本公开属于生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种具有启动子活性的多核苷酸，包含具有启动子活性的多核苷酸的转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞，以及调控目标基因转录的方法、制备蛋白的方法和生产目标化合物的方法。
背景技术：
棒状杆菌，尤其是非致病的谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)，由于具有较强的氨基酸合成能力，是美国fda认定的食品安全菌株，是目前发酵工业中最常使用的菌种之一，广泛用于蛋白、氨基酸、有机酸等化学品的工业化生产。目标基因的表达调控和优化是提高蛋白或产物合成的关键，而启动子元件则是调控基因表达的重要工具。目前，谷氨酸棒状杆菌中已经鉴定或开发了一系列的强启动子[1-2]或组成型启动子[3]，用于调控代谢途径中关键基因的表达。尽管上述启动子元件可以精细调控目标基因的表达，然而，对于一些毒性蛋白或代谢产物的合成，组成型启动子的使用还存在较大的限制。此外，强启动子或组成型启动子的表达往往对工程菌株也会造成较大的代谢负担。
诱导型启动子可以控制转录起始的时间，因此更有利于菌株的代谢流调控和重新分配。目前tac、trc等诱导型启动子在谷氨酸棒状杆菌的代谢调控中被广泛使用。然而上述启动子往往需要额外添加昂贵的诱导剂，例如iptg，这些诱导剂的添加也会对菌株造成一定的毒性，或对发酵体系造成较大的干扰。因此开发工业发酵条件下的自诱导系统对于工业菌株的构建至关重要。现阶段，已有研究报道了部分谷氨酸棒状杆菌中的自诱导启动子，例如赖氨酸诱导型启动子[4]、生长过程调控型启动子[5-6]等。但上述自诱导启动子的数量还相对较少，响应的条件也相对较窄，无法在更多的发酵体系和产物合成中普及应用。
在发酵罐中ph和溶氧严格控制的条件下，利用谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸、赖氨酸等大宗化学品的产量能够达到100g/l甚至200g/l以上的水平[7-8]，因此，在发酵后期高浓度产物或中间代谢物的积累以及底物的不断流加势必引发高盐、高渗的压力。同时，高盐高渗条件也几乎是所有工业菌株在发酵后期都将面临的环境诱导因素[9]，目前，在谷氨酸棒状杆菌中，尚无高盐高渗诱导型启动子调控目标基因表达的应用先例。
因此，鉴定高盐高渗诱导型启动子，开发构建针对发酵后期高盐高渗条件的自诱导系统，不仅可以增加可用的自诱导系统，而且可以为所有工业菌株的开发提供通用的自诱导元件，这也成为当前谷氨酸棒状杆菌工业菌株开发亟需解决的关键问题。
引用文献：
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技术实现要素：
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在的技术问题，例如，在工业发酵的过程中使用tac、trc等诱导型启动子需添加iptg等昂贵诱导剂、且诱导剂的添加对菌株造成毒性的问题，为此，本公开提供了一种具有启动子活性的多核苷酸，前述多核苷酸在盐浓度、渗透压升高的环境下表现出增强的启动子活性。将多核苷酸与氨基酸合成相关的蛋白编码基因可操作的连接，可实现蛋白编码基因在高盐、高渗透压环境下的高效表达，有效解决了当前诱导型启动子需要添加高昂诱导剂、且诱导剂对菌株造成毒性的问题。
用于解决问题的方案
(1)一种具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自如下(i)-(iv)中组成的组中的任一项：
(i)包含如seqidno：1-3任一序列所示的核苷酸序列；
(ii)包含如seqidno：1-3任一序列所示的核苷酸序列的反向互补序列；
(iii)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)或(ii)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
(iv)与(i)或(ii)所示的核苷酸序列具有至少80％，可选至少90％，优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。
(2)根据(1)所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸在盐浓度或渗透压升高的环境中具有提高的启动子活性。
(3)一种转录表达盒，其中，所述转录表达盒包含根据(1)或(2)所述的具有启动子活性的多核苷酸；可选地，所述转录表达盒还含有蛋白编码基因，所述蛋白编码基因与所述具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接。
(4)一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含根据(1)或(2)所述的具有启动子活性的多核苷酸，或根据(3)所述的转录表达盒。
(5)一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含根据(3)所述的转录表达盒，或根据(4)所述的重组表达载体。
(6)根据(5)所述的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞来源于棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属或埃希氏菌属；优选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌；更优选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌atcc13032、谷氨酸棒杆菌atcc13869或谷氨酸棒杆菌atcc14067。
(7)一种根据(1)或(2)所述的多核苷酸，根据(3)所述的转录表达盒，根据(4)所述的重组表达载体，根据(5)或(6)所述的重组宿主细胞在如下至少一种中的用途：
(a)调控基因的转录水平，或制备用于调控基因的转录水平的试剂或试剂盒；
(b)制备蛋白，或制备用于制备蛋白的试剂或试剂盒；
(c)生产目标化合物，或制备用于生产目标化合物的试剂或试剂盒。
(8)根据(7)所述的用途，其中，所述蛋白选自基因表达调控蛋白或与目标化合物合成相关的蛋白。
(9)根据(7)或(8)所述的用途，其中，所述目标化合物包括氨基酸和有机酸中的至少一种；可选地，所述氨基酸包括赖氨酸、谷氨酸和苏氨酸中的至少一种，所述有机酸包括柠檬酸和琥珀酸中的至少一种。
(10)一种调控目标基因转录的方法，其中，所述方法包括将(1)-(2)任一项所述的具有启动子活性的多核苷酸与目标基因可操作地连接的步骤。
(11)一种制备蛋白的方法，其特征在于，包括利用根据(3)所述的转录表达盒，根据(4)所述的重组表达载体，或根据(5)-(6)任一项所述的重组宿主细胞表达所述蛋白的步骤；可选地，所述蛋白为与目标化合物合成相关的蛋白或基因表达调控蛋白；
任选地，所述方法还包括分离或纯化所述蛋白的步骤。
(12)一种生产目标化合物的方法，其中，包括利用(3)所述的转录表达盒，(4)所述的重组表达载体，或(5)-(6)任一项所述的重组宿主细胞表达与目标化合物合成相关的蛋白或基因表达调控蛋白，在所述与目标化合物合成相关的蛋白或所述基因表达调控蛋白存在的环境下生产目标化合物的步骤；
可选地，所述目标化合物包括氨基酸和有机酸中的至少一种；可选地，所述氨基酸包括赖氨酸、谷氨酸和苏氨酸中的至少一种，所述有机酸包括柠檬酸和琥珀酸中的至少一种；
可选地，所述蛋白为与赖氨酸合成相关的蛋白；可选地，所与赖氨酸合成相关的蛋白包括天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸氨裂合酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶甲酸还原酶、琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶、四氢吡啶二羧酸酯琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶、二氨基庚二酸差向异构酶、二氨基庚二酸脱酰基酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、赖氨酸运输蛋白、转酮酶、二氨基庚二酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶中的一种或两种以上的组合；
任选地，所述方法还包括分离或纯化所述目标化合物的步骤。
发明的效果
在一个实施方案中，本公开提供了具有启动子活性的多核苷酸，其是一种高盐、高渗透压诱导型的启动子，在盐浓度、渗透压升高的环境下具有增强的启动子活性。多核苷酸与目标基因可操作地连接，可以显著提高目标基因在高盐、高渗透压的胁迫环境下的表达强度，进而稳定、高效的生产下游产物，有效解决了当前添加iptg等高昂诱导剂、且对菌株造成毒性的问题。
在另一个实施方案中，本公开提供了转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞，包含上述具有启动子活性的多核苷酸。在转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞中，具有启动子活性的多核苷酸与蛋白编码基因可操作地连接，可以提高蛋白编码基因在高盐、高渗透压的胁迫环境下的表达强度。
在另一个实施方案中，本公开提供了生产氨基酸的方法，利用上述具有启动子活性的多核苷酸，能够提高与氨基酸合成相关的蛋白在胁迫环境下的表达，同时弱化其他途径蛋白的表达，使得代谢流更多地向氨基酸合成方向富集，从而稳定、高效的生产氨基酸，达到过量积累氨基酸的目的。
在另一个实施方案中，当以上述的方法生产l-赖氨酸时，能够在高盐、高渗透压的环境下稳定、高效的生产l-赖氨酸。
附图说明
图1示出了高渗透压对ncgl1418启动子的诱导作用；
图2示出了不同浓度硫酸钠对ncgl1418启动子的诱导作用；
图3示出了高浓度糖对ncgl1418启动子的诱导作用；
图4示出了pncgl1418与ptuf的启动子强度对比结果；
图5示出了不同长度ncgl1418启动子的活性比较结果。
具体实施方式
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
本公开中的术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法(例如，使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个dna序列(即a、t、g、c)表示时，这也包括一个rna序列(即a、u、g、c)，其中“u”取代“t”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括dna、rna和cdna序列。
本公开中的术语“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。
在一些具体的实施方案中，具有启动子活性的多核苷酸包含与seqidno：1-3任一序列所示的核苷酸序列的反向互补序列，且多核苷酸保持高盐、高渗透压诱导型的启动子活性。
在一些具体的实施方式中，具有启动子活性的多核苷酸包含在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，与seqidno：1-3任一序列所示的核苷酸序列或其反向互补序列杂交的序列的反向互补序列，且多核苷酸保持高盐、高渗透压诱导型的启动子活性。
在一些具体的实施方案中，具有启动子活性的多核苷酸包含与上述任一种的核苷酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性的序列，且多核苷酸保持高盐、高渗透压诱导型的启动子活性。
如本公开所使用的，术语“高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃处在5xsspe(salinesodiumphosphateedta)、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑精dna和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃处使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
如本公开所使用的，术语“非常高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃处在5xsspe(salinesodiumphosphateedta)、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑精dna和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃处使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
本文中的术语“互补的”是指在核苷酸或核苷酸之间的杂交或碱基配对，例如双链dna分子的两条链之间或者寡核苷酸引物与被测序或扩增的单链核苷酸上的引物结合位点之间等。
本公开中的术语“启动子”是指一种核酸分子，通常位于目标基因编码序列的上游，为rna聚合酶提供识别位点，并位于mrna转录起始位点的5’方向的上游。它是不被翻译的核酸序列，rna聚合酶与这一核酸序列结合后启动目标基因的转录。在核糖核酸(rna)的合成中，启动子可以和调控基因转录的转录因子产生相互作用，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度，包含核心启动子区域和调控区域，就像“开关”，决定基因的活动，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。
本公开中的术语“启动子核心区”是指位于原核生物启动子区的一段核酸序列，是发挥启动子功能的核心序列区，主要包括-35区、-10区、-35区和-10区之间的区域以及转录起始位点，-35区是rna聚合酶的识别位点，-10区是rna聚合酶的结合位点。
在一些具体的实施方案中，本公开中的具有启动子活性的多核苷酸能够用于起始蛋白编码基因的表达。在另外一些实施方案中，本公开中的具有启动子活性的多核苷酸能够用于起始非编码基因的表达。
本公开中的术语“表达”包括涉及rna产生及蛋白产生的任何步骤，包括但不限于：
转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
本公开中的术语“目标基因”涉及与本公开中具有启动子活性的多核苷酸连接，以对其转录水平进行调控的任一种的基因。
在一些实施方案中，目标基因是指编码微生物中目标蛋白质的基因。示例性的，目标基因是编码与目标化合物的生物合成相关的酶的基因、编码与还原力相关的酶的基因，编码与糖酵解或tca循环相关的酶的基因，或编码与目标化合物的释放相关的酶的基因等等。
本公开中的术语“目标化合物”可以选自氨基酸和有机酸中的至少一种，也可以选自本领域中可能通过生物合成得到的其他种类的化合物。
在一些实施方案中，目标化合物为“氨基酸”或“l-氨基酸”。“氨基酸”或“l-氨基酸”通常是指其中氨基和羧基结合至相同碳原子的蛋白质的基本构成单元。示例性的，氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸中的一种或两种以上的组合，或者是本领域中其他种类的氨基酸。
在一些实施方案中，目标化合物为有机酸。有机酸可以是具有酸性的有机化合物，例如，其中包括羧基和磺酸基的那些化合物。示例性的，有机酸包括乳酸、醋酸、琥珀酸、丁酸、棕榈酸、草酸、酒石酸、柠檬酸、丙酸、己烯酸、癸酸、辛酸、戊酸中的一种或两种以上的组合，或者是本领域中其他种类的有机酸。
本公开中的术语“蛋白编码基因”是指能够通过一定的规则指导蛋白的合成dna分子，蛋白编码基因指导蛋白合成的过程一般包括以双链dna为模板的转录过程和以mrna为模板的翻译过程。蛋白编码基因含有cds序列(codingsequence)，能够指导编码蛋白质的mrna的产生。
示例性的，蛋白编码基因包括但不限于用于编码与目标化合物合成相关的蛋白，在一些实施方案中，蛋白编码基因涉及用于编码与合成l-赖氨酸的相关的蛋白。对于与合成l-赖氨酸的相关的蛋白，包括天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸氨裂合酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶甲酸还原酶、琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶、四氢吡啶二羧酸酯琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶、二氨基庚二酸差向异构酶、二氨基庚二酸脱酰基酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、赖氨酸运输蛋白、转酮酶、二氨基庚二酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶中的一种或两种以上的组合。在一些实施方案中，蛋白编码基因涉及用于编码与合成有机酸相关的蛋白，示例性的，蛋白编码基因用于编码与合成柠檬酸有关的蛋白，或用于编码与合成琥珀酸有关的蛋白。在另外一些实施方案中，蛋白编码基因涉及与基因编辑相关的蛋白，例如cpf1蛋白。本公开的具有启动子活性的多核苷酸，可适于提高目标基因在高盐、高渗透压的胁迫环境下的表达，实现目标产物的高效生产。
本公开的术语“基因表达调控蛋白”包括不限于外源的基因表达调控工具蛋白，例如crispri调控需要的dcas9蛋白、dcpf1蛋白，srna调控需要的hfq蛋白等，以及内源或外源的转录调控因子，进而调控代谢通路中关键基因的表达。
本公开中的术语“转录表达盒”指的包含转录调控元件与目标基因，利用转录调控元件对目标基因的表达进行调控的一类表达元件。在本公开中，转录调控元件包含启动子，在此基础上，还可以包含增强子、沉默子、绝缘子等元件。在本公开中，目标基因具体为蛋白编码基因。目标基因与多核苷酸“可操作地连接”，是指将具有启动子活性的多核苷酸与目标基因功能性连接，以启动和介导目标基因的转录，所述可操作地连接的方式可以采用本领域技术人员所述的任何方式。
本公开中的术语“载体”指的是dna构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的dna序列，从而在合适的宿主中表达目标基因。“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的dna结构。重组表达载体可包括，例如包含i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；ii)转录成mrna并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要，并可以使用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本公开的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成dna序列，例如细菌质粒、噬菌体dna、酵母质粒以及从质粒和噬菌体dna的组合中衍生的载体，来自如牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、sv40和伪狂犬病等病毒的dna。
本公开中的术语“宿主细胞”意指易于用包含本公开的多核苷酸的转录起始元件或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“重组宿主细胞”涵盖导入转录起始元件或重组表达载体后不同于亲本细胞的宿主细胞，重组宿主细胞具体通过转化来实现。
本公开中的术语“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的dna导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙沉淀法、氯化钙(cacl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(peg)法、deae-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-dmso法。
本公开的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，只要是能够导入本公开的具有启动子活性的多核苷酸的细胞即可。在一个实施方案中，宿主细胞指原核细胞，具体地，宿主细胞来源于适合发酵生产氨基酸的微生物，例如棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属或埃希氏菌属。作为优选地，宿主细胞是来源于棒状杆菌属的谷氨酸棒杆菌。其中，谷氨酸棒杆菌可以是谷氨酸棒杆菌atcc13032、谷氨酸棒杆菌atcc13869或谷氨酸棒杆菌atcc14067等。
本公开的宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的ph值等。
本公开中的具有启动子活性的多核苷酸作为一种自诱导型的启动子，可在高盐、高渗透压的环境下表现出增强的启动子活性，从而避免了在发酵环境中添加本领域中常用的iptg等价格高且具有毒性的诱导剂。
除非在本公开中另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
高盐、高渗透压诱导型的启动子
在本公开中，利用添加和不添加0.6mnacl或赖氨酸硫酸盐的cgxii培养基培养谷氨酸棒状杆菌atcc13032菌株，在对数生长中期收集细胞，提取总rna并进行转录组测序分析。选择在高渗条件下转录水平明显上升的ncgl1418基因的启动子最为候选高盐高渗诱导型启动子。
在一些具体的实施方案中，ncgl1418启动子选自如下(i)-(iv)中组成的组中的任一项：
(i)包含如seqidno：1-3任一序列所示的核苷酸序列。
(ii)包含如seqidno：1-3任一序列所示的核苷酸序列的反向互补序列。
(iii)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)或(ii)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
(iv)与(i)或(ii)所示的核苷酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
在一些具体的实施方案中，ncgl1418启动子在高盐环境下具有提高的启动子活性。在一些具体的实施方案中，ncgl1418启动子在高渗透压环境下具有提高的启动子活性。
在本公开中，“高盐环境”可以是培养基中高浓度na2so4、nacl、k2so4、kcl等无机盐离子，或是随发酵时间延长、发酵液中赖氨酸等产物或某些中间代谢物积累而增加的浓度(例如，赖氨酸硫酸盐等)，或是由于底物流加而增加的浓度(例如，硫酸铵等底物)，或是发酵液中可能出现的其他任意盐的浓度。在一些具体的实施方案中，“高盐环境”涉及在0.2m以上的盐浓度；在一些更为具体的实施方案中，“高盐环境”涉及在0.2-0.8m的盐浓度。例如，盐浓度为0.2m、0.3m、0.4m、0.5m、0.6m、0.7m、0.8m。
在本公开中，“高渗透压环境”是指响应提高的盐浓度而升高的渗透压。
在一些优选的实施方案中，ncgl1418启动子在以硫酸盐、盐酸盐所形成的“高盐环境”下表现出更高的启动子活性或更高的转化效率；在一些优选的实施方案中，硫酸盐为na2so4或k2so4、赖氨酸硫酸盐，盐酸盐为赖氨酸盐酸盐、氯化钠或氯化钾。
重组表达载体的构建
在一些具体的实施方案中，本公开以atcc13032基因组为模板，利用引物1418-f和1418-r，通过pcr扩增得到ncgl1418基因的启动子序列(seqidno:1)；以pxm-gfp为模板，利用引物pgfp-f和pgfp-r对pxm-gfp进行扩增获得去除laci基因和tac启动子的载体片段；将上述片段重组连接，得到重组表达载体pxm-pncgl1418-gfp。
在一些具体的实施方案中，本公开以pxm-pncgl1418-gfp为模板，分别利用引物对1418-203-f/r、1418-145-f/r和1418-94-f/r，通过pcr扩增获得具有203bp、145bp和94bp的ncgl1418启动子片段；上述三个片段回收后，利用t4pnk将载体片段磷酸化，并通过自身环化构建获得新载体，将其分别命名为pxm-p203-gfp、pxm-p145-gfp和pxm-p94-gfp。
在一些具体的实施方案中，本公开以atcc13032基因组为模板，利用引物1418-d-f和1418-d-r，通过pcr扩增得到ncgl1418基因的启动子序列。以pxm-07为模板，先利用引物pxm07-f1和pxm07-r1，通过pcr扩增获得带有dcpf1的载体片段一；然后利用引物pxm07-f2和pxm07-r2，通过pcr扩增获得带有复制起点的载体片段二；以pec-26为模板，利用引物pec26-f和pec26-r，通过pcr扩增获得靶向glta、pgi、hom和pck基因的crrnaarray片段；将上述片段回收后，进行重组连接，得到重组表达载体pxm-pncgl1418-dcpf1。
在一些具体的实施方案中，本公开以atcc13032基因组为模板,利用引物1418-l-f和1418-l-r，通过pcr扩增得到ncgl1418基因的启动子序列和lyse基因的dna序列。以pec-xk99e为模板，利用引物pec-f和pec-r通过pcr扩增获得载体片段，将上述三个片段回收后行重组连接，得到重组表达载体pec-pncgl1418-lyse。
谷氨酸棒杆菌的具体来源为谷氨酸棒杆菌atcc13032(corynebacteriumglutamicumatcc13032，atcc13032的基因组序列：nc_003450.3)。
氨基酸的生产过程
(1)本公开中将具有启动子活性的多核苷酸，与氨基酸合成相关的蛋白编码基因或基因表达调控蛋白编码基因可操作的连接，得到能够与氨基酸合成相关的蛋白或基因表达调控蛋白的重组表达载体，利用重组表达载体转化宿主细胞，获得重组宿主细胞。
(2)对重组宿主细胞进行发酵培养，从重组宿主细胞或重组宿主细胞的培养液中收集氨基酸，完成氨基酸的生产过程。
上述生产过程中，由于多核苷酸具有改进的启动子活性，在重组宿主细胞中，与氨基酸合成相关的蛋白或基因表达调控蛋白的编码基因的转录活性提高，与氨基酸合成相关的蛋白或基因表达调控蛋白的表达量提高，进而使氨基酸的产量显著提升。
在一些具体的实施方案中，本公开采用的制备氨基酸的方法的步骤中，不添加诱导剂。在一个具体的实施方案中，本公开采用的制备氨基酸的方法的步骤中，不添加iptg。
对于生产的氨基酸，所述氨基酸包括赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；对于生产的有机酸，所述有机酸包括柠檬酸、琥珀酸等。
对于与氨基酸合成相关的蛋白或基因表达调控蛋白，所述与氨基酸合成相关的蛋白是与赖氨酸合成相关的蛋白。在一些具体的实施方案中，与氨基酸合成相关的蛋白为赖氨酸转运蛋白lyse，以具有启动子活性的多核苷酸增加lyse的表达，可促进赖氨酸的胞外排放和胞外积累。在一些具体的实施方案中，基因表达调控蛋白为dcpf1，dcpf1可以靶向调控glta、pgi、hom或pck等目标基因；具有启动子活性的多核苷酸可以增加高盐环境条件下dcpf1的表达，提高了靶基因的弱化程度，进一步促进了赖氨酸的合成和底物利用。
在一些具体的实施方案中，宿主细胞为谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)，谷氨酸棒杆菌是用于生产l-赖氨酸的重要菌株，高盐、高渗透压诱导型的多核苷酸、转录表达盒或重组表达载体对谷氨酸棒杆菌进行改造后，谷氨酸棒杆菌内与赖氨酸合成相关的蛋白的表达量显著提高，具体为在高盐、高渗透压的环境下的表达量显著提高，使谷氨酸棒杆菌长时间发酵积累l-赖氨酸的能力大大提高。
在一些具体的实施方案中，宿主细胞是经过如下改良的谷氨酸棒杆菌：谷氨酸棒杆菌中的天冬氨酸激酶编码基因引入了t311i突变编码序列。
在本领域，用于操纵微生物的方法是已知的，如《分子生物学现代方法》(onlineisbn：9780471142720,johnwileyandsons,inc.)、《微生物代谢工程：方法和规程》(qiongchenged.,springer)和《系统代谢工程：方法和规程》(hals.alpered.,springer)等出版物中被解释。
在一些具体的实施方案中，重组宿主细胞的培养条件为：将重组宿主细胞接种含有相应抗生素的tsb培养基，30℃，220r/min过夜培养，按照初始od0.3分别转接添加或不添加0.6m硫酸钠(模拟发酵后期高浓度产物积累造成的高盐高渗环境)的赖氨酸发酵培养基，培养体系为24孔板装液1ml，30℃，800r/min培养24h后终止发酵，检测剩余葡萄糖含量、od600和赖氨酸产量。
对于赖氨酸发酵培养基，配方为：葡萄糖80g/l、酵母粉8g/l、尿素9g/l、k2hpo41.5g/l、mops42g/l、feso40.01g/l、mnso40.01g/l、mgso40.6g/l，氯霉素终浓度为5μg/ml，和/或卡那霉素终浓度为25μg/ml。
在一些具体的实施方案中，对于重组宿主细胞或重组细胞的培养液回收氨基酸，可通过本领域常用方法，包括但不限于：过滤、阴离子交换色谱、结晶或hplc。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例中质粒构建所使用的引物序列如下所示：
实施例1.诱导型启动子的筛选
利用添加和不添加0.6mnacl或赖氨酸硫酸盐的cgxii培养基培养谷氨酸棒状杆菌atcc13032菌株，在对数生长中期收集细胞，提取总rna并进行转录组测序分析。选择在高渗条件下转录水平明显上升的ncgl1418基因的启动子最为候选高盐高渗诱导型启动子。
实施例2.包含启动子序列的重组载体构建
根据ncbi公布的谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)atcc13032的基因组序列(nc_003450.3)，设计引物1418-f(seqidno:6)和1418-r(seqidno:7)。以atcc13032基因组为模板通过pcr扩增得到ncgl1418基因的启动子序列(seqidno:1)，pcr扩增参数为：95℃5min，95℃30s，65-55℃30s，72℃1min，循环10次，95℃30s，55℃30s，72℃1min，循环25次，72℃延伸10min。同时，以文献报道的pxm-gfp为模板[10]，利用引物pgfp-f和pgfp-r，通过pcr扩增获得去除laci基因和tac启动子的载体片段，pcr扩增参数为：95℃10min，95℃30s，65-55℃30s，72℃3min，循环10次，95℃30s，55℃30s，72℃3min，循环25次，72℃延伸10min。上述两个片段回收后，利用vazymeclonexpressmulties一步重组试剂盒进行重组连接，并将连接产物转化到transt1感受态细胞，涂布氯霉素抗性平板过夜培养，挑阳性克隆进行菌落pcr验证，并将正确转化子进行测序确认，获得的重组载体命名为pxm-pncgl1418-gfp。同时，利用t4pnk将载体片段磷酸化，并通过自身环化构建获得对照载体pxm-con。
实施例3.高盐对ncgl1418启动子的诱导作用
将上述重组载体pxm-pncgl1418-gfp和对照载体pxm-con分别转化谷氨酸棒杆菌atcc13032，获得重组菌株和对照菌株。将上述菌株分别接种含有5μg/ml氯霉素的tsb培养基，30℃，220r/min过夜培养。其中，tsb液体培养基成份为(g/l)：葡萄糖，5g/l；酵母粉，5g/l；大豆蛋白胨，9g/l；尿素，3g/l；丁二酸，0.5g/l；k2hpo4·3h2o，1g/l；mgso4·7h2o，0.1g/l；生物素，0.01mg/l；维生素b1，0.1mg/l；mops，20g/l。按照初始od0.5分别转接添加或不添加0.6m不同盐的cgxiiy培养基，培养体系为24孔板装液1ml，30℃，800r/min培养18h后检测不同菌株的gfp荧光强度及od600，利用单位菌体的荧光强度(扣除相同条件下对照菌株的单位菌体荧光强度)表征不同条件下ncgl1418启动子的相对强度。其中cgxiiy培养基配方为：葡萄糖50g/l、nh4cl16.5g/l、尿素5g/l、kh2po41g/l、k2hpo41g/l、mops42g/l、mgso40.25g/l、feso4·2h2o0.01g/l、mnso4·h2o0.01g/l、znso4·7h2o0.001g/l、cuso40.2mg/l、nicl·6h2o0.02mg/l、cacl20.01g/l、原儿茶酸0.03g/l、生物素0.2mg/l、维生素b10.1mg/l，氯霉素终浓度为5μg/ml。检测结果见图1，数据显示添加0.6m不同盐都可以诱导ncgl1418启动子的转率和报告基因的表达(4.1-7.7倍)，因此确定该启动子受高盐诱导。
实施例4.不同渗透压强度对ncgl1418启动子的诱导作用
利用实施例3同样的方法，分别检测不同浓度硫酸钠对ncgl1418启动子的诱导作用。结果见图2，数据显示ncgl1418启动子的强度随硫酸钠浓度的升高而增强，在一定的范围内表现出明显的梯度诱导活性。
实施例5.ncgl1418启动子对高糖的响应
利用实施例3同样的方法，检测高浓度蔗糖(150g/l)对ncgl1418启动子的诱导作用。结果见图3，数据显示额外添加高浓度蔗糖对ncgl1418启动子的诱导活性没有明显增强作用，说明该启动子响应的不是所有的高渗压力，而针对性响应高浓度盐离子。
实施例6.ncgl1418启动子和tuf启动子强度比较
目前，已知通用的谷氨酸棒杆菌的内源强启动子是ptuf，因此，我们进一步将ncgl1418启动子与该启动子进行了对比，以验证ncgl1418启动子的强度。根据ncbi公布的谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)atcc13032的基因组序列(nc_003450.3)，设计引物tuf-f(seqidno:10)和tuf-r(seqidno:11)。以atcc13032基因组为模板通过pcr扩增得到带有tuf基因的启动子序列(seqidno:5)，pcr扩增参数为：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃1min，循环30次，72℃延伸10min。同时，以pxm-pncgl1418-gfp为模板，利用引物tuf-pgfp-f(seqidno:12)和tuf-pgfp-r(seqidno:13)，通过pcr扩增获得包含pncgl1418的rbs的载体片段，pcr扩增参数为：95℃10min，95℃30s，65-55℃30s，72℃3min，循环10次，95℃30s，55℃30s，72℃3min，循环25次，72℃延伸10min。上述片段回收后利用vazymeclonexpressmulties重组试剂盒进行重组连接，并将连接产物转化到transt1感受态细胞，涂布氯霉素抗性平板过夜培养，挑阳性克隆进行菌落pcr验证，并将正确转化子进行测序确认，获得的重组载体命名为pxm-ptuf-gfp。将该重组载体转化谷氨酸棒杆菌atcc13032，获得重组菌株。利用实施例3类似的方法，比较高盐或正常培养基条件下ncgl1418启动子与ptuf的强度。结果见图4，数据显示在正常渗透压条件下ncgl1418启动子强度低于ptuf，但在高渗透压(添加0.6m硫酸钠)条件下，其转录活性与ptuf基本一致，表明在高盐渗透压条件该启动子强度较高，可以用于目标基因的高效诱导表达。
实施例7.不同长度ncgl1418启动子的活性
以上述构建的pxm-pncgl1418-gfp为模板，分别利用引物对1418-203-f/r(seqidno:14、15)、1418-145-f/r(seqidno:16、17)和1418-94-f/r(seqidno:18、19)，通过pcr扩增获得具有203bp(seqidno:2)、145bp(seqidno:3)和94bp(seqidno:4)的ncgl1418启动子片段，pcr扩增参数为：95℃10min，95℃30s，65-55℃30s，72℃3min，循环10次，95℃30s，55℃30s，72℃3min，循环25次，72℃延伸10min。上述三个片段回收后，利用t4pnk将载体片段磷酸化，并通过自身环化构建获得新载体，将其分别命名为pxm-p203-gfp、pxm-p145-gfp和pxm-p94-gfp。
将上述重组载体pxm-p203-gfp、pxm-p145-gfp和pxm-p94-gfp分别转化谷氨酸棒杆菌atcc13032，获得重组菌株。利用实施例3类似的方法，分别比较高盐(添加0.6m硫酸钠)和正常培养基条件下不同长度ncgl1418启动子的强度。结果见图5，数据显示94bp长度的ncgl1418启动子尽管包含了核心序列(-35区和-10区)，但却基本丧失了启动子的正常功能；145bp长度的启动子在高盐条件下虽然诱导强度有所下降，但仍可以达到243bp启动子活性的74％以上；203bp长度的启动子在高盐渗透压条件下基本保持了243bp启动子的活性，为243bp启动子活性的94％；以上结果表明ncgl1418启动子的启动子活性以及在高盐渗透压条件下的活性至少需要包括seqidno:3所示的145bp长度的dna序列。
实施例8.ncgl1418启动子调控dcpf1表达在赖氨酸合成中的应用
根据ncbi公布的谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)atcc13032的基因组序列(nc_003450.3)，设计引物1418-d-f(seqidno:20)和1418-d-r(seqidno:21)。以atcc13032基因组为模板通过pcr扩增得到ncgl1418基因的启动子序列，pcr扩增参数为：95℃10min，95℃30s，65-55℃30s，72℃1min，循环10次，95℃30s，55℃30s，72℃1min，循环25次，72℃延伸10min。同时，以文献报道的pxm-07为模板[11]，先利用引物pxm07-f1(seqidno:22)和pxm07-r1(seqidno:23)，通过pcr扩增获得带有dcpf1的载体片段一，pcr扩增参数为：95℃10min，95℃30s，65-55℃30s，72℃3min，循环10次，95℃30s，55℃30s，72℃3min，循环25次，72℃延伸10min；然后利用引物pxm07-f2(seqidno:24)和pxm07-r2(seqidno:25)，通过pcr扩增获得带有复制起点的载体片段二，pcr扩增参数为：95℃10min，95℃30s，65-55℃30s，72℃3min，循环10次，95℃30s，55℃30s，72℃3min，循环25次，72℃延伸10min。以文献报道的pec-26为模板[11]，利用引物pec26-f(seqidno:26)和pec26-r(seqidno:27)，通过pcr扩增获得靶向glta、pgi、hom和pck基因的crrnaarray片段，pcr扩增参数为：95℃10min，95℃30s，65-55℃30s，72℃1min，循环10次，95℃30s，55℃30s，72℃1min，循环25次，72℃延伸10min。将上述三个片段回收后，利用vazymeclonexpressmulties一步重组试剂盒进行重组连接，并将连接产物转化到transt1感受态细胞，涂布氯霉素抗性平板过夜培养，挑阳性克隆进行菌落pcr验证，并将正确转化子进行测序确认，获得的重组载体命名为pxm-pncgl1418-dcpf1。同时，以pxm-07为模板，利用引物pxm07-f3(seqidno:28)和pxm07-r3(seqidno:29)，通过pcr扩增获得载体片段三，pcr扩增参数为：95℃10min，95℃30s，65-55℃30s，72℃3min，循环10次，95℃30s，55℃30s，72℃3min，循环30次，72℃延伸10min；将上述片段回收后与得到的ncgl1418基因的启动子序列片段通过vazymeclonexpressmulties一步重组试剂盒进行重组连接，并将连接产物转化到transt1感受态细胞，涂布氯霉素抗性平板过夜培养，挑阳性克隆进行菌落pcr验证，并将正确转化子进行测序确认，获得对照载体pxm-dcpf1-con。
根据文献中公开的赖氨酸菌株构建方法[12]，利用基于pk18mobsacb的同源重组技术将谷氨酸棒杆菌atcc13032基因组上天冬氨酸激酶(lysc基因编码)第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸，构建获得一株具有一定赖氨酸合成能力的菌株scgl30。将上述重组载体pxm-pncgl1418-dcpf1和pxm-dcpf1-con分别转化scgl30菌株，获得重组菌株和对照菌株。将上述菌株分别接种含有5μg/ml氯霉素的tsb培养基，30℃，220r/min过夜培养，按照初始od0.3分别转接添加或不添加0.6m硫酸钠(模拟发酵后期高浓度产物积累造成的高盐高渗环境)的赖氨酸发酵培养基，培养体系为24孔板装液1ml，30℃，800r/min培养24h后终止发酵，检测剩余葡萄糖含量、od600和赖氨酸产量。其中赖氨酸发酵培养基配方为：葡萄糖80g/l、酵母粉8g/l、尿素9g/l、k2hpo41.5g/l、mops42g/l、feso40.01g/l、mnso40.01g/l、mgso40.6g/l，氯霉素终浓度为5μg/ml。检测结果见表1，数据显示不添加硫酸钠时，靶基因弱化菌株赖氨酸产量和葡萄糖转化率分别比对照菌株提高了23％和25％，表明ncgl1418启动子可以通过调控目标基因dcpf1的表达，实现该系统对靶基因的弱化功能。而在添加0.6m硫酸钠的高盐条件中，靶基因弱化菌株赖氨酸产量和葡萄糖转化率分别比对照菌株提高了49％和40％，表明高盐环境条件下dcpf1的表达强度更高，提高了靶基因的弱化程度，进一步促进了赖氨酸的合成和底物利用。
表1ncgl1418启动子调控dcpf1表达在赖氨酸合成中的应用效果
实施例9.ncgl1418启动子调控赖氨酸转运蛋白lyse表达在赖氨酸合成中的应用
根据ncbi公布的谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)atcc13032的基因组序列(nc_003450.3)，分别设计引物1418-l-f(seqidno:30)和1418-l-r(seqidno:31)，lyse-f(seqidno:32)和lyse-r(seqidno:33)。以atcc13032基因组为模板通过pcr扩增分别得到ncgl1418基因的启动子序列和lyse基因的dna序列，pcr扩增参数为：95℃5min，95℃30s，65-55℃30s，72℃1min，循环10次，95℃30s，55℃30s，72℃1min，循环25次，72℃延伸10min。同时，以文献报道的pec-xk99e为模板[13]，利用引物pec-f(seqidno:34)和pec-r(seqidno:35)，通过pcr扩增获得载体片段，pcr扩增参数为：95℃10min，95℃30s，65-55℃30s，72℃3min，循环10次，95℃30s，55℃30s，72℃3min，循环25次，72℃延伸10min。将上述三个片段回收后，利用vazymeclonexpressmulties一步重组试剂盒进行重组连接，并将连接产物转化到transt1感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板过夜培养，挑阳性克隆进行菌落pcr验证，并将正确转化子进行测序确认，获得的重组载体命名为pec-pncgl1418-lyse。
将上述重组载体pec-pncgl1418-lyse和pec-xk99e分别转化谷氨酸棒杆菌scgl30，获得重组菌株和对照菌株。利用如实施例8的方法(抗生素替换为终浓度为25μg/ml的卡那霉素)验证ncgl1418启动子调控的lyse表达菌株在赖氨酸合成中的应用效果，结果见表2。数据显示不添加硫酸钠时，ncgl1418启动子调控的lyse表达菌株赖氨酸产量和葡萄糖转化率为2.35g/l和0.039g/g，分别比对照菌株提高了38％和40％；而在添加0.6m硫酸钠的高盐条件中，lyse表达菌株赖氨酸产量和葡萄糖转化率达到了3.05g/l和0.063g/g，分别比对照菌株提高了49％和59％，表明高盐环境条件下lyse的表达强度更高，促进了赖氨酸的外排和胞外积累。
表2ncgl1418启动子调控lyse表达在赖氨酸合成中的应用效果
进一步将上述两种策略组合，获得了ncgl1418启动子同时调控lyse和dcpf1表达的重组菌株。利用如实施例8的方法(抗生素替换为终浓度为5μg/ml的氯霉素和25μg/ml的卡那霉素)验证上述重组菌株在赖氨酸合成中的应用效果，结果见表3。数据显示不添加硫酸钠时，ncgl1418启动子调控的目标基因共表达菌株赖氨酸产量从1.75g/l提高到了3.15g/l(提高了80％)，葡萄糖转化率从0.03g/g提高到了0.053g/g(提高了78％)；而在添加0.6m硫酸钠的高盐条件中，目标基因共表达菌株赖氨酸产量和葡萄糖转化率达到了4.20g/l和0.1g/g，分别比对照菌株提高了115％和127％，效果非常显著。
表3ncgl1418启动子同时调控dcpf1和lyse表达在赖氨酸合成中的应用效果
引用文献：
[10]sundhetal.,journalofindustrialmicrobiology&biotechnology2019,46(2):203-208.
[11]limyetal.,frontiersinbioengineeringandbiotechnology,2020,8:357.
[12]becker,j.,etal.,metab.eng.,2011,13,159-168.
[13]okirchner,etal.journalofbiotechnology,2003,104:287-299.
本说明书公开的所有技术特征都可以任何组合方式进行组合。本说明所公开的每个特征也可以被其它具有相同、相等或相似作用的特征所替换。因此，除非特殊说明，所公开的每一特征仅仅是一系列相等或相似特征的实例。
此外，从上述描述中，本领域技术人员可从本公开中很容易清楚本公开的关键特征，在不脱离本公开的精神及范围的情况下，可对发明进行很多修改以适应各种不同的使用目的及条件，因此这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。
序列表
<110>中国科学院天津工业生物技术研究所
<120>具有启动子活性的多核苷酸及其在生产目标化合物中的用途
<130>6a17-2018583i
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1.一种具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自如下(i)-(iv)中组成的组中的任一项：
(i)包含如seqidno：1-3任一序列所示的核苷酸序列；
(ii)包含如seqidno：1-3任一序列所示的核苷酸序列的反向互补序列；
(iii)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)或(ii)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
(iv)与(i)或(ii)所示的核苷酸序列具有至少80％，可选至少90％，优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。
2.根据权利要求1所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸在盐浓度或渗透压升高的环境中具有提高的启动子活性。
3.一种转录表达盒，其中，所述转录表达盒包含根据权利要求1或2所述的具有启动子活性的多核苷酸；可选地，所述转录表达盒还含有蛋白编码基因，所述蛋白编码基因与所述具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接。
4.一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含根据权利要求1或2所述的具有启动子活性的多核苷酸，或根据权利要求3所述的转录表达盒。
5.一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含根据权利要求3所述的转录表达盒，或根据权利要求4所述的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞来源于棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属或埃希氏菌属；优选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌；更优选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌atcc13032、谷氨酸棒杆菌atcc13869或谷氨酸棒杆菌atcc14067。
7.一种根据权利要求1或2所述的多核苷酸，根据权利要求3所述的转录表达盒，根据权利要求4所述的重组表达载体，根据权利要求5或6所述的重组宿主细胞在如下至少一种中的用途：
(a)调控基因的转录水平，或制备用于调控基因的转录水平的试剂或试剂盒；
(b)制备蛋白，或制备用于制备蛋白的试剂或试剂盒；
(c)生产目标化合物，或制备用于生产目标化合物的试剂或试剂盒。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述蛋白选自基因表达调控蛋白或与目标化合物合成相关的蛋白。
9.根据权利要求7或8所述的用途，其中，所述目标化合物包括氨基酸和有机酸中的至少一种；可选地，所述氨基酸包括赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸中的至少一种，所述有机酸包括柠檬酸和琥珀酸中的至少一种。
10.一种调控目标基因转录的方法，其中，所述方法包括将权利要求1-2任一项所述的具有启动子活性的多核苷酸与目标基因可操作地连接的步骤。
11.一种制备蛋白的方法，其特征在于，包括利用根据权利要求3所述的转录表达盒，根据权利要求4所述的重组表达载体，或根据权利要求5-6任一项所述的重组宿主细胞表达所述蛋白的步骤；可选地，所述蛋白为与目标化合物合成相关的蛋白或基因表达调控蛋白；
任选地，所述方法还包括分离或纯化所述蛋白的步骤。
12.一种生产目标化合物的方法，其中，包括利用权利要求3所述的转录表达盒，权利要求4所述的重组表达载体，或权利要求5-6任一项所述的重组宿主细胞表达与目标化合物合成相关的蛋白或基因表达调控蛋白，在所述与目标化合物合成相关的蛋白或所述基因表达调控蛋白存在的环境下生产目标化合物的步骤；
可选地，所述目标化合物包括氨基酸和有机酸中的至少一种；可选地，所述氨基酸包括赖氨酸、谷氨酸和苏氨酸中的至少一种，所述有机酸包括柠檬酸和琥珀酸中的至少一种；
可选地，所述蛋白为与赖氨酸合成相关的蛋白；可选地，所与赖氨酸合成相关的蛋白包括天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸氨裂合酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶甲酸还原酶、琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶、四氢吡啶二羧酸酯琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶、二氨基庚二酸差向异构酶、二氨基庚二酸脱酰基酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、赖氨酸运输蛋白、转酮酶、二氨基庚二酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶中的一种或两种以上的组合；
任选地，所述方法还包括分离或纯化所述目标化合物的步骤。
技术总结