一种高产蔗果三糖的菊糖蔗糖酶突变体的制作方法

专利2022-05-09 133

本发明涉及一种高产蔗果三糖的菊糖蔗糖酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。

背景技术：

菊糖蔗糖酶(inulosucrase，ec2.4.1.10)属于糖苷水解酶gh68家族，以蔗糖为唯一底物，发生水解反应生成葡萄糖和果糖，发生转糖基反应生成低聚果糖和菊糖。低聚果糖和菊糖均是被广泛认可的益生元，对于促进肠道益生菌的增殖具有显著作用。菊糖蔗糖酶在以蔗糖为底物时，果糖基不断转移到延长的菊糖链上，产物体系中含有不同聚合度菊糖。通过控制菊糖链的延伸，使得菊糖蔗糖酶失去合成长链菊糖的能力，对产物链长进行靶向调控，可生产出特定聚合度的低聚果糖。

蔗果三糖是最小的低聚果糖，是由一个果糖分子和一个蔗糖分子通过β-(2,1)或β-(2,6)连接而成的三糖。作为主要的低聚果糖成分，在促进益生菌包括柔嫩梭菌faecalibacteriumprausnitzii，双歧杆菌bifidobacterium的生长方面显示出比其他聚合度的低聚果糖更显著的效果。蔗果三糖存在于许多植物中，但其含量较低、分离纯化难是制约其工业应用的主要障碍。通过酶促合成和微生物发酵生产蔗果三糖具有促进其生产和工业应用的潜力。

技术实现要素：

技术问题：

目前，低聚果糖的生产主要通过β-呋喃果糖苷酶(ec3.2.1.26))和内切菊粉酶(ec3.2.1.7)进行。蔗果三糖的含量受不同来源的酶的限制，不能得到稳定的工业化生产工艺。关于菊糖蔗糖酶链长调控的研究，仅能使菊糖蔗糖酶生产不同聚合度的低聚果糖，没有关于用于生产蔗果三糖的研究。

本发明提供一种高产蔗果三糖的菊糖蔗糖酶的突变体酶，这一发现对于工业化制备蔗果三糖有重要的现实意义。

技术方案：

为了解决上述存在的技术问题，本发明通过定点突变的办法，对来自微生物lactobacillusreuteri121的菊糖蔗糖酶(lare121-isase)进行分子改造。

本发明的第一个目的是提供一种菊糖蔗糖酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如seqidno.4所示。

在一种实施方式中，所述突变体是在氨基酸序列如seqidno.2所示的菊糖蔗糖酶的基础上，将第425位的精氨酸替换为色氨酸。

本发明的第二个目的是提供编码所述菊糖蔗糖酶突变体的基因。

在一种实施方式中，所述基因的序列如seqidno.3所示。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体。

在一种实施方式中，所述载体包括但不限于pet系列载体。

在一种实施方式中，所述载体包括pet-22b( )。

本发明的第四个目的是提供表达所述菊糖蔗糖酶突变体的基因工程菌。

在一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主，以pet-22b( )为载体。

本发明的第五个目的是提供一种生产蔗果三糖的方法，所述方法是以所述菊糖蔗糖酶突变体或含有所述菊糖蔗糖酶突变体的基因工程菌为催化剂，以蔗糖为底物制备蔗果三糖。

在一种实施方式中，所述制备是以磷酸钠缓冲液作为缓冲体系。

在一种实施方式中，所述方法的蔗糖的添加量为600～800g/l。

在一种实施方式中，所述方法的菊糖蔗糖酶突变体的添加量为10～30μg/ml

在一种实施方式中，所述方法的生产条件为温度40～50℃，反应10～50h。

本发明还提供所述的突变体或所述的基因工程菌生产的蔗果三糖在医药生产、食品领域的应用。

有益效果：

单点突变体酶r425w显著改变了产物链长，使菊糖蔗糖酶失去合成多糖的能力，大量积累低聚果糖，尤其是蔗果三糖。经反应条件优化，r425w生产蔗果三糖的产量达206g/l。

附图说明

图1野生酶和突变体r425w的液相图。

图2突变体r425w产蔗果三糖的条件优化(a)加酶量的优化(b)蔗糖浓度的优化(c)蔗果三糖的产量随反应时间的变化。

具体实施方式

实施例1：菊糖蔗糖酶的三维结构分析及突变体质粒的构建

(1)突变点的确定。

来源于微生物lactobacillusreuteri121的部分序列截断的菊糖蔗糖酶(lare121-isδ121-701)在ncbi数据库的编号为aan05575.1，核苷酸序列如seqidno.1所示，氨基酸序列如seqidno.2所示。对lare121-isδ121-701进行三维建模，结合底物口袋构象、计算模拟、底物与酶分子相互作用，理性设计单点突变，选择425位的精氨酸，将其突变为侧链基团最大的色氨酸。

(2)质粒的构建。

1)构建原始质粒pet-22b( )-lare121-isδ121-701

合成核苷酸序列如seqidno.1所示的菊糖蔗糖酶(lare121-isδ121-701)，并插入到载体pet-22b( )的多克隆位点，测序验证，得到原始质粒pet-22b( )-lare121-isδ121-701。

2)构建突变质粒pet-22b( )-r425w

设计定点突变的突变引物(表2)，以携带lare121-isδ121-701基因的原始质粒pet-22b( )-lare121-isδ121-701为模板进行单点突变，将步骤(1)中菊糖蔗糖酶(lare121-isδ121-701)的第425位的精氨酸替换为色氨酸，构建得到突变质粒pet-22b( )-r425w。突变经pcr及模板消化反应两个步骤，模板消化的产物测序验证。突变体酶的核苷酸序列如seqidno.3所示，氨基酸序列如seqidno.4所示。

表1pcr反应体系

pcr反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸3min40s，32个循环，4℃保存。

表2引物序列表

表3模板消化反应体系

反应条件：37℃，反应90min。

实施例2：工程菌株的构建及突变体酶的表达、纯化

(1)工程菌株的构建。

将实施例1中得到的突变质粒pet-22b( )-r425w和原始质粒pet-22b( )-lare121-isδ121-701分别转化至大肠杆菌(e.coli)bl21(de3)感受态细胞中，涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb固体培养基中，于37℃培养12h后，分别得到长有重组工程菌e.colibl21/pet-22b( )-r425w和e.colibl21/pet-22b( )-lare121-isδ121-701的平板。

(2)突变体酶的表达。

挑取步骤(1)中平板上的单菌落到4ml含有50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基，于37℃培养12h得到种子液，将种子液转接入200ml含有50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基，于37℃培养2～3h，至od600值为0.6～0.8，加入终浓度为1mmol/l的iptg诱导蛋白的表达，于28℃培养6～8h，获得发酵液。将发酵液于4℃、8000rpm离心15min，收集菌体。

(3)突变体酶的纯化。

向步骤(2)中获得的菌体中加入20ml破碎缓冲液(50mmol/ltris-hcl，200mmol/lnacl，ph7.0)，充分重悬菌体，然后进行超声破碎，破碎后于4℃、8000rpm离心15min，收集上清液，即粗酶液。

使用镍离子亲和层析柱对粗酶液进行纯化。首先，使用平衡缓冲液(50mmol/ltris-hcl，500mmol/lnacl，ph7.0)平衡柱子；然后，将得到的粗酶液加入到柱子中；接着，用含有低浓度咪唑的缓冲液(50mmol/ltris-hcl，500mmol/lnacl，50mmol/l咪唑，ph7.0)冲洗杂蛋白；最后，用含有高浓度咪唑的缓冲液(50mmol/ltris-hcl，500mmol/lnacl，500mmol/l咪唑，ph7.0)洗脱，得到突变体酶r425w和亲本酶lare121-isδ121-701。

(4)在最适温度和ph的条件下测定菊糖蔗糖酶的酶活。

在ph6.5，55℃的反应条件下，以300g/l的蔗糖为底物，添加10μg步骤(3)获得的突变体酶r425w，反应20min。向反应体系中加入终浓度为100mmol/l的naoh冰浴20min终止反应，加入终浓度为100mmol/l的hcl中和体系。最终测得酶活为170u/mg。

实施例3：突变体酶r425w产蔗果三糖的条件优化

产物谱比较：以300g/l的蔗糖为底物，向1ml的反应体系里(ph6.5)分别加入10μg的实施例2获得的突变体酶r425w和亲本酶lare121-isδ121-701，于45℃反应12h。反应结束后向反应体系中加入终浓度为100mmol/l的naoh冰浴20min终止反应，加入终浓度为100mmol/l的hcl中和体系。反应产物的液相色谱图见图1。亲本酶lare121-isδ121-701产生不同聚合度的糖，而突变体酶r425w最高只能积累五糖，且大量积累蔗果三糖(图1)。

产蔗果三糖条件优化：

(1)优化加酶量。以300g/l的蔗糖为底物，向1ml的反应体系里(ph6.5)分别加入2、4、6、8、10、15、20、25、30μg的突变体酶r425w，于45℃反应12h。反应结束后向反应体系中加入终浓度为100mmol/l的naoh冰浴20min终止反应，加入终浓度为100mmol/l的hcl中和体系。结果如图2所示，当酶的添加量在10～30μg/ml时，蔗果三糖的产量可以达到40g/l以上。

(2)优化蔗糖浓度。分别以100、200、300、400、500、600、700、800g/l的蔗糖为底物，向1ml的反应体系里(ph6.5)加入15μg的酶，于45℃反应12h。反应结束后向反应体系中加入终浓度为100mmol/l的naoh冰浴20min终止反应，加入终浓度为100mmol/l的hcl中和体系。结果如图2所示，当蔗糖的添加量在600～800μg/ml时，蔗果三糖的产量可以达到160g/l以上。

(3)反应时间对蔗果三糖产量的影响。以700g/l的蔗糖为底物，向1ml的反应体系里(ph6.5)加入15μg的突变体酶r425w，于45℃反应3、5、7.5、10、12、15、20、24、30、36、42、48h。反应结束后向反应体系中加入终浓度为100mmol/l的naoh冰浴20min终止反应，加入终浓度为100mmol/l的hcl中和体系。结果如图2所示，当反应的时间在10～50h时，蔗果三糖的产量可以达到180g/l以上。

经反应条件优化，r425w生产蔗果三糖的产量最高可达206g/l。生产条件为ph6.5的磷酸盐缓冲液，45℃，700g/l的蔗糖，15μg/ml的加酶量，反应时间为36h。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

<120>一种高产蔗果三糖的菊糖蔗糖酶突变体

<130>baa210781a

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