管中；(2)取500μl已经配置好的dns试剂加入步骤(1)所述离心管中，沸水浴反应5min后立即置于冰水浴中，使其冷却至室温，并添加纯水定容至5ml；(3)利用紫外分光光度计测定其在540nm处的吸光值。下述实施例中所述乙醇产量的测定方法为气相色谱法：(1)所取样品在气相检测前先离心，然后取1～1.5ml上清液经0.22μm滤膜过滤后利用气相色谱仪检测乙醇的产量(2)采用气相色谱仪(7890agc-system，agilenttechnologies,usa)分析样品中乙醇的浓度；气相色谱条件如下：hp-innowax毛细管色谱柱，peg-20m，60m×0.25mm×0.5μm；柱温采用程序升温法：初始70℃，保持0.5min后以20℃·min-1的速度升至190℃，保持4min，柱流量1.0ml·min-1，尾吹流速29ml·min-1，氢气流速30ml·min-1，空气流速300ml·min-1。前进样口温度180℃，fid温度220℃，进样量1.0μl，分流比90：1。实施例1.基于玻璃片的表面改性材料的制备(1)载玻片预处理：将18片普通的载玻片置于95％乙醇中，于超声清洗仪中超声清洗15min；(2)将步骤(1)中所述已预处理过的载玻片浸入浓h2so4-h2o2混合溶液中浸泡3h，其中浓h2so4与h2o2的体积比为7：3，浸泡后的载玻片用去离子水清洗干净后置于95％乙醇中保存备；(3)将步骤(2)中所述载玻片分3组，每组6片载玻片，分别浸入100ml95％乙醇中，每组载玻片中分别加入2ml巯丙基三乙氧基硅烷(巯基改性)、2ml3-氨丙基三乙氧基硅烷(氨基改性)、2ml苯基三乙氧基硅烷(苯环改性)；保证各载玻片均与混合液充分接触，但不能出现两片或多片贴合；(4)将步骤(3)中所述装有载玻片的容器置于30℃，100rpm条件下震荡24h后取出，并用去离子水冲洗干净，即为经过巯基改性、氨基改性、苯环改性的玻璃片，保存备用。实施例2.基于棉纤维材料的表面改性材料的制备(1)取三组50g清洗干净的棉纤维材料，分别置于三个1l三角瓶中，每组棉纤维材料中分别加入500ml95％乙醇，充分浸润棉纤维材料；(2)向步骤(1)中所述三组含有棉纤维材料的三角瓶中分别加入10g巯丙基三乙氧基硅烷(巯基改性)、10g3-氨丙基三乙氧基硅烷(氨基改性)、10g苯基三乙氧基硅烷(苯环改性)；(3)将步骤(2)中所述的装有棉纤维材料的三角瓶置于30℃，150rpm摇床中震荡24h后取出，并用去离子水冲洗干净，即为经过巯基改性、氨基改性、苯环改性的棉纤维材料，保存备用。实施例3.观察酵母细胞与未改性材料间的生物相容性(1)在无菌超净工作台中，取10μl保藏于-80℃的酿酒酵母1308甘油菌液滴加在ypd固体平板上，利用接种环进行划线活化，划线后的平板置于30℃恒温培养箱中培养至单菌落长出；(2)在无菌超净工作台中挑取酿酒酵母1308单菌落，接种于5ml液体ypd培养基中，于30℃，180rpm条件下培养16h，得到酿酒酵母1308种子液；(3)按照表2所示发酵培养基组分配置发酵培养基，分装在100ml蓝盖螺口瓶中，装液量为50ml，瓶口用一次性封口膜封口，于115℃，0.12mpa条件下灭菌20min；(4)将步骤(2)中所述酿酒酵母1308种子液以5％的体积比转接至发酵培养基中，在接种时向每一发酵培养基中加入一片未改性的载玻片，于30℃，150rpm条件下发酵培养；(5)步骤(4)中所述发酵培养进行28h时，取样观察。在取样前15min，向发酵瓶中滴加500μl质量比为1％的亚甲基蓝进行染色，30℃，150rpm条件下继续培养至28h取出载玻片；(6)取出的载玻片在去离子水中轻柔晃动6-8次，去掉载玻片表面未吸附的游离细胞，室温下自然晾干后置于40×显微镜下观察酵母细胞在载玻片表面的吸附状况。实施例4.观察酵母细胞与巯基化改性材料间的生物相容性实施例4同实施例3一致，所不同的是步骤(4)中，在酿酒酵母1308种子液转接至发酵培养基是向每一发酵培养基中加入一片经过巯基化改性修饰的载玻片。实施例5.观察酵母细胞与氨基化改性材料间的生物相容性实施例5同实施例3一致，所不同的是步骤(4)中，在酿酒酵母1308种子液转接至发酵培养基时向每一发酵培养基中加入一片经过氨基化改性修饰的载玻片。实施例6.观察酵母细胞与苯环化改性材料间的生物相容性实施例6同实施例3一致，所不同的是步骤(4)中，在酿酒酵母1308种子液转接至发酵培养基时向每一发酵培养基中加入一片经过苯环改性修饰的载玻片。上述实施例3-6中，各载玻片表面吸附状况如图1(a为未改性的材料，b为经巯基修饰改性的材料，c为经苯环修饰改性的材料，d为经氨基修饰改性的材料)所示。由图可知，未经过表面改性材料的表面经过冲洗去除游离细胞后，所残留的酵母细胞极少，并且所残留的细胞都以单个细胞的形式存在；经过表面改性的材料表面经冲洗去除游离细胞后，表面残留的细胞明显多于未经过改性的材料，并且80％以上的细胞是以多个细胞聚集的形式存在的，其中经巯基、苯环改性的材料这一现象最为明显。上述现象说明，经过表面改性的材料对酵母细胞具有更强的吸附能力。实施例7.未改性材料在固定化连续发酵生产乙醇中的应用(1)在无菌超净工作台中，取10μl保藏于-80℃的酿酒酵母1308甘油菌液滴加在ypd固体平板上，利用接种环进行划线活化，划线后的平板置于30℃恒温培养箱中培养至单菌落长出；(2)在无菌超净工作台中利用接种环刮取2-3环菌泥接种至200ml液体ypd培养基中，在30℃，180rpm条件下培养12h，得到酿酒酵母1308种子液；(3)按照表2所示发酵培养基组分配置发酵培养基，分装在250ml三角瓶中，装液量为100ml；(4)取40g/l未经过改性修饰的棉纤维作为固定化材料(固定化材料的终浓度为40g/l)加入步骤(3)所述发酵培养基中，三角瓶口用8层纱布进行封口，将含有固定化材料的发酵培养基置于115℃，0.12mpa条件下灭菌20min；(5)将步骤(2)中所述酿酒酵母1308种子液以5％的体积比转接至步骤(4)所述含有固定化材料的发酵培养基中，于30℃，180rpm条件下发酵培养；(6)步骤(5)的发酵过程中，当发酵液中残留糖的含量低于1g/l时，第一批次发酵结束，于超净工作台中放出全部的发酵液，仅保留固定化材料在三角瓶中，之后向保留有固定化材料的三角瓶中加入新鲜的发酵培养基，于30℃，180rpm条件下继续发酵培养，即为第二批次发酵；(7)重复步骤(6)，固定化连续发酵共进行25批次。其中，发酵过程中分别在每一批次的12h、18h、24h和30h取样，检测残留糖的含量以及产物乙醇的含量。其中，经过25批次连续化发酵后，取出棉纤维载体材料，用剪刀剪取少许棉纤维载体材料置于载玻片上于40×显微镜下观察棉纤维载体上所吸附的酵母细胞。实施例8.巯基化表面改性材料在固定化连续发酵生产乙醇中的应用实施例8同实施例7一致，所不同的是步骤(4)中，在酿酒酵母1308种子液转接至发酵培养基时，将40g/l未改性的棉纤维更换为40g/l经过巯基化改性修饰的棉纤维作为固定化载体。实施例9.氨基化表面改性材料在固定化连续发酵生产乙醇中的应用实施例9同实施例7一致，所不同的是步骤(4)中，在酿酒酵母1308种子液转接至发酵培养基时，将40g/l未改性的棉纤维更换为40g/l经过氨基化改性修饰的棉纤维作为固定化载体。实施例10.苯环化表面改性材料在固定化连续发酵生产乙醇中的应用实施例10同实施例7一致，所不同的是步骤(4)中，在酿酒酵母1308种子液转接至发酵培养基时，将40g/l未改性的棉纤维更换为40g/l经过苯环改性修饰的棉纤维作为固定化载体。上述实施例7-10中，各发酵结果如表1和表2，以及图2(每一批次中，从左到右依次是未改性、氨基改性、巯基改性和苯环改性)和图3(a.未改性、b.巯基改性、c.苯环改性、d.氨基改性)所示。由图3可知，经过25批次固定化连续发酵以后，棉纤维载体表面吸附了大量的酵母细胞，其中经过表面改性的材料表面所吸附的酵母细胞明显多于未经过表面改性的材料，这一现象说明表面改性材料可以应用到酵母细胞固定化连续发酵过程中，即使经过多批次发酵之后，经过表面改性的固定化载体对酵母细胞依然具有很强的吸附能力。表3.未改性与改性材料在固定化连续发酵过程中乙醇的产量(g/l)未改性氨基改性巯基改性苯环改性第5批73.8176.7278.3375.25第10批74.9977.0779.9176.1第15批73.2575.8379.3477.58第20批72.8573.2177.7675.36第25批70.2875.1676.5675.63表4.未改性与改性材料在固定化连续发酵过程中每批次发酵时间(h)未改性氨基改性巯基改性苯环改性第5批32303030第10批28272627第15批25232122第20批21171516第25批19161214本发明提供了一种表面改性材料及其制备方法和在酵母细胞吸附与聚集生长中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种表面改性材料，其特征在于，其具有巯基官能团、苯环官能团和氨基官能团中的任意一种或几种组合。
2.根据权利要求1所述表面改性材料，其特征在于，所述材料为玻璃片、棉纤维、聚酯纤维、尼龙纤维、木浆棉、聚乳酸、活性炭、聚乙烯、聚乙烯醇、聚氨酯、粘土、金属和陶瓷中的任意一种。
3.权利要求1或2所述表面改性材料在酵母细胞吸附与聚集生长中的应用。
4.权利要求1或2所述表面改性材料在酵母细胞固定化发酵中的应用。
5.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述表面改性材料在酵母细胞固定化发酵产乙醇中的应用。
6.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述表面改性材料作为固定化载体进行固定化发酵。
7.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述表面改性材料的用量为1-100g/l发酵培养基。
8.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述固定化发酵为固定化连续发酵。
9.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述固定化发酵过程中，葡萄糖的含量为5-300g/l。
10.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述固定化发酵的温度为25-35℃。
技术总结本发明公开了一种表面改性材料及其制备方法和在酵母细胞吸附与聚集生长中的应用；所述表面改性材料具有巯基官能团、苯环官能团和氨基官能团中的任意一种或几种组合。本发明通过将表面改性材料应用于固定化连续发酵过程中，可有效提升酵母细胞在固定化载体表面吸附生长的能力。
技术研发人员：应汉杰;柳东;王振宇;李明;王丹妮;葛士凯;陈勇;刘庆国;牛欢青
受保护的技术使用者：南京工业大学
技术研发日：2021.05.28
技术公布日：2021.08.03
