本发明属于微生物
技术领域：
，具体涉及一种适用于弧菌噬菌体发酵的培养基配方的配制方法以及生产应用。
背景技术：
：近年来我国养殖行业发展迅猛，收益颇大，但是由于抗细菌药物的广泛使用，带来了诸如环境污染，细菌耐药性，食品安全等种种问题。并且抗生素有着成本高、研发周期长等缺点，所以迫切需要一种新的抗菌技术来解决这一难题，既可以控制疾病又不会对环境与人体产生危害，以部分或者完全替代抗生素。噬菌体(phage，bacteriophage)是一种寄生于各类细菌之内的病毒，亦成为细菌病毒，在自然界中有广泛的分布，被认为是地球上丰度以及多样性最高的生物。并且具有宿主专一性强的特定，只感染特定的宿主菌，不会侵染哺乳动物细胞，不会危害生态环境。而且繁殖迅速，在水产养殖中可以有效抑制致病菌的增殖，降低养殖动物体内的致病菌数量。弧菌是一类常见嗜盐性的革兰氏阴性菌，其主要的栖息地是海水中，广泛存在于海水和海产品中，分布极广，是我国沿海地区海水鱼及贝类常见的致病菌，通常引起胃肠感染，也可以引起肠道外感染，会导致海水鱼类患有出血症。近几年来，副溶血弧菌被认为是南美白对虾早期死亡综合症的主要病原体，和多数肝胰脏肿大，边缘不清晰、肝胰脏萎缩、肝颜色异常都有关系。副溶血弧菌被公认为是水产养殖领域中重要的细菌致死病原菌之一。噬菌体制剂发酵生产方面的研究目前还不深入。弧菌噬菌体制剂工业化的生产制备有着培养基昂贵，产品效价较低，生产周期长等种种问题。所以，开发一种低成本、高效价的弧菌噬菌体发酵的培养基配方是有效解决目前噬菌体工业化生产的关键。现有技术中，通常采用2216e液体培养基作为海水相关细菌或噬菌体的培养基，但是针对海水相关噬菌体并未公开具有针对性的、高效低价的培养基。同时，2216e液体培养基存在容易沉淀的问题。技术实现要素：本发明为解决上述问题，提供了一种低成本、配制方法简单、发酵效价高的弧菌噬菌体培养基。实现本发明目的的技术解决方案为：本发明一个方面提供了一种用于噬菌体发酵的培养基，其由以下成分组成：其中每1000ml水溶液中，具有蛋白胨5.0g、酵母浸粉1.0g、柠檬酸铁0.1g、氯化钠19.45g、氯化镁5.98g、硫酸钠3.24g、氯化钙0.2～0.4g、氯化钾0.55g、碳酸钠0.16g、溴化钾0.08g、硼酸0.022g、硅酸钠0.004g、氟化钠0.0024g、磷酸氢二钠0.008g、溶剂为水。优选地，所述的氯化钙的重量为0.3g。在本发明的技术方案中，所述的培养基中不包含氯化锶和硝酸钠。在本发明的技术方案中，溶剂为去离子水或蒸馏水。在本发明的技术方案中，所述的培养基为液体培养基。在本发明的技术方案中，所述的培养基为固体培养基，所述培养基中还加入琼脂。在本发明的技术方案中，所述的培养基ph为7.60。本发明另一个方面提供了所述用于噬菌体发酵的培养基的制备方法，其包括以下步骤：1)称取蛋白胨、酵母浸粉、柠檬酸铁、氯化钠、氯化镁、硫酸钠、氯化钙、氯化钾、碳酸钠、溴化钾、硼酸、硅酸钠、氟化钠、磷酸氢二钠；2)加入水中混合均匀，调节ph值至7.60；3)高温灭菌。在本发明的技术方案中，所述的高温灭菌为121℃灭菌20分钟。本发明再一个方面提供了本发明所述的噬菌体发酵的培养基在噬菌体培养中作为培养基的用途。本发明再一个方面提供了本发明所述的噬菌体发酵的培养基用于弧菌的细菌计数及噬菌体计数的用途。在本发明的技术方案中，所述的噬菌体为海水相关噬菌体，优选为弧菌噬菌体，更优选为副溶血弧菌噬菌体、溶藻弧菌噬菌体。本发明与现有技术相比，其显著优点为：本发明发现了影响判断发酵终点的重要因素，即现有技术中的培养基中容易产生沉淀，进而影响了发酵终点的判断。本发明意外地发现了氯化钙是影响沉淀的重要因素，并通过调节氯化钙的含量实现了避免沉淀的效果。虽然本发明的培养基相比于现有技术的培养基成分减少了，但是能够实现相同甚至更好的培养效果。本发明培养基成本低廉，颜色相对澄清，噬菌体发酵液效价高。附图说明图1为2216e培养基澄清度实验结果。图2为本发明实施例1培养基澄清度实验结果。具体实施方式下面通过具体实施案例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施案例，对本发明所做的任何形式上的变通或改变都将落入本发明保护范围。本发明实验涉及的副溶血弧菌为g107、dyw34-1、g36；溶藻弧菌为j62。本发明实验涉及的副溶血弧菌噬菌体为pg31、pg124、pg32；溶藻弧菌噬菌体为pj32。实施例一：1)将蛋白胨5.0g，酵母浸粉1.0g，柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙0.3g，氯化钾0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，硼酸0.022g，硅酸钠0.004g，氟化钠0.0024g，磷酸氢二钠0.008g，水1000ml，调节ph至7.60，121℃灭菌20分钟。2)将三株副溶血弧菌g107、dyw34-1、g36分别与对应的副溶血弧菌噬菌体pg31、pg124、pg32接种于100ml上述培养基以及100ml市面上买到的成品2216e液体培养基中，37℃，170rpm条件下发酵5h。3)分别将发酵液使用双层平板法测定效价，可见效价明显提升。通过实验结果可知，本发明的培养基培养获得噬菌体效价有明显提升。实施例二：配制本发明培养基350l于500l发酵罐内，蛋白胨1750.0g，酵母浸粉350.0g，柠檬酸铁35.0g，氯化钠6807.5g，氯化镁2093g，硫酸钠1134g，氯化钙105g，氯化钾192.5g，碳酸钠56g，溴化钾28g，硼酸7.7g，硅酸钠1.4g，氟化钠0.84g，磷酸氢二钠2.8g，水35l，调节ph至7.60，121℃灭菌20分钟。将副溶血弧菌dyw34-1与对应的副溶血弧菌噬菌体pg124按一定比例接种到发酵罐中进行扩大培养，37℃，170rpm条件下发酵5h。将发酵液使用双层平板法测定效价，可得到噬菌体pg124效价为2.60×1010pfu/ml。说明本发明培养基同样适用于副溶血弧菌噬菌体的扩大培养。实施例三：1)将蛋白胨5.0g，酵母浸粉1.0g，柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙0.3g，氯化钾0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，硼酸0.022g，硅酸钠0.004g，氟化钠0.0024g，磷酸氢二钠0.008g，水1000ml，调节ph至7.60，121℃灭菌20分钟。2)将溶藻弧菌j62与对应的溶藻弧菌噬菌体pj32按一定比例接种于100ml该培养基以及100ml市面上买到的成品2216e液体培养基中，37℃，170rpm条件下发酵5h。3)将发酵液使用双层平板法测定效价，可见效价明显提升。实施例四：配制本发明培养基350l于500l发酵罐内，蛋白胨1750.0g，酵母浸粉350.0g，柠檬酸铁35.0g，氯化钠6807.5g，氯化镁2093g，硫酸钠1134g，氯化钙105g，氯化钾192.5g，碳酸钠56g，溴化钾28g，硼酸7.7g，硅酸钠1.4g，氟化钠0.84g，磷酸氢二钠2.8g，水35l，调节ph至7.60，121℃灭菌20分钟。将溶藻弧菌j62与对应的溶藻弧菌噬菌体pj32按一定比例接种到发酵罐中进行扩大培养，37℃，170rpm条件下发酵5h。将发酵液使用双层平板法测定效价，可得到噬菌体pj32效价为1.66×1010pfu/ml。说明本发明培养基同样适用于溶藻弧菌噬菌体的扩大培养。实施例五：将本发明培养基配制后与2216e液体培养基的澄清度进行比对，右侧为该培养基，左侧为2216e液体培养基。2216e液体培养基沉淀量要远远大于该培养基。结果如图1。而本发明的液体培养基几乎没有沉淀。在噬菌体的发酵过程中，通常通过观察发酵液的澄清状态来判断是否发酵结束，如果发酵培养基本身背景太浑浊，首先直接影响肉眼观察的发酵终点判断，其次使用od值检测澄清发酵状态也会受到很大的影响，导致最终发酵终点没法判断。本发明的培养基克服了现有技术中提供的培养基容易出现沉淀，进而无法准确判断发酵终点的问题。实施例六设计实验确定对2216e中浑浊度影响最大的因素，选择单因素实验法，对配方中试剂进行单独去除，观察培养基的浑浊程度。具体实验结果如下：从以上实验结果可以看出，在2216e培养基中，影响其浑浊度的试剂是柠檬酸铁、氯化镁、氯化钙和氯化锶。下面对这4种试剂进行单因素添加量的摸索。对柠檬酸铁添加量的摸索对2216e培养基中的柠檬酸铁含量进行调整，用于副溶血弧菌噬菌体pg124、pg31和pg32及溶藻弧菌噬菌体pj32的发酵，具体结果如下：培养基配方pg124效价(pfu/ml)pg31效价(pfu/ml)pg32效价(pfu/ml)pj32效价(pfu/ml)2216e配方(0.1g/l)1.16±0.11×10101.20±0.03×10106.46±0.41×1098.14±0.22×1092216e配方(0.05g/l)9.37±0.19×1098.54±0.23×1095.11±0.14×1097.18±0.12×1092216e配方(0g/l)6.22±0.15×1098.02±0.31×1093.68±0.23×1095.46±0.13×109从上述实验结果可以看出降低柠檬酸铁的添加量，会降低副溶血弧菌噬菌体pg124、pg31和pg32及溶藻弧菌噬菌体pj32的发酵效价，所以不对柠檬酸铁的含量进行更改。对氯化镁添加量的摸索对2216e培养基中的氯化镁含量进行调整，用于副溶血弧菌噬菌体pg124、pg31和pg32及溶藻弧菌噬菌体pj32的发酵，具体结果如下：培养基配方pg124效价(pfu/ml)pg31效价(pfu/ml)pg32效价(pfu/ml)pj32效价(pfu/ml)2216e配方(5.98g/l)1.23±0.22×10101.19±0.12×10107.02±0.32×1098.32±0.25×1092216e配方(5.00g/l)9.14±0.12×1099.34±0.21×1096.37±0.21×1097.86±0.21×1092216e配方(3.00g/l)7.66±0.21×1098.24±0.21×1095.47±0.25×1097.82±0.15×1092216e配方(1.50g/l)7.35±0.25×1098.32±0.31×1095.40±0.15×1097.53±0.18×1092216e配方(0g/l)5.25±0.26×1098.01±0.21×1095.01±0.15×1096.33±0.18×109从上述实验结果可以看出降低氯化镁的添加量，会降低副溶血弧菌噬菌体pg124、pg31和pg32及溶藻弧菌噬菌体pj32的发酵效价，所以不对氯化镁的含量进行更改。对氯化钙添加量的摸索对2216e培养基中的氯化钙含量进行调整，用于副溶血弧菌噬菌体pg124、pg31和pg32及溶藻弧菌噬菌体pj32的发酵，具体结果如下：培养基配方pg124效价(pfu/ml)pg31效价(pfu/ml)pg32效价(pfu/ml)pj32效价(pfu/ml)2216e配方(1.8g/l)1.13±0.17×10101.21±0.13×10106.22±0.21×1098.70±0.41×1092216e配方(1.2g/l)1.82±0.21×10101.56±0.11×10108.20±0.53×1098.92±0.35×1092216e配方(0.6g/l)1.92±0.22×10101.78±0.09×10109.32±0.24×1099.33±0.23×1092216e配方(0.4g/l)2.35±0.08×10102.31±0.12×10101.11±0.18×10102.01±0.33×10102216e配方(0.2g/l)2.05±0.14×10102.11±0.18×10101.03±0.42×10101.78±0.26×10102216e配方(0.1g/l)1.74±0.11×10101.85±0.10×10109.34±0.62×1099.03±0.63×109从上述实验结果可以看出cacl2添加量在0.2g/l和0.4g/l时副溶血弧菌噬菌体pg124、pg31和pg32及溶藻弧菌噬菌体pj32的发酵效价较高。设计实验，对cacl2添加量在0.2g/l、0.3g/l、0.4g/l时副溶血弧菌噬菌体pg124、pg31和pg32及溶藻弧菌噬菌体pj32的发酵效价，结果如下。培养基配方pg124效价(pfu/ml)pg31效价(pfu/ml)pg32效价(pfu/ml)pj32效价(pfu/ml)2216e配方(0.4g/lcacl2)2.03±0.11×10102.21±0.14×10101.13±0.14×10102.20±0.14×10102216e配方(0.3g/lcacl2)2.61±0.21×10102.36±0.22×10101.53±0.11×10102.22±0.24×10102216e配方(0.2g/lcacl2)2.13±0.15×10102.30±0.15×10101.21±0.32×10101.98±0.17×1010从上述实验结果可以看出cacl2添加量在0.3g/l时副溶血弧菌噬菌体pg124、pg31和pg32及溶藻弧菌噬菌体pj32的发酵效价更高。对氯化锶添加量的摸索对2216e培养基中的氯化锶含量进行调整，用于副溶血弧菌噬菌体pg124、pg31和pg32及溶藻弧菌噬菌体pj32的发酵，具体结果如下：培养基配方pg124效价(pfu/ml)pg31效价(pfu/ml)pg32效价(pfu/ml)pj32效价(pfu/ml)2216e配方(0.034g/l)1.04±0.22×10101.20±0.12×10106.02±0.12×1098.65±0.26×1092216e配方(0.02g/l)1.12±0.13×10101.13±0.17×10106.46±0.23×1098.29±0.36×1092216e配方(0.01g/l)1.02±0.31×10101.23±0.16×10107.20±0.17×1098.19±0.41×1092216e配方(0g/l)1.02±0.24×10101.17±0.23×10108.23±0.18×1098.72±0.22×109从上述实验结果可以看出降低氯化锶的添加量，对副溶血弧菌噬菌体pg32的发酵效价有显著的提升作用，把氯化锶的含量降至0g/l后，pg32的发酵效价最高。且降低氯化锶的含量对副溶血弧菌噬菌体pg124和pg31及溶藻弧菌噬菌体pj32的发酵效价影响不大，因此改良后的培养基配方中不添加氯化锶。实施例七固体培养基的制备和使用本发明培养基加入琼脂，作为固体培养基用于弧菌噬菌体效价的检测将蛋白胨5.0g、酵母浸粉1.0g、柠檬酸铁0.1g、氯化钠19.45g、氯化镁5.98g、硫酸钠3.24g、氯化钙0.3g、氯化钾0.55g、碳酸钠0.16g、溴化钾0.08g、硼酸0.022g、硅酸钠0.004g、氟化钠0.0024g、磷酸氢二钠0.008g、水1000ml，调节ph至7.60，再加入琼脂粉18g，121℃灭菌20分钟。将所得的培养基降温至60，℃倒至平板内得到固体培养基，用于噬菌体检测的下层。以2216e固体培养基作为下层进行对照实验。使用双层平板法测定同一份弧菌噬菌体效价，结果如下：下层培养基配方pg124效价(pfu/ml)pg31效价(pfu/ml)pg32效价(pfu/ml)pj32效价(pfu/ml)本发明培养基1.16±0.18×10101.08±0.13×10108.46±0.16×1091.15±0.09×10102216e培养基1.13±0.15×10101.12±0.10×10108.55±0.17×1091.09±0.12×1010由以上结果可以看出，使用本发明培养基与使用2216e固体培养基进行弧菌噬菌体的效价检测，检测出的噬菌体效价相差不大。说明本培养基也可添加琼脂作为固体培养基进行弧菌噬菌体的效价测定。实施例八固体培养基的制备和使用本发明培养基加入琼脂，作为固体培养基用于弧菌细菌数的检测将蛋白胨5.0g、酵母浸粉1.0g、柠檬酸铁0.1g、氯化钠19.45g、氯化镁5.98g、硫酸钠3.24g、氯化钙0.3g、氯化钾0.55g、碳酸钠0.16g、溴化钾0.08g、硼酸0.022g、硅酸钠0.004g、氟化钠0.0024g、磷酸氢二钠0.008g、水1000ml，调节ph至7.60，再加入琼脂粉18g，121℃灭菌20分钟。将所得的培养基降温至60，℃倒至平板内得到固体培养基，用于弧菌细菌的计数，以2216e固体培养基作为下层进行对照实验。对副溶血弧菌g107与溶藻弧菌j62菌液进行涂布计数，具体结果如下：下层培养基配方g107细菌数(cfu/ml)j62细菌数(cfu/ml)本发明培养基1.35±0.15×1091.53±0.12×1092216e培养基1.29±0.19×1091.49±0.11×109由以上结果可以看出，使用本发明培养基与使用2216e固体培养基进行弧菌的细菌数计数，所得细菌数差距不大。说明本培养基可添加琼脂作为固体培养基进行弧菌的细菌计数。以上所述实施仅表达了本专利的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页1 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技术特征：1.一种用于噬菌体发酵的培养基，其由以下成分组成：其中每1000ml水溶液中，具有蛋白胨5.0g、酵母浸粉1.0g、柠檬酸铁0.1g、氯化钠19.45g、氯化镁5.98g、硫酸钠3.24g、氯化钙0.2～0.4g、氯化钾0.55g、碳酸钠0.16g、溴化钾0.08g、硼酸0.022g、硅酸钠0.004g、氟化钠0.0024g、磷酸氢二钠0.008g、溶剂为水。
2.根据权利要求1所述的培养基，所述的氯化钙的重量为0.3g。
3.根据权利要求1所述的培养基，用于噬菌体发酵所述的培养基为液体培养基。
4.根据权利要求1所述的培养基，所述培养基为固体培养基，所述培养基中还包括琼脂。
5.根据权利要求1所述的培养基，所述的培养基ph为7.60。
6.根据权利要求1-5任一项所述的培养基噬菌体发酵的培养基的制备方法，其包括以下步骤：
1)称取蛋白胨、酵母浸粉、柠檬酸铁、氯化钠、氯化镁、硫酸钠、氯化钙、氯化钾、碳酸钠、溴化钾、硼酸、硅酸钠、氟化钠、磷酸氢二钠；
2)加入水中混合均匀，调节ph值至7.60；
3)高温灭菌。
7.根据权利要求6所述的制备方法，所述的高温灭菌为121℃灭菌20分钟。
8.根据权利要求1-5任一项所述的噬菌体发酵的培养基在噬菌体培养中作为培养基的用途或用于弧菌的细菌计数及噬菌体计数的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，所述的噬菌体为海水相关噬菌体，优选为弧菌噬菌体。
10.根据权利要求8所述的用途，所述的噬菌体为副溶血弧菌噬菌体、溶藻弧菌噬菌体。
技术总结本发明提供了一种适用于海水用噬菌体发酵的培养基及其制备方法和用途。具体公开了用于噬菌体发酵的培养基，其由以下成分组成：其中每1000mL水溶液中，具有蛋白胨5.0g、酵母浸粉1.0g、柠檬酸铁0.1g、氯化钠19.45g、氯化镁5.98g、硫酸钠3.24g、氯化钙0.2～0.4g、氯化钾0.55g、碳酸钠0.16g、溴化钾0.08g、硼酸0.022g、硅酸钠0.004g、氟化钠0.0024g、磷酸氢二钠0.008g、溶剂为水使用该培养基发酵弧菌噬菌体，可以有效提高培养基的澄清度，并且提高噬菌体发酵液的效价，具有成本低廉，配制方法简便，且适用于工业生产的优点，具有良好的经济效益。
技术研发人员：潘强;任慧英;孙虎芝;庄盈婷;白松;庄莹
受保护的技术使用者：青岛诺安百特生物技术有限公司
技术研发日：2020.11.02
技术公布日：2021.08.03
