本发明属于微生物分离
技术领域：
，尤其涉及一种高通量分离噬菌体的方法。
背景技术：
：噬菌体是一类自然界大量存在的细菌病毒，依据功能不同可分为温和性噬菌体和裂解性噬菌体。因裂解性噬菌体具有高度的宿主特异性及其能裂解宿主细菌进行自我繁殖的特性，所以噬菌体相关研究在医学及食品工业的应用受到越来越广泛的关注，噬菌体治疗和噬菌体靶向灭菌也拥有广阔的应用前景。目前功能性噬菌体均为从环境中取样筛选，多采用双层琼脂平板法，不能快速筛选大量样品。高通量考马斯亮蓝法是通过酶标仪高通量检测样品吸光度变化来缩小含噬菌体的样品范围，透过0.22μm分子滤膜滤去杂菌，得到对应宿主菌特异性噬菌体的一种高通量筛选噬菌体的方法。但其操作步骤中忽略了蛭弧菌也可透过0.22μm分子滤膜，造成后续实验中蛭弧菌裂解的宿主菌细胞内容物与考马斯亮蓝g-250发生反应，造成“假阳性”结果。技术实现要素：本发明实施例的目的在于提供一种新型高通量分离噬菌体的方法，以解决上述
背景技术：
中提出的问题。为实现上述目的，本发明实施例提供一种高通量分离噬菌体的方法，包括以下步骤：制备对数生长期的宿主菌富集液、高通量考马斯亮蓝法筛选噬菌体、氯仿处理除去杂菌、双层琼脂平板法纯化。优选地，制备对数生长期的宿主菌富集液：取宿主菌接入对应培养基中混匀恒温培养，每30min取200μl菌液于96孔板，595nm测定其od值，直至其od值不再上升，确定其对数生长期，制备对数生长期的宿主菌富集液。优选地，高通量考马斯亮蓝法筛选噬菌体：待分离样品离心6-10min，取上清液100-200μl加入96孔板，再加入对数期宿主菌富集液200-400μl，然后放入lb培养基中，混合培养；同时设置对照组，使用与待测样品等量的lb培养基，混合培养；按每孔吸取250μl的量，从实验组和对照组分别吸取培养后液体，在离心6-10min收集上清液，取离心后液体加入考马斯亮蓝g-250溶液和无菌水，混合均匀加入96孔板中，在595nm下测量od值；挑选od值与对照组相比上升0.1-1.0的实验组液体，作为宿主菌的噬菌体原液。优选地，所述氯仿处理除去杂菌为：将噬菌体原液加入对数期宿主菌富集液中增菌，取增菌后液体离心，得到噬菌体蛭弧菌混合液；取噬菌体蛭弧菌混合液，加入氯仿，漩涡振荡3-5min，油镜观测有无蛭弧菌残留，得到噬菌体液。优选地，取噬菌体液，加入对数期宿主菌富集液，混匀使其充分感染后，加入40-50℃左右质量分数为0.4％琼脂lb半固体培养基，混匀迅速倒入下层板上；倒置培养，观测有无出现溶菌环，挑选形态大小一致的单个噬菌斑，使用接种针穿刺目标噬菌斑，将穿刺后带的噬菌体接种针伸入sm培养液充分混匀，并于冰箱冷藏过夜；使用上述带噬菌体的sm培养液代替噬菌体液，重复上次步骤4-5次后可得到纯化噬菌体液。优选地，所述噬菌体蛭弧菌混合液与氯仿之间的体积比为200：1-5。优选地，所述下层板采用质量分数为1.2％琼脂的lb固体培养基。综上所述，由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：本发明实施例提供了一种高通量分离噬菌体的方法，本发明实施例通过加入氯仿毒杀菌群的方法，避免噬菌体液出现残留杂菌，且本发明实施例中对经过初步纯化后的噬菌体液经双层琼脂平板法与宿主菌培混合养分离纯化，进一步得到纯化效果好的噬菌体液。附图说明图1为vsb001对atcc13311宿主裂解后的噬菌斑。图2为vsb002对cmcc50094宿主裂解后的噬菌斑。图3为vsb003对mtc8325宿主裂解后的噬菌斑。具体实施方式为了使本发明实施例的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明实施例进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明实施例，并不用于限定本发明实施例。目前，通过高通量考马斯亮蓝法筛选得到的噬菌体中含有蛭弧菌。本发明实施例通过采用加入氯仿毒杀菌群的方法，避免噬菌体液出现残留杂菌，且本发明实施例中对经过初步纯化后的噬菌体液经双层琼脂平板法与宿主菌培混合养分离纯化，进一步得到纯化效果好的噬菌体液。实施例1制备对数生长期的宿主菌富集液：取20μlatcc13311菌液接入20mllb培养基中混匀37℃恒温培养，每30min取200μl菌液于96孔板，595nm测定其od值，直至其od值不再上升，将所得数据使用excel作图，得到atcc13311的对数期的生长曲线，约为12h。高通量考马斯亮蓝法筛选噬菌体：前增菌后新鲜土壤样品，8000g，21℃离心6min，取上清液100μl加入96孔板，再加入对数期atcc13311富集液200μl，然后放入lb培养基中，37℃混合培养12h；同时设置对照组，使用与待测样品等量的lb培养基，37℃混合培养12h；按每孔吸取250μl的量，从实验组和对照组分别吸取培养后液体，在8000g，21℃下离心6min收集上清液，取离心后液体100μl加入100μl考马斯亮蓝g-250溶液和300μl无菌水，混合均匀各取250μl加入96孔板中，在595nm下测量od值，减去对照组(a1-a4取平均值)后，得到下列数据：表1123456789101112a0.00-0.010.010.000.210.160.220.240.270.280.210.25b0.190.190.230.240.340.350.190.190.240.240.290.26c0.160.270.220.080.280.140.280.250.140.140.200.22d0.110.120.340.300.060.050.100.110.110.120.090.10e0.070.110.390.340.400.250.300.210.240.200.460.51挑选od值与对照组相比上升0.1-1.0的实验组液体，作为atcc13311的噬菌体原液，经筛选得到6种atcc13311宿主特异性噬菌体原液。所述氯仿处理除去杂菌为：将噬菌体原液加入对数期atcc13311富集液中增菌，取增菌后液体12000g，21℃离心10min，得到噬菌体蛭弧菌混合液；取20ml噬菌体蛭弧菌混合液，加入1ml氯仿，漩涡振荡3min，油镜观测有无蛭弧菌残留，得到噬菌体液。取噬菌体液50μl，加入10μl对数期atcc13311富集液，混匀15min使其充分感染后，加入40℃质量分数为0.4％琼脂lb半固体培养基，混匀迅速倒入下层板上，所述下层板采用质量分数为1.2％琼脂的lb固体培养基；倒置培养12h，观测有无出现溶菌环，挑选形态大小一致的单个噬菌斑，使用接种针穿刺目标噬菌斑，将穿刺后带的噬菌体接种针伸入1ml的sm培养液充分混匀，并于4℃冰箱冷藏过夜；使用上述带噬菌体的sm培养液代替噬菌体液，重复上次步骤4次后可得到纯化噬菌体液。命名为vsb001噬菌体，混合培养12h后，其产生的噬菌斑如图1所示，噬菌斑直径约为5mm-7mm。实施例2制备对数生长期的宿主菌富集液：取20μlcmcc50094菌液接入20mllb培养基中混匀37℃恒温培养，每30min取200μl菌液于96孔板，595nm测定其od值，直至其od值不再上升，将所得数据使用excel作图，得到cmcc50094对数期的生长曲线，约为13h。高通量考马斯亮蓝法筛选噬菌体：前增菌后新鲜鸡粪样品，8000g，21℃离心8min，取上清液150μl加入96孔板，再加入对数期cmcc50094富集液300μl，然后放入lb培养基中，37℃混合培养12h；同时设置对照组，使用与待测样品等量的lb培养基，37℃混合培养12h；按每孔吸取250μl的量，从实验组和对照组分别吸取培养后液体，在8000g，21℃下离心8min收集上清液，取离心后液体100μl加入100μl考马斯亮蓝g-250溶液和300μl无菌水，混合均匀各取250μl加入96孔板中，在595nm下测量od值，减去对照组(a1-a4取平均值)后，得到下列数据。表2123456789101112a0.04-0.020.01-0.030.250.190.210.200.720.480.941.01b0.510.421.291.270.880.900.260.260.750.760.510.60c0.530.520.120.140.690.730.941.180.250.250.350.30d0.430.460.890.720.230.210.330.050.720.410.921.01e0.450.301.241.340.870.920.300.320.520.390.770.82挑选od值与对照组相比上升0.1-1.0的实验组液体，作为cmcc50094的噬菌体原液，经筛选得到10种cmcc50094宿主特异性噬菌体原液。所述氯仿处理除去杂菌为：将噬菌体原液加入对数期cmcc50094富集液中增菌，取增菌后液体12000g，21℃离心10min，得到噬菌体蛭弧菌混合液；取20ml噬菌体蛭弧菌混合液，加入0.5ml氯仿，漩涡振荡4min，油镜观测有无蛭弧菌残留，得到噬菌体液。取噬菌体液50μl，加入10μl对数期cmcc50094富集液，混匀15min使其充分感染后，加入45℃质量分数为0.4％琼脂lb半固体培养基，混匀迅速倒入下层板上，所述下层板采用质量分数为1.2％琼脂的lb固体培养基；倒置培养12h，观测有无出现溶菌环，挑选形态大小一致的单个噬菌斑，使用接种针穿刺目标噬菌斑，将穿刺后带的噬菌体接种针伸入1ml的sm培养液充分混匀，并于4℃冰箱冷藏过夜；使用上述带噬菌体的sm培养液代替噬菌体液，重复上次步骤5次后可得到纯化噬菌体液。命名为vsb002噬菌体，混合培养12h后，其产生的噬菌斑如图2所示，噬菌斑直径约为2.5-4mm。实施例3制备对数生长期的宿主菌富集液：取20mlmtc8325菌液接入20ml对应培养基中混匀37℃恒温培养，每30min取200μl菌液于96孔板，595nm测定其od值，直至其od值不再上升，将所得数据使用excel作图，得到对应宿主菌的对数期的生长曲线，约为12h，制备对数生长期的宿主菌富集液。高通量考马斯亮蓝法筛选噬菌体：前增菌后下水道污水样品，8000g，21℃离心10min，取上清液200μl加入96孔板，再加入对数期mtc8325富集液400μl，然后放入tsb培养基中，37℃混合培养12h；同时设置对照组，使用与待测样品等量的tsb培养基，37℃混合培养12h；按每孔吸取250μl的量，从实验组和对照组分别吸取培养后液体，在8000g，21℃下离心10min收集上清液，取离心后液体100μl加入100μl考马斯亮蓝g-250溶液和300μl无菌水，混合均匀各取250μl加入96孔板中，在595nm下测量od值；挑选od值与对照组相比上升0.1-1.0的实验组液体，作为mtc8325的噬菌体原液。所述氯仿处理除去杂菌为：将噬菌体原液加入对数期mtc8325富集液中增菌，取增菌后液体12000g，21℃离心10min，得到噬菌体蛭弧菌混合液；取20ml噬菌体蛭弧菌混合液，加入0.5ml氯仿，漩涡振荡5min，油镜观测有无蛭弧菌残留，得到噬菌体液。取噬菌体液50μl，加入10μl对数期mtc8325富集液，混匀15min使其充分感染后，加入50℃质量分数为0.4％琼脂lb半固体培养基，混匀迅速倒入下层板上，所述下层板采用质量分数为1.2％琼脂的lb固体培养基；倒置培养12h，观测有无出现溶菌环，挑选形态大小一致的单个噬菌斑，使用接种针穿刺目标噬菌斑，将穿刺后带的噬菌体接种针伸入1ml的sm培养液充分混匀，并于4℃冰箱冷藏过夜；使用上述带噬菌体的sm培养液代替噬菌体液，重复上次步骤5次后可得到纯化噬菌体液。命名为vsb003噬菌体，混合培养12h后，其产生的噬菌斑如图3所示，噬菌斑直径约为1-1.5mm。。综上所述：本发明实施例加入氯仿毒杀蛭弧菌群的方法，避免噬菌体液出现残留杂菌，且本发明实施例中对经过初步纯化后的噬菌体液经双层琼脂平板法与宿主菌培混合养分离纯化，进一步得到纯化效果好的噬菌体液。成功筛选到一株质控沙门氏菌atcc13311特异性噬菌体vsb001、质控沙门氏菌cmcc50094特异性噬菌体vsb002、金黄色葡萄球菌mtc8325特异性噬菌体vsb003，适用于从环境中取样选定宿主菌高通量筛选其功能性噬菌体，解决了现有技术使用革兰氏阴性菌作为宿主菌时蛭弧菌污染出现的“假阳性”结果问题，解决了现有技术分离噬菌体时蛭弧菌也可透过0.22μm分子滤膜造成样品污染的问题。为未来噬菌体行业在医学、食品工业的广阔前景提供了大量、快速、有效、靶向筛选所需噬菌体的方法，解决了该领域的技术瓶颈。对于本领域技术人员而言，显然本发明实施例不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明实施例的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明实施例。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明实施例的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明实施例内。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。当前第1页1 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技术特征：1.一种高通量分离噬菌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备对数生长期的宿主菌富集液、高通量考马斯亮蓝法筛选噬菌体、氯仿处理除去杂菌、双层琼脂平板法纯化。
2.一种如权利要求1所述的一种高通量分离噬菌体的方法，其特征在于，制备对数生长期的宿主菌富集液：取宿主菌接入对应培养基中混匀恒温培养，每30min取200μl菌液于96孔板，595nm测定其od值，直至其od值不再上升，确定其对数生长期，制备对数生长期的宿主菌富集液。
3.如权利要求2所述的一种高通量分离噬菌体的方法，其特征在于，高通量考马斯亮蓝法筛选噬菌体：待分离样品离心6-10min，取上清液100-200μl加入96孔板，再加入对数期宿主菌富集液200-400μl，然后放入lb培养基中，混合培养；同时设置对照组，使用与待测样品等量的lb培养基，混合培养；
按每孔吸取250μl的量，从实验组和对照组分别吸取培养后液体，在离心6-10min收集上清液，取离心后液体加入考马斯亮蓝溶液和无菌水，混合均匀加入96孔板中，在595nm下测量od值；挑选od值与对照组相比上升0.1-1.0的实验组液体，作为宿主菌的噬菌体原液。
4.如权利要求3所述的一种高通量分离噬菌体的方法，其特征在于，所述氯仿处理除去杂菌为：将噬菌体原液加入对数期宿主菌富集液中增菌，取增菌后液体离心，得到噬菌体蛭弧菌混合液；取噬菌体蛭弧菌混合液，加入氯仿，漩涡振荡3-5min，油镜观测有无蛭弧菌残留，得到噬菌体液。
5.如权利要求4所述的一种高通量分离噬菌体的方法，其特征在于，取噬菌体液，加入对数期宿主菌富集液，混匀使其充分感染后，加入40-50℃左右质量分数为0.4％琼脂lb半固体培养基，混匀迅速倒入下层板上；倒置培养，观测有无出现溶菌环，挑选形态大小一致的单个噬菌斑，使用接种针穿刺目标噬菌斑，将穿刺后带的噬菌体接种针伸入sm培养液充分混匀，并于冰箱冷藏过夜；使用上述带噬菌体的sm培养液代替噬菌体液，重复上次步骤4-5次后可得到纯化噬菌体液。
6.如权利要求2所述的一种高通量分离噬菌体的方法，其特征在于，所述宿主菌为任意一种细菌、真菌藻类、放线菌或螺旋体。
7.如权利要求4所述的一种高通量分离噬菌体的方法，其特征在于，所述噬菌体蛭弧菌混合液与氯仿之间的体积比为200：1-5。
8.如权利要求5所述的一种高通量分离噬菌体的方法，其特征在于，所述下层板采用质量分数为1.2％琼脂的lb固体培养基。
技术总结本发明适用微生物分离技术领域，提供一种高通量分离噬菌体的方法，制备对数生长期的宿主菌液、加入待筛选样品增菌离心上清液培养、使用高通量考马斯亮蓝法筛选噬菌体、并氯仿处理除去杂菌、双层琼脂平板法纯化；本发明实施例通过加入氯仿毒杀菌群的方法，避免噬菌体液出现残留杂菌，且本发明实施例中对经过初步纯化后的噬菌体液经双层琼脂平板法与宿主菌培混合养分离纯化，进一步得到纯化效果好的噬菌体液；解决了现有技术使用革兰氏阴性菌作为宿主菌时样品中的蛭弧菌污染造成的“假阳性”结果问题，解决了现有技术分离噬菌体时蛭弧菌也可透过0.22μm分子滤膜造成样品污染的问题。
技术研发人员：索标;石必博;汪月霞;谢唯俊;索同号;黄忠民
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：2021.05.17
技术公布日：2021.08.03
