本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种催化性能明显提高的(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体、其编码基因，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体或重组表达转化体催化潜手性羰基化合物，制备光学纯的羟基酸，特别是催化羰基位于γ和δ位的长链脂肪族酮酸(酯)不对称还原以制备光学纯的香料化合物(r)-γ/δ-内酯的应用。
背景技术：
香料是精细化学品的重要组成部分，广泛用于食品和日化产品中，它具有巨大的消费市场。许多内酯化合物由于具有香味，在香料中被广泛使用，例如γ-内酯和δ-内酯，即羟基酸的4-位或5-位上的羟基与链端的羧基脱水形成的内酯，它们具有天然的奶油和水果香味，如：(r)-γ-癸内酯具有出桃子、杏子和草莓的香气，(r)-δ-癸内酯具有椰奶香味，是内酯中主要的合成香料。其中，绝大多数(r)-对映异构体芳香气味浓郁，是天然香料的主要有效成分，经济附加值高。另外，从γ-内酯和δ-内酯这两种化合物的特殊结构可以看出，它们还是重要的基础化学品，比如是合成一些聚合物有用的构建模块，同时也是某些重要天然活性物质的组成部分，比如昆虫的信息素、抗生素等。因此，合成高光学纯度的γ-内酯或δ-内酯具有重大的经济价值。
早期，香料内酯化合物主要从植物中提取获得，由于技术有限，以分离提取的方式获得的香料量非常少，所以香料的价格一直很昂贵。随着科学技术的发展以及对香料香精化合物的需求不断膨胀，发酵技术得到了快速发展和运用。1963年，francke首次报道可以利用酿酒酵母和面包酵母细胞生成光学纯的γ-和δ-羟基酸(a.francke,nature,1963,197,384–385)。目前，工业上主要利用酵母属细胞进行发酵，利用细胞代谢途径将底物蓖麻油或蓖麻酸转化成所需要的内酯。在这些内酯化合物中，γ-癸内酯的代谢通路是第一个被发现的，也是通过生物技术手段实现产量最多的内酯化合物。an,jung-ung课题组以10-羟基硬脂酸或12-羟基硬脂酸为原料，通过waltomyceslipofer细胞的β-氧化可分别得到51g/l的(r)-γ-十二内酯、28g/l的(r)-γ-癸内酯、12g/l的(r)-γ-丁内酯，此产率是目前最高的(appl.microbiol.biotechnol.2013,97:8265-8272)。但发酵法获得的γ-内酯也存在副产物多、产品光学纯度低等问题，而且γ-癸内酯和它的前体4-羟基癸酸都被证明对酵母具有毒害作用，所以，为了解决这一矛盾，使用各种方法来减少内酯对发酵菌株的毒害，比如使用耐毒性的酵母、使用吸附剂将内酯从发酵液中分离出来或者酵母细胞进行固定化来保护酵母细胞，但是产量依然低。故其工业应用尚待深入研究。
随着有机化学的兴起，1996年kula人通过对蓖麻油酸进行臭氧分解获得(r)-(-)-1,3-壬二醇，在后续的合成中，保持手性羟基的构型不变，最后环化成γ-癸内酯(teteahedron.1996,52:11321-11324)。2004年corma等人使用sn-beta/过氧化氢为进行催化剂，以单加氧的方式获得δ-癸内酯(adv.syn.catal.2004,346:257-262)。2006年sabitha等人将手性的烯烃化合物催化加氢的方法获得δ-癸内酯。通过9步获得手性的化合物1，在h2环境下使用10％的pd/c作为催化剂加氢，最终获得δ-癸内酯(tetrahedronlett.2007,38:8179-8181)。化学的方法合成这些香味化合物经常会有一些副产物生产，有的还会产生不必要的色素杂质，在食品和饮料中应用也受到了限制。此外，化学合成中大量使用的金属催化剂不仅对环境安全不利，而且也不符合食品安全标准。
美国和欧洲立法都提到，“天然”风味物质只能通过物理过程(从天然来源中提取)和酶或微生物过程制备。生物法获得香料的方法包括酵母整细胞发酵和酶法催化。生物催化的方法来制备来γ-和δ-癸内酯一直受到人们的关注，对于内酯的生产来说，通过生物催化剂获得内酯主要有以下几种方法：(1)bvmo单加氧酶对环状的酮类化合物进行氧化；(2)水解酶通过动力学拆分外消旋的酯类化合物；(3)醇脱氢酶选择性氧化二醇化合物；(4)醇脱氢酶催化的不对称还原前手性的酮类化合物。blanco等发现猪胰腺酶(ppl)可以选择性的水解s-构型的γ-癸内酯成羟基酸，获得75％ee值的r-构型的γ-癸内酯(tetrahedronlett.1988,29:1915-1918)。boratyński等使用codexis公司的还原酶试剂盒筛选到一个醇脱氢酶padhiii。利用该酶在外加nad(p) 和fmn下将r-构型的二醇末端碳原子上的羟基进行氧化，然后分子内环化形成癸内酯。制备反应的分离得率为16％，产物的ee值为80％(r)，反应的过程中会有一部分的副产物生成如半缩醛(plosone.2016,11:e0146160)。
中国专利cn107142251a公开了沙雷氏菌羰基还原酶及其在制备光学活性烷基内酯中的应用，从粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)中克隆得到新的羰基还原酶(smcr)。smcr是首个不对称还原4-羰基癸酸和5-羰基癸酸的还原酶，在30℃下相对稳定，半衰期为90h，对4-羰基癸酸的km值为1.26mm，kcat为0.128min-1。通过两步酶-化学法级联反应，可获得ee值为99％的(r)-γ-癸内酯和ee值为95％的(r)-δ-癸内酯。在手性内酯的制备反应中，底物上载量最高达到75mm,催化剂上载量高达150g/l，反应时间长，时空产率底。
中国专利cn109797140a公开了羰基还原酶突变体、编码基因、重组载体和表达转化体及其在制备(r)-烷基内酯的应用，对smcr进行分子改造，获得了还原活力、稳定性和对映选择性提高的(r)-4-羰基癸酸(酯)还原酶突变体。该突变体在30℃下相比smcr更加稳定，半衰期高达124h，对4-羰基癸酸甲酯的km值为0.79mm，kcat为179min-1，对其它的4-位和5-位羰基化合物的还原活力均有不同程度的提高。在手性内酯的制备反应中，底物上载量最高可达1500mm，催化剂上载量为75g/l，反应时间短，时空产率高。但对5-羰基癸酸，此突变体的km值为6.89mm，kcat为17.16min-1，ee值为95％(r)，时空产率仅为56gl-1d-1。
综上所述，在合成光学纯(r)-γ-癸内酯和(r)-δ-癸内酯等内酯香料化合物的研究中，已知的羰基还原酶(smcr)和(r)-4-羰基癸酸(酯)还原酶突变体对5-羰基化合物仍存在着催化活性低，底物上载量低，产物得率低等问题。因此，需要催化性能更好的酶催化剂来对5-羰基化合物进行不对称还原，以满足反应效率高、底物浓度高、操作简单、产率高的工业化需求。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中羰基还原酶及其突变体的不足，通过蛋白质工程和定向进化的手段对其进行改造，进一步提高该突变体对底物5-羰基癸酸的活性；另一方面通过拓展底物谱，催化羰基位于γ和δ位的长链脂肪族和芳香族酮酸(酯)，制备多种香料内酯化合物，从而充分实现羰基还原酶突变体的商业价值，并降低酶催化剂的应用成本，有效简化合成内酯化合物的合成工艺，高效生产有价值的香料化合物。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的技术方案之一，获得催化性能明显改善的羰基还原酶突变体。
在先前报道中，本发明的发明人以来自粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)的羰基还原酶smcr为母本，通过随机突变与半理性改造，筛选到催化性能、稳定性及对映选择性均提高的突变体，其氨基酸序列如序列表seqidno.2所示(cn109797140a)。
本发明中，以该突变体基因作为母本，采用易错pcr、迭代饱和突变、dnashuffling等组合突变策略对其进行进一步定向进化，结合酶标仪高通量初筛和紫外分光光度计复筛，鉴别催化性能和热稳定性显著改善的(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶。
本发明(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体(以下简称smcr突变体)，其是将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸、第52位天冬酰胺、第61位赖氨酸、第104位谷氨酸、第107位亮氨酸、第127位赖氨酸、第145位天冬酰胺、第149位丙氨酸、第172位精氨酸、第210位甘氨酸或第226位谷氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其它氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质，所述衍生蛋白质具有高于seqidno.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的催化性能和热稳定性。
所述(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体氨基酸序列选择如下中的一种：
(1)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸；
(2)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第52位天冬酰胺替换为酪氨酸；
(3)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第127位赖氨酸替换为谷氨酸；
(4)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第52位天冬酰胺替换为酪氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸；
(5)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第210位甘氨酸替换为丝氨酸，第226位谷氨酸替换为甘氨酸；
(6)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第61位赖氨酸替换为缬氨酸；
(7)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第145位天冬酰胺替换为精氨酸；
(8)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸；
(9)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸；
(10)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸；
(11)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸；
(12)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第107位亮氨酸替换为异亮氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸；
(13)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸；
(14)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第104位谷氨酸替换为赖氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第172位精氨酸替换为丝氨酸；
(15)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第104位谷氨酸替换为赖氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸；
(16)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第107位亮氨酸替换为异亮氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸；
(17)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸，第172位精氨酸替换为丝氨酸；
(18)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第104位谷氨酸替换为赖氨酸，第107位亮氨酸替换为异亮氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸；
(19)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第104位谷氨酸替换为赖氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸，第172位精氨酸替换为丝氨酸；
(20)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第104位谷氨酸替换为赖氨酸，第107位亮氨酸替换为异亮氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸，第172位精氨酸替换为丝氨酸。
本发明的技术方案之二，提供了(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶(smcr)突变体的编码基因，以及含有所述编码基因的重组表达载体。
所述编码基因编码表达如技术方案一所述的进化改造获得的(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体，其来源包括：通过基因工程技术对技术方案一所述的系列smcr突变体的基因序列进行克隆；或者通过人工全序列合成的方法得到编码如技术方案一所述smcr突变体的核酸分子。
所述的重组表达载体可通过本领域常规方法，将本发明所述的羰基还原酶突变体基因的核苷酸序列连接于各种市售空载载体上构建而成。所述的市售空载载体可以是本领域常规的各种质粒载体，只要所述重组表达载体可以在相应的表达宿主中正常复制，并表达相应的还原酶即可。针对不同的表达宿主，优选的质粒载体是不同的。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。对于大肠杆菌宿主，所述优选质粒载体为pet-28a( )质粒。可通过下述方法制得本发明所述的大肠杆菌重组表达载体：将通过pcr扩增所得的smcr突变体基因片段用限制性内切酶ecori和hindiii双酶切，同时将空载质粒pet-28a( )同样用限制性内切酶ecori和hindiii双酶切，回收上述酶切后的smcr突变体的dna片段以及空载质粒，利用t4dna连接酶连接，构建获得用于大肠杆菌表达的含有所述smcr突变体编码核酸分子的重组表达载体。
本发明的技术方案之三，提供了一种包含本发明smcr突变体基因或其重组表达载体的重组表达转化体。可通过将已经构建好的重组表达载体转化至宿主细胞来制备重组表达转化体。所述宿主细胞为本领域的各种常规宿主细胞，要求是所述的重组表达载体能够稳定地自行复制并能通过诱导剂诱导后有效表达。本发明首选大肠杆菌作为宿主细胞，更优选大肠杆菌e.colibl21(de3)用于重组表达载体高效表达目标蛋白。
本发明的技术方案之四，提供一种重组(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体催化剂(以下简称smcr突变体催化剂)，所述的重组(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：
(1)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶(smcr)突变体的转化体细胞；
(2)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶(smcr)突变体的粗酶液；
(3)将所述(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶(smcr)突变体的粗酶液干燥得到的粗酶粉。
其中所述重组表达转化体的培养方法和条件为本领域常规的方法和条件，其包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组羰基还原酶。
对于重组大肠杆菌，优选培养基为lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l，ph6.5-7.0。优选的培养方法为：将如上所述构建的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素的lb培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜。按1％(v/v)的接种量接入装有100ml的lb培养基(含卡那霉素)的500ml三角烧瓶中，置于37℃、220rpm摇床振荡培养，当培养液的od600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1-0.5mmol/l的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)作为诱导剂，16-25℃诱导16-24h后，将培养液离心，收集沉淀，然后用生理盐水洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。将收获的重组细胞进行冷冻干燥，即可获得含有所述smcr突变体的冻干细胞。将收获的重组细胞悬浮于5-10倍体积(v/w)的缓冲液中，超声破碎，离心收集上清液，即可获得所述重组smcr突变体的粗酶液。收集的粗酶液放置在-80℃下冷冻，然后使用真空冷冻干燥机低温干燥，即可得到冻干酶粉。将所获得的冻干酶粉保存在4℃冰箱内，可以方便地使用。
本发明中所述smcr突变体的活力测定方法：将含4mmol/l5-羰基癸酸和0.1mmol/lnadph的1ml反应体系(100mmol/l磷酸钠缓冲液，ph6.0)预热至40℃，然后加入适量的smcr突变体，40℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处nadph的吸光度变化，记录1分钟内吸光度的变化值。
用下式计算得到酶活力：
酶活力(u)＝ew×v×103/(6220×l)
式中，ew为1分钟内340nm处吸光度的变化；v为反应液的体积，单位为ml；6220为nadph的摩尔消光系数，单位为l/(mol·cm)；l为光程距离，单位为cm。1个酶活力单位(u)定义为上述条件下每分钟催化氧化1μmolnadph所需的酶量。
本发明的技术方案之五，提供了所述重组smcr突变体或smcr突变体催化剂在γ/δ-内酯香料化合物合成中的应用，即提供了利用重组smcr突变体酶不对称还原潜手性羰基化合物制备多种不同香料内酯化合物的方法。其中所述潜手性羰基化合物可选自如下通式：
其中，化合物1：n＝1，r1＝c4h9，r2＝h
化合物2：n＝1，r1＝c5h11，r2＝h
化合物3：n＝1，r1＝c6h13，r2＝h
化合物4：n＝1，r1＝c6h13，r2＝ch3
化合物5：n＝1，r1＝c7h15，r2＝h
化合物6：n＝1，r1＝c8h17，r2＝h
化合物7：n＝2，r1＝c3h7，r2＝h
化合物8：n＝2，r1＝c4h9，r2＝h
化合物9：n＝2，r1＝c5h11，r2＝h
化合物10：n＝2，r1＝c6h13，r2＝h
化合物11：n＝2，r1＝c7h15，r2＝h
化合物12：n＝2，r1＝ph-c2h4，r2＝h
上面所述12种化合物利用smcr突变体或smcr突变体催化剂将羰基不对称还原成羟基，再环化形成对应的内酯化合物。
具体合成内酯化合物的途径如下通式：
在前述应用中，潜手性羰基化合物的浓度可为20～200mmol/l，所述smcr突变体或smcr突变体催化剂的用量可选用为50～200u/mmol潜手性羰基化合物。
在本发明的一个实施方式中，反应中所需的nadph或nadp 的用量为0.1～0.5mmol/l。反应过程中可利用葡萄糖作为辅底物，通过葡萄糖脱氢酶催化实现反应体系中nadph的辅酶循环，所述葡萄糖脱氢酶的用量可为50～200u/mmol潜手性羰基化合物，所述葡萄糖的用量可为1.5倍mmol潜手性羰基化合物。
在本发明的一个实施方式中，不对称还原过程中所需的磷酸盐缓冲液为本领域常规磷酸盐缓冲液，如磷酸钠缓冲液，其浓度较佳为100mmol/l。
在本发明的一个实施方式中，所述的不对称还原反应是在振荡或搅拌条件下进行。
在本发明的一个实施方式中，所述的不对称还原反应的温度为20～40℃，优先30℃。所述的不对称还原反应的时间以底物完全反应完或反应自行终止的时间为准，优选反应时间小于24h。
与现有技术相比，本发明的创新和改进效果在于：
本发明提供了一种催化性能更好的(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体，高效催化长链酮酸(酯)中γ/δ-羰基的不对称还原，制备光学纯的内酯化合物如：(r)-δ-壬内酯、(r)-δ-癸内酯、(r)-δ-十一内酯、(r)-δ-十二内酯。所述的内酯化合物由于具有其独特的香味，可作为香料产品，在香料市场上具有广泛的应用价值。本发明将该(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶偶联实现辅酶原位再生，大大减少辅酶用量。对于固态的疏水性底物5-羰基癸酸，在催化浓度高达200mm时，所述的羰基还原酶能够在3h实现98％的转化率，时空产率达到301g-1l-1day-1。相比于母本(r)-4-羰基癸酸(酯)还原酶(smcr)突变体，本发明得到的(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体在针对5-位羰基化合物底物时，具有催化活性高，耐受高浓度底物，反应产物光学纯度高，最终的分离得率高等优势，因此具有更好的工业应用前景。
具体实施方式
本发明内容中所述的各反应或检测条件，可根据本领域常识进行组合或更改，并可通过实验得到验证。下面将结合具体实施例，对本发明中的技术方案和技术效果进行清楚、完整地描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
下列实施例中的材料来源为：
母本重组质粒pet28a-smcrv4，含有如序列表seqidno.1所示的核酸序列，为发明人自行构建，在专利cn109797140a中也有公开。
质粒载体pet28a购自novagen公司。
e.colibl21(de3)感受态细胞、2×taqpcrmastermix、琼脂糖凝胶dna回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。
限制性内切酶ecori、hindiii均为newenglandbiolabs(neb)公司的市售产品。
除非另有说明，下列实施例中的具体实验按照本领域常规方法和条件进行，或遵照试剂盒的商品说明书。
实施例1随机突变筛选活性提高的smcr突变体
采用易错pcr技术对如seqidno.2所示氨基酸序列的smcr随机突变。
使用的引物为：
上游引物，如seqidno.3所示：
ccggaattcatgagcttcgaaggtaaa
下游引物，如seqidno.4所示：
cccaagcttttaaatcatgtacatgcc
其中上游引物下划线所示序列为ecori的酶切位点，下游引物下划线所示序列为hindiii的酶切位点。
以pet28a-smcr为模板，用rtaqdna聚合酶进行易错pcr，构建随机突变库。pcr体系(50μl)：rtaqdna聚合酶0.5μl，10×pcrbuffer(mg2 plus)5.0μl，dntpmixture(各2.0mm)4.0μl，终浓度为250μmol/l的mncl2，pet28a-smcrv4质粒100ng，上下游引物(10μm)各2μl，加灭菌蒸馏水补足至50μl。pcr反应程序：(1)95℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)58℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)共进行30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存产物。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，对回收后的目的基因与空载质粒pet28a分别用限制性内切酶ecori和hindiii在37℃双酶切6h。双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，用t4dna连接酶将得到的线性化pet28a质粒与纯化后的目的基因片段置于16℃连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌e.colibl21(de3)感受态细胞中，并均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb琼脂平板上，置于37℃培养箱中静置培养约12h。
将转化平板上的突变体用牙签挑入96孔深孔板中，于37℃，220rpm摇床中培养过夜。从一级板的孔洞中吸取10μl菌液接入二级板的相应孔洞中，于37℃，220rpm摇床中培养2～3h后，加入终浓度为0.2mm的iptg，16℃培养24h。然后于4℃、3500×g离心10min，倒掉上层培养基，每个孔洞中加入300μl溶菌酶液(1000mg溶菌酶和10mgdna酶溶解于1l去离子水中)，振荡混匀，再于37℃摇床上处理2h。4℃、3500×g离心15min，取100μl细胞破碎离心上清液转移到每个孔加了100μl反应液的96孔酶标板中，100μl反应液由100mmpbs(ph6.0)和8mm5-羰基癸酸以及0.2mmnadph组成。35℃、震荡混匀，在酶标仪上读取340nm处吸光度值的减少。在96孔板中对表达的蛋白进行高通量活力筛选，对活性较高的突变体进行纯化表征，对相应的基因进行测序。
通过实施例1所述的酶标仪高通量筛选，发现将第23位谷氨酸替换为赖氨酸(e23k)，第127位赖氨酸替换为谷氨酸(k127e)，第52位天冬酰胺替换为酪氨酸(n52y)，第107位亮氨酸替换为异亮氨酸(l107i)和第149位丙氨酸替换为苏氨酸(a149t)等突变体对5-羰基癸酸的活性提高。
实施例2半理性构建smcr突变体
在实施例1中，利用易错pcr技术和高通量筛选方法，成功筛选到催化活性提高的多种突变体。对其中的最佳突变体进行同源建模，然后用建模出来的突变体模型与5-羰基癸酸进行分子对接，根据短链脱氢酶的催化机理与结合能情况，选择合适的对接姿势模型。通过对底物口袋附近的氨基酸进行定点饱和突变和组合突变，进一步提高酶的活性。如seqidno.2所示氨基酸序列的smcrv4立体空间结构中，在底物5-羰基癸酸结合位点周围的氨基酸残基包括：90位苏氨酸、92位天冬氨酸、137位甘氨酸、139位缬氨酸、143位蛋氨酸、145位天冬酰胺、37位苏氨酸以及61位赖氨酸等。采用定点饱和突变技术，对这些位点的氨基酸残基进行饱和突变。
使用的引物为：
以pet28a-smcrv4为模板，使用primestarhspremix进行pcr扩增。pcr体系为：2×primestarhspremix10μl，上下游引物各1μl，pet28a-smcr质粒40ng，dmso1μl，加灭菌蒸馏水补足至20μl。pcr反应程序：(1)95℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸6.3min；步骤(2)～(4)共进行30个循环；最后72℃延伸10min。再加1μl的dpni酶到20μl的pcr产物中并在37℃条件下保温3h消化模板，将消化产物转化到大肠杆菌e.colibl21(de3)感受态细胞中，并均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb琼脂平板上，置于37℃培养箱中静置培养约12h。将所得到的单克隆菌落挑取到96孔深孔板中进行培养，对培养的细胞进行破壁，以nadph为辅酶，在96孔板中对表达的蛋白进行高通量活力筛选，对活性较高的突变体进行纯化表征，对相应的基因进行测序。
通过实施例1和2所述的酶标仪高通量筛选，发现将第61位赖氨酸替换为缬氨酸(k61v)、第145位天冬酰胺替换为精氨酸(n145r)等突变体对5-羰基癸酸的活性提高。
实施例1和2所述smcr突变体酶活力测定方法：将含4mmol/l5-羰基癸酸和0.1mmol/lnadph的1ml反应体系(100mmol/l磷酸钠缓冲液，ph6.0)预热至40℃，然后加入适量的smcr突变体酶液，40℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处的吸光度变化，记录1分钟内吸光度的变化值，计算酶活力。
实施例1和2所述smcr突变体的高通量活力筛选测定方法：将含4mmol/l5-羰基癸酸和0.1mmol/lnadph的磷酸钠缓冲液(100mmol/l，ph6.0)分装到96孔板中，预热至35℃，然后分别加入适量的smcr突变体酶液，35℃振荡反应，在酶标仪上检测340nm处nadph的吸光度变化，记录10分钟内吸光度的变化值，计算相应的酶活力。
通过实施例1和2的筛选，得到了对5-羰基癸酸活性显著提高的突变体，这些突变体的序列以及这些突变体对5-羰基癸酸的活性列于表1中。在表1提供本发明公开的具有相关活性的特定序列的羰基还原酶smcr突变体的列表，在下列表中，序列标号分别指表1后面的一些列序列，一个加号“ ”表示突变体蛋白比由seqidno.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了0.1-3倍；两个加号“ ”表示突变体蛋白比由seqidno.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了3-10倍；三个加号“ ”表示突变体蛋白比由seqidno.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了10-20倍。
表1：(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体序列和相应的活性改进列表
所述(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体氨基酸具有如下序列中的一种：
(1)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸；
(2)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第52位天冬酰胺替换为酪氨酸；
(3)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第127位赖氨酸替换为谷氨酸；
(4)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第52位天冬酰胺替换为酪氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸；
(5)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第210位甘氨酸替换为丝氨酸，第226位谷氨酸替换为甘氨酸；
(6)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第61位赖氨酸替换为缬氨酸；
(7)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第145位天冬酰胺替换为精氨酸；
(8)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸；
(9)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸；
(10)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸；
(11)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸；
(12)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第107位亮氨酸替换为异亮氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸；
(13)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸；
(14)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第104位谷氨酸替换为赖氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第172位精氨酸替换为丝氨酸；
(15)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第104位谷氨酸替换为赖氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸；
(16)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第107位亮氨酸替换为异亮氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸；
(17)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸，第172位精氨酸替换为丝氨酸；
(18)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第104位谷氨酸替换为赖氨酸，第107位亮氨酸替换为异亮氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸；
(19)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第104位谷氨酸替换为赖氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸，第172位精氨酸替换为丝氨酸；
(20)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第104位谷氨酸替换为赖氨酸，第107位亮氨酸替换为异亮氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸，第172位精氨酸替换为丝氨酸。
实施例3重组e.colibl21(de3)/pet28a-smcrm15的表达及酶法制备
将实施例2中获得的突变体m15的重组大肠杆菌e.colibl21(de3)/pet28a-smcrm15接种至含50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，之后按1％(v/v)的接种量接入装有100mllb培养基(含50μg/ml卡那霉素)的500ml三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的od600达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/l的iptg作为诱导剂，16℃诱导24h。将培养液以8000×g离心10min，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得到静息细胞。将100ml培养液中获得的细胞悬浮于15ml的磷酸钠缓冲液(100mm,ph7.0)中，冰水浴中进行如下超声破碎：350w功率，工作4s，间歇6s，破碎时间10min，4℃下12000×g离心40分钟，收集上清粗酶液。另外，将收获的粗酶液冷冻干燥，即可获得冻干酶粉。
实施例4-15重组smcrm15催化不同潜手性底物不对称还原反应
在2ml离心管中进行反应，1ml磷酸钠缓冲液(100mm,ph6.0)中加入4mm的不同潜手性底物，10mm的葡萄糖，0.2mm的nadp ，0.5u的如实施例3获得的重组smcrm15粗酶液，2u的葡萄糖脱氢酶。反应在振荡器上1000rpm，30℃下进行。反应12小时，用2m硫酸溶液终止反应，用等体积的乙酸乙酯萃取，再加无水硫酸钠干燥过夜，测定底物转化率和还原产物的ee值。结果见表2。
表2smcrm15催化不同潜手性底物不对称还原反应的结果
表2实施例4-15中smcrm15催化不同潜手性底物所得的终产物ee值的分析条件，如表3所示。
表3smcrm15催化不同潜手性底物所得的终产物ee值的分析条件
实施例16重组smcrm15催化合成δ-壬内酯
在100ml夹套反应器中，在含50mm底物5-羰基壬酸和75mm葡萄糖的50ml的磷酸钠缓冲液(100mm,ph6.0)中，加入40g/l如实施例3所述突变体重组表达转化体(e.colibl21(de3)/pet28a-smcrm15)的湿细胞，同时加入2g/l葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉，最后加入0.2mm的nadp 用于辅酶的循环再生。在搅拌桨搅拌下于30℃水浴中进行反应，并通过自动电位滴定仪控制流加1mol/l的碳酸钠溶液使ph控制在6.0。反应1小时后，加入浓硫酸终止反应并使反应液的ph为2。再用1.5倍体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，然后旋转蒸发除去溶剂乙酸乙酯，再将其溶解在ch2cl2(5mlg-1粗品)中，冰浴冷却至0℃后加入三氟乙酸(0.04mlg-1粗品)并在室温下搅拌6小时，完成内酯化反应，然后用饱和碳酸氢钠水溶液除去三氟乙酸后分离有机层用，并用无水硫酸钠干燥过夜，最后用硅胶层析柱纯化粗产品，用乙酸乙酯和石油醚(1:10)的流动相洗脱目标产物δ-壬内酯，得320mg产物，纯度为99％。用气相色谱法测定得：底物转化率为98％，产物ee值为98％(r)。
实施例17重组smcrm15催化合成δ-癸内酯
在100ml夹套反应器中，在含200mm底物5-羰基癸酸和300mm葡萄糖的50ml的磷酸钠缓冲液(100mm,ph6.0)中，加入80g/l如实施例3所述突变体重组表达转化体(e.colibl21(de3)/pet28a-smcrm15)的湿细胞，同时加入4g/l葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉，最后加入0.2mm的nadp 用于辅酶的循环再生。在搅拌桨搅拌下于30℃水浴中进行反应，并通过自动电位滴定仪控制流加1mol/l的碳酸钠溶液使ph控制在6.0。反应3小时后，加入浓硫酸终止反应并使反应液的ph为2。再用1.5倍体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，然后旋转蒸发除去溶剂乙酸乙酯，再将其溶解在ch2cl2(5mlg-1粗品)中，冰浴冷却至0℃后加入三氟乙酸(0.04mlg-1粗品)并在室温下搅拌6小时，完成内酯化反应，然后用饱和碳酸氢钠水溶液除去三氟乙酸后分离有机层用，并用无水硫酸钠干燥过夜，最后用硅胶层析柱纯化粗产品，用乙酸乙酯和石油醚(1:10)的流动相洗脱目标产物，得1.42g产物，纯度为99％。用气相色谱法测定得：底物转化率为98％，产物ee值为99％(r)。
实施例18重组smcrm15催化合成δ-十一内酯
在100ml夹套反应器中，在含50mm底物5-羰基十一酸和75mm葡萄糖的50ml的磷酸钠缓冲液(100mm,ph6.0)中，加入40g/l如实施例3所述突变体重组表达转化体(e.colibl21(de3)/pet28a-smcrm15)的湿细胞，同时加入2g/l的葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉，最后加入0.2mm的nadp 用于辅酶的循环再生。在搅拌桨搅拌下于30℃水浴中进行反应，并通过自动电位滴定仪控制流加1mol/l的碳酸钠溶液使ph控制在6.0。反应1.5小时后，加入浓硫酸溶液终止反应并使反应液的ph为2。再用1.5倍体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，然后旋转蒸发除去溶剂乙酸乙酯，再将其溶解在ch2cl2(5mlg-1粗品)中，冰浴冷却至0℃后加入三氟乙酸(0.04mlg-1粗品)并在室温下搅拌6小时，完成内酯化反应，然后用饱和碳酸氢钠水溶液除去三氟乙酸后分离有机层用，并用无水硫酸钠干燥过夜，最后用硅胶层析柱纯化粗产品，用乙酸乙酯和石油醚(1:10)的流动相洗脱目标产物，得380mg产物，纯度为99％。用气相色谱法测定得：底物转化率为99％，产物ee值为99％(r)。
实施例19重组smcrm15催化合成δ-十二内酯
在100ml夹套反应器中，在含50mm底物5-羰基十二酸和75mm葡萄糖的50ml的磷酸钠缓冲液(100mm,ph6.0)中，加入40g/l如实施例3所述突变体重组表达转化体(e.colibl21(de3)/pet28a-smcrm15)的冻干酶粉，同时加入2g/l的葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉，最后加入0.2mm的nadp 用于辅酶的循环再生。在磁力搅拌下于30℃水浴中进行反应，并通过自动电位滴定仪控制流加1mol/l的碳酸钠溶液使ph控制在6.0。反应1小时后，加入浓硫酸终止反应并使反应液的ph为2。再用1.5倍体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，然后旋转蒸发除去溶剂乙酸乙酯，再将其溶解在ch2cl2(5mlg-1粗品)中，冰浴冷却至0℃后加入三氟乙酸(0.04mlg-1粗品)并在室温下搅拌6小时，完成内酯化反应，然后用饱和碳酸氢钠水溶液除去三氟乙酸后分离有机层用，并用无水硫酸钠干燥过夜，最后用硅胶层析柱纯化粗产品，用乙酸乙酯和石油醚(1:10)的流动相洗脱目标产物，得320mg产物，纯度为99％。用气相色谱法测定得：底物转化率为76％，产物ee值为90％(r)。
实施例16-19给出了制备不同δ-内酯香料化合物的实施例。
以上实施例4-实施例19是以重组smcrm15为例来说明其催化不同潜手性底物不对称还原反应、催化合成δ-壬内酯、催化合成δ-癸内酯、催化合成δ-十一内酯、催化合成δ-十二内酯等方面的具体应用。需要说明的是：如表1所示，重组smcrm15只是本发明多种(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体中的其中一种，由表1可知，其他种类的(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体同样比seqidno.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高很多，所以，本领域技术人员知晓，其他种类的(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体同样可以催化不同潜手性底物不对称还原反应、催化合成δ-壬内酯、催化合成δ-癸内酯、催化合成δ-十一内酯、催化合成δ-十二内酯，并具有相当的技术效果。本发明实施例中只是以以重组smcrm15为例来说明而已。
可以看出，利用本发明方法所得重组突变体酶制剂可以高效地催化不同链长的位于δ位羰基的脂肪族化合物，再结合化学法即使用三氟乙酸有效地使羟基酸/酯化合物环化形成δ-内酯化合物，此类化合物具有果香味，具有非常大的应用价值。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>华东理工大学
<120>(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体及其在制备(r)-γ/δ-内酯中的应用
<160>36
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
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<213>粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)
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<213>粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)
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1.一种(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体，其特征在于，其是将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸、第52位天冬酰胺、第61位赖氨酸、第104位谷氨酸、第107位亮氨酸、第127位赖氨酸、第145位天冬酰胺、第149位丙氨酸、第172位精氨酸、第210位甘氨酸或第226位谷氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其它氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质，且所述衍生蛋白质具有高于seqidno.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的催化性能和热稳定性。
2.根据权利要求1所述(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体，其特征在于，所述(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体具有如下序列中的一种：
(1)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸；
(2)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第52位天冬酰胺替换为酪氨酸；
(3)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第127位赖氨酸替换为谷氨酸；
(4)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第52位天冬酰胺替换为酪氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸；
(5)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第210位甘氨酸替换为丝氨酸，第226位谷氨酸替换为甘氨酸；
(6)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第61位赖氨酸替换为缬氨酸；
(7)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第145位天冬酰胺替换为精氨酸；
(8)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸；
(9)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸；
(10)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸；
(11)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸；
(12)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第107位亮氨酸替换为异亮氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸；
(13)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸；
(14)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第104位谷氨酸替换为赖氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第172位精氨酸替换为丝氨酸；
(15)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第104位谷氨酸替换为赖氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸；
(16)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第107位亮氨酸替换为异亮氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸；
(17)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸，第172位精氨酸替换为丝氨酸；
(18)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第104位谷氨酸替换为赖氨酸，第107位亮氨酸替换为异亮氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸；
(19)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第104位谷氨酸替换为赖氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸，第172位精氨酸替换为丝氨酸；
(20)将如seqidno.2所示氨基酸序列的第23位谷氨酸替换为赖氨酸，第61位赖氨酸替换为缬氨酸，第104位谷氨酸替换为赖氨酸，第107位亮氨酸替换为异亮氨酸，第127位赖氨酸替换为谷氨酸，第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第149位丙氨酸替换为苏氨酸，第172位精氨酸替换为丝氨酸。
3.一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸编码如权利要求1或2所述的(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求3所述的核酸。
5.一种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体包含如权利要求4所述的重组表达载体。
6.一种重组(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体催化剂，其特征在于，所述的重组(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：
(1)培养如权利要求5所述的重组表达转化体，分离含有所述(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体的转化体细胞；
(2)培养如权利要求5所述的重组表达转化体，分离含有所述(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体的粗酶液；
(3)将所述(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体的粗酶液干燥得到的粗酶粉。
7.如权利要求1或2所述的一种(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体或如权利要求6所述重组(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体催化剂作为催化剂在不对称还原潜手性羰基化合物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述潜手性羰基化合物的浓度为50～200mmol/l，所述(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体或所述重组(r)-5-羰基癸酸(酯)还原酶突变体催化剂的用量选用为50～200u/mmol潜手性羰基化合物。
9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，不对称还原反应中额外添加葡萄糖脱氢酶，葡萄糖，辅酶nadph或nadp ；
优选地，所述葡萄糖脱氢酶的用量为50～200u/mmol潜手性羰基化合物，所述葡萄糖的用量为1.5倍mmol潜手性羰基化合物，所述辅酶nadph或nadp 的用量为0.1～0.5mmol/l。
10.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述的潜手性羰基化合物的通式为：
其中，所述的潜手性羰基化合物选择以下化合物中的一种或几种：
化合物1：n＝1，r1＝c4h9，r2＝h；
化合物2：n＝1，r1＝c5h11，r2＝h；
化合物3：n＝1，r1＝c6h13，r2＝h；
化合物4：n＝1，r1＝c6h13，r2＝ch3；
化合物5：n＝1，r1＝c7h15，r2＝h；
化合物6：n＝1，r1＝c8h17，r2＝h；
化合物7：n＝2，r1＝c3h7，r2＝h；
化合物8：n＝2，r1＝c4h9，r2＝h；
化合物9：n＝2，r1＝c5h11，r2＝h；
化合物10：n＝2，r1＝c6h13，r2＝h；
化合物11：n＝2，r1＝c7h15，r2＝h；
化合物12：n＝2，r1＝ph-c2h4，r2＝h。
技术总结