本发明涉及涉及生物技术领域，具体为一种从真菌发酵液中高效分离提取黄曲霉毒素b1降解酶的方法。
背景技术：
自1960年英国火鸡暴发霉菌毒素疾病以来，世界各地对霉菌毒素中毒症进行了大量的调查研究。目前，已知有300多种真菌可产生霉菌毒素，主要的霉菌毒素包括：黄曲霉素(aflatoxin)、玉米赤霉烯酮、赭曲霉素、单端孢烯和橘霉素等。这些毒素分布较广，已从大量的饲料原料和混合饲料中分离出。在各种霉菌毒素中，黄曲霉素被认为是最严重、毒性最大的一种，这是因为它可使肝中毒，并具有很强的抑制免疫，致癌、致突变和致畸性。根据联合国粮农组织(fao)2002年资料，世界上约有25％的谷物不同程度地受到霉菌毒素的污染，而危害饲料最严重的有：黄曲霉、镰刀菌和青霉三种。这些霉菌主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物，其中玉米和小麦的阳性检出率可分别高达45％和20％以上。
动物在采食含有不同剂量黄曲霉毒素的日粮时，将表现为生长受阻、采食量减少、饲料利用率降低、被毛粗乱、精神沉郁、厌食、免疫抑制、肝损伤、黄疸、凝血病、贫血、出血性腹泻等不同症状，严重时可导致动物死亡。另外，饲料霉变后营养物质平均损失15％，甚至完全失去饲用价值。据报道，全球每年因霉毒素污染粮食和饲料所造成的经济损失高达数千亿美元。因而，寻找有效的方法来降低或消除霉菌毒素的危害，变得越来越重要。
目前，针对黄曲霉素降解霉，常用的浓缩提纯酶的方法有粗盐沉淀法、超滤法等，而对于真菌毒素降解酶的浓缩提纯工艺的研究少之又少，因此，我们查阅了很多真菌产纤维素酶的浓缩提纯工艺以做参考。粗盐沉淀法浓缩酶蛋白一方面工艺上盐的使用量较大，一方面容易造成酶活力的丧失。而超滤法更不适用于液态发酵生产的酶蛋白的浓缩提纯，一方面由于液态发酵液中存在大量的蛋白、多种降解产物以及微生物代谢废物极易堵塞超滤膜，降低生产效率，一方面是长时间的常温过膜工艺会造成酶活损失。
技术实现要素：
本发明的目的在于解决现有黄曲霉素降解霉提取工艺中存在的缺点，提供一种从真菌发酵液中高效分离提取黄曲霉毒素b1降解酶的方法，本方法利用植物源丹宁沉淀蛋白质的特性，把土曲霉发酵上清液中的afb1降解酶与丹宁形成复合物沉淀下来，聚乙二醇(peg6000)易于与沉淀复合物中的丹宁结合，使afb1降解酶得以解析，在保存酶生物活性的同时，实现afb1降解酶高效分离提纯的目的。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案是：
一种从真菌发酵液中高效分离提取黄曲霉毒素b1降解酶的方法，包括以下步骤：
步骤一：真菌发酵，选取土曲霉在培养基中进行培养，发酵液经过中速滤纸过滤，离心收集上清液a于离心管中，制得真菌发酵液；
步骤二：复合沉淀afb1降解酶，向步骤一中含有真菌发酵液的离心管内加入丹宁，其中丹宁的浓度为：10-80mg/ml，充分混匀后，沉淀10-70min，在5000-10000rpm转速条件下，离心5-20min，收集复合沉淀物c；
步骤三：复溶提取afb1降解酶，将步骤二中制得的复合沉淀物c用peg6000溶液充分复溶，其中peg6000溶液的浓度为10-40mg/ml，制得afb1降解酶液；
步骤四：测定afb1降解酶液的降解率。
为了进一步优化本发明，可优先选用以下技术方案：
优选的，所述真菌采用土曲霉，土曲霉的保藏编号为cgmccn0:18840。
优选的，所述步骤一中真菌发酵液的培养基条件：3g/l牛肉膏、10g/l蛋白胨、6g/l葡萄糖、5g/lnacl，以水配制，ph为7.0，高压灭菌121℃，发酵温度25-37℃、发酵时间3-7d、摇床转速150-180rpm、摇瓶类型为三凹三角瓶。
优选的，所述步骤四中，测定上清液afb1降解率的方法为：取975μl经过处理的发酵上清液与25μlafb1使用液(100μg/ml)置于灭菌的1.5ml棕色离心管中，旋涡30s，使其afb1浓度为2.5μg/ml，以无菌的发酵培养基加afb1作为空白对照，气浴摇床置于暗处，培养条件设置为150r/min、37℃、72h，3组平行实验；反应结束后，取反应体系于10ml试管中，取3倍体积的二氯甲烷旋涡震荡萃取60s，置于氮吹仪中，35℃下氮气缓慢吹干，用0.5ml流动相(水：甲醇：乙腈＝6:2:2)溶解剩余物(浓缩一倍)，涡旋震荡60s，0.22μm有机相滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中待检测。
优选的，所述色谱条件如下：高效液相色谱，安捷伦1290；色谱柱为agilentproshell120(4.6mm×150mm，4μm)；流动相为水：乙腈：甲醇＝60:20:20(v/v/v，室温)，柱温35℃，流速1ml/min，进样量：20μl。检测器：紫外检测器，检测波长365nm。
优选的，所述afb1降解率的计算方法，降解率＝(对照组afb1含量-实验组afb1含量)/对照组afb1含量×100％。
本发明的有益效果：
1、本发明公开的提纯方法，相比于传统粗盐沉淀法浓缩酶蛋白，一方面工艺上盐的使用量较大，一方面容易造成酶活力的丧失。而且，粗盐沉淀后的蛋白酶中含有大量盐需通过后续的透析来除去，步骤比较繁琐。而超滤法更不适用于液态发酵生产的酶蛋白的浓缩提纯，一方面由于液态发酵液中存在大量的蛋白、多种降解产物以及微生物代谢废物极易堵塞超滤膜，降低生产效率，一方面是长时间的常温过膜工艺会造成酶活损失。相比于其他方法，丹宁一聚乙二醇浓缩工艺可以简化操作、提高效率，且效果显著。丹宁是一类植物源天然多酚物质，而聚乙二醇是一类无毒、无刺激性，具有良好水溶性，常用于制药工艺中，因此两者不会给酶制剂带来任何安全隐患。且本方法操作简便，因为丹宁沉淀与peg提取时间短，不用保证严苛的外界环境，很大程度上保护了酶的生物活性，可满足工业需要。至今尚未发现丹宁-聚乙二醇浓缩工艺在液态发酵afb1降解酶浓缩提纯中的应用研究。
附图说明
图1为本提取工艺的示意图。
具体实施方式
实施例1：
一种从真菌发酵液中高效分离提取黄曲霉毒素b1降解酶的方法，包括以下步骤：
步骤一：真菌发酵，选取土曲霉在培养基中进行培养，发酵液经过中速滤纸过滤，离心收集上清液a于离心管中，制得真菌发酵液，土曲霉的保藏编号为cgmccn0:18840，真菌发酵液的培养基条件：3g/l牛肉膏、10g/l蛋白胨、6g/l葡萄糖、5g/lnacl，以水配制，ph为7.0，高压灭菌121℃，发酵温度25-37℃、发酵时间3-7d、摇床转速150-180rpm、摇瓶类型为三凹三角瓶；
步骤二：复合沉淀afb1降解酶，向步骤一中含有真菌发酵液的离心管内加入丹宁，其中丹宁的浓度为：10mg/ml，充分混匀后，沉淀10-70min，在5000-10000rpm转速条件下，离心5-20min，收集复合沉淀物c；
步骤三：复溶提取afb1降解酶，将步骤二中制得的复合沉淀物c用peg6000溶液充分复溶，其中peg6000溶液的浓度为10mg/ml，制得afb1降解酶液；
步骤四：测定afb1降解酶液的降解率。
实施例2：
一种从真菌发酵液中高效分离提取黄曲霉毒素b1降解酶的方法，包括以下步骤：
步骤一：真菌发酵，选取土曲霉在培养基中进行培养，发酵液经过中速滤纸过滤，离心收集上清液a于离心管中，制得真菌发酵液，土曲霉的保藏编号为cgmccn0:18840，真菌发酵液的培养基条件：3g/l牛肉膏、10g/l蛋白胨、6g/l葡萄糖、5g/lnacl，以水配制，ph为7.0，高压灭菌121℃，发酵温度25-37℃、发酵时间3-7d、摇床转速150-180rpm、摇瓶类型为三凹三角瓶；
步骤二：复合沉淀afb1降解酶，向步骤一中含有真菌发酵液的离心管内加入丹宁，其中丹宁的浓度为：40mg/ml，充分混匀后，沉淀10-70min，在5000-10000rpm转速条件下，离心5-20min，收集复合沉淀物c；
步骤三：复溶提取afb1降解酶，将步骤二中制得的复合沉淀物c用peg6000溶液充分复溶，其中peg6000溶液的浓度为20mg/ml，制得afb1降解酶液；
步骤四：测定afb1降解酶液的降解率。
实施例3：
一种从真菌发酵液中高效分离提取黄曲霉毒素b1降解酶的方法，包括以下步骤：
步骤一：真菌发酵，选取土曲霉在培养基中进行培养，发酵液经过中速滤纸过滤，离心收集上清液a于离心管中，制得真菌发酵液，土曲霉的保藏编号为cgmccn0:18840，真菌发酵液的培养基条件：3g/l牛肉膏、10g/l蛋白胨、6g/l葡萄糖、5g/lnacl，以水配制，ph为7.0，高压灭菌121℃，发酵温度25-37℃、发酵时间3-7d、摇床转速150-180rpm、摇瓶类型为三凹三角瓶；
步骤二：复合沉淀afb1降解酶，向步骤一中含有真菌发酵液的离心管内加入丹宁，其中丹宁的浓度为：60mg/ml，充分混匀后，沉淀10-70min，在5000-10000rpm转速条件下，离心5-20min，收集复合沉淀物c；
步骤三：复溶提取afb1降解酶，将步骤二中制得的复合沉淀物c用peg6000溶液充分复溶，其中peg6000溶液的浓度为30mg/ml，制得afb1降解酶液；
步骤四：测定afb1降解酶液的降解率。
实施例4：
一种从真菌发酵液中高效分离提取黄曲霉毒素b1降解酶的方法，包括以下步骤：
步骤一：真菌发酵，选取土曲霉在培养基中进行培养，发酵液经过中速滤纸过滤，离心收集上清液a于离心管中，制得真菌发酵液，土曲霉的保藏编号为cgmccn0:18840，真菌发酵液的培养基条件：3g/l牛肉膏、10g/l蛋白胨、6g/l葡萄糖、5g/lnacl，以水配制，ph为7.0，高压灭菌121℃，发酵温度25-37℃、发酵时间3-7d、摇床转速150-180rpm、摇瓶类型为三凹三角瓶。；
步骤二：复合沉淀afb1降解酶，向步骤一中含有真菌发酵液的离心管内加入丹宁，其中丹宁的浓度为：80mg/ml，充分混匀后，沉淀10-70min，在5000-10000rpm转速条件下，离心5-20min，收集复合沉淀物c；
步骤三：复溶提取afb1降解酶，将步骤二中制得的复合沉淀物c用peg6000溶液充分复溶，其中peg6000溶液的浓度为40mg/ml，制得afb1降解酶液；
步骤四：测定afb1降解酶液的降解率。
其中上述，测定上清液afb1降解率的方法为：取975μl经过处理的发酵上清液与25μlafb1使用液(100μg/ml)置于灭菌的1.5ml棕色离心管中，旋涡30s，使其afb1浓度为2.5μg/ml，以无菌的发酵培养基加afb1作为空白对照，气浴摇床置于暗处，培养条件设置为150r/min、37℃、72h，3组平行实验；反应结束后，取反应体系于10ml试管中，取3倍体积的二氯甲烷旋涡震荡萃取60s，置于氮吹仪中，35℃下氮气缓慢吹干，用0.5ml流动相(水：甲醇：乙腈＝6:2:2)溶解剩余物(浓缩一倍)，涡旋震荡60s，0.22μm有机相滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中待检测，色谱条件如下：高效液相色谱，安捷伦1290；色谱柱为agilentproshell120(4.6mm×150mm，4μm)；流动相为水：乙腈：甲醇＝60:20:20(v/v/v，室温)，柱温35℃，流速1ml/min，进样量：20μl。检测器：紫外检测器，检测波长365nm，afb1降解率的计算方法，降解率＝(对照组afb1含量-实验组afb1含量)/对照组afb1含量×100％。
通过对上述实施例的分析，当丹宁浓度为10-40mg/ml时，peg浓度为10-20mg/ml时，所得提纯酶液的afb1降解率为70-90％；当丹宁浓度为40-80mg/ml时，peg浓度为20-30mg/ml时，所得提纯酶液的afb1降解率为60-70％。因此，最优的丹宁浓度为10-40mg/ml，peg浓度为10-20mg/ml。
对比实验：粗盐沉淀粗提法的对比实验
取100ml发酵上清液加入24.3-31.3g已研磨好的(nh4)2so4固体粉末，使(nh4)2so4饱和度达到40-50％。在添加(nh4)2so4的过程中要注意缓慢均匀(可借助于磁力搅拌器)以及尽量保持低温环境，以免(nh4)2so4局部浓度过大使蛋白变性。(nh4)2so4添加后，将上清液放在2-4℃条件下过夜，10000-12000rpm低温离心10-20min获得蛋白沉淀。沉淀重新溶解在5ml磷酸(pb)缓冲液(20mmol/l，ph7.4)中，随后，样品用透析袋2-4℃透析12-24h，交换液为pb缓冲液。将透析过的各个饱和度下的样品通过与afb1反应，检测其降解率，hplc前处理及afb1降解率测定方法同第一步。
而当使用饱和度为40％-50％的(nh4)2so4沉淀发酵液中的afb1降解酶时，得到的透析后粗酶液降解率仅为45-50％。因此，与粗盐沉淀法相比，丹宁-聚乙二醇法浓缩提取发酵液中的afb1降解酶的降解效果较好，因为丹宁沉淀与peg提取时间短，不用保证严苛的外界环境，很大程度上保护了酶的生物活性，且具有高效，安全，简单易行等优点。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
1.一种从真菌发酵液中高效分离提取黄曲霉毒素b1降解酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：真菌发酵，选取土曲霉在培养基中进行培养，发酵液经过中速滤纸过滤，离心收集上清液a于离心管中，制得真菌发酵液；
步骤二：复合沉淀afb1降解酶，向步骤一中含有真菌发酵液的离心管内加入丹宁，其中丹宁的浓度为：10-80mg/ml，充分混匀后，沉淀10-70min，在5000-10000rpm转速条件下，离心5-20min，收集复合沉淀物c；
步骤三：复溶提取afb1降解酶，将步骤二中制得的复合沉淀物c用peg6000溶液充分复溶，其中peg6000溶液的浓度为10-40mg/ml，制得afb1降解酶液；
步骤四：测定afb1降解酶液的降解率。
2.根据权利要求1所述的一种从真菌发酵液中高效分离提取黄曲霉毒素b1降解酶的方法，其特征在于，包括：所述真菌采用土曲霉，土曲霉的保藏编号为cgmccn0:18840。
3.根据权利要求1所述的一种从真菌发酵液中高效分离提取黄曲霉毒素b1降解酶的方法，其特征在于，所述步骤一中真菌发酵液的培养基条件：3g/l牛肉膏、10g/l蛋白胨、6g/l葡萄糖、5g/lnacl，以水配制，ph为7.0，高压灭菌121℃，灭菌21min。发酵温度25-37℃、发酵时间3-7d、摇床转速150-180rpm、摇瓶类型为三凹三角瓶。
4.根据权利要求1所述的一种从真菌发酵液中高效分离提取黄曲霉毒素b1降解酶的方法，其特征在于：所述步骤四中，测定上清液afb1降解率的方法为：取975μl经过处理的发酵上清液与25μlafb1使用液(100μg/ml)置于灭菌的1.5ml棕色离心管中，旋涡30s，使其afb1浓度为2.5μg/ml，以无菌的发酵培养基加afb1作为空白对照，气浴摇床置于暗处，培养条件设置为150r/min、37℃、72h，3组平行实验；反应结束后，取反应体系于10ml试管中，取3倍体积的二氯甲烷旋涡震荡萃取60s，置于氮吹仪中，35℃下氮气缓慢吹干，用0.5ml流动相(水：甲醇：乙腈＝6:2:2)溶解剩余物(浓缩一倍)，涡旋震荡60s，0.22μm有机相滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中待检测。
5.根据权利要求4所述的一种从真菌发酵液中高效分离提取黄曲霉毒素b1降解酶的方法，其特征在于，所述色谱条件如下：高效液相色谱，安捷伦1290；色谱柱为agilentproshell120(4.6mm×150mm，4μm)；流动相为水：乙腈：甲醇＝60:20:20(v/v/v，室温)，柱温35℃，流速1ml/min，进样量：20μl。检测器：紫外检测器，检测波长365nm。
6.根据权利要求4所述的一种从真菌发酵液中高效分离提取黄曲霉毒素b1降解酶的方法，其特征在于，包括：所述afb1降解率的计算方法，降解率＝(对照组afb1含量-实验组afb1含量)/对照组afb1含量×100％。
7.根据权利要求1所述的一种从真菌发酵液中高效分离提取黄曲霉毒素b1降解酶的方法，其特征在于，所述丹宁的浓度为：10-40mg/ml，所述peg6000溶液的浓度为10-20mg/ml。
技术总结