本发明属于生物领域，涉及一株大肠杆菌噬菌体，可以防治仔猪腹泻以及养殖场环境及养殖设备的杀菌消毒，作为肉制品的防腐剂的应用。
背景技术：
仔猪腹泻是猪养殖场常见的疾病，致病性大肠杆菌感染引起得仔猪黄痢、仔猪白痢、仔猪水肿病，发病率和死亡率高。此类病较易发生在出生至断奶期间仔猪，仔猪被感染后症状常表现为呕吐、腹泻、脱水以及迅速消瘦，给仔猪生长带来很大的影响，同时也给养殖场造成巨大的经济损失。同时肉制品储存和运输时极易受到微生物及大肠杆菌的污染，致病性大肠杆菌污染甚至可导致一些疾病的爆发，会危害消费者的健康与生命。
大肠杆菌广泛存在于自然界中，无症状的带菌动物都可能成为传染源，甚至会污染食品，一些食品检测报告指出肉制品中产肠毒素大肠杆菌的检出率为40.4％。
致病性大肠杆菌属于肠杆科，为革兰氏阴性菌，产生的毒力因子有粘附素、肠毒素、水肿毒素、内毒素等，其中肠毒素和粘附素无论从发病学和免疫学角度讲都起着重要作用。仔猪被致病性大肠杆菌感染后，会发生急剧腹泻和脱水，最终死亡，死亡率和发病率很高。
目前治疗致病性大肠杆菌感染的药物最常用的是抗生素和疫苗。胆盐、煌绿等对其有抑制作用；对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感，但是随着抗生素类药物的大量使用，已经出现了耐药性，抗生素对致病性大肠杆菌的作用效果越来越差。国内外已经有很多预防致病性大肠杆菌的疫苗，价格昂贵，且大肠杆菌的血清型太多，一种疫苗不能同时针对多种大肠杆菌血清型，所以寻求开发一种有效治疗和预防仔猪腹泻的药物或者产品已经迫在眉睫。
噬菌体是一种细菌病毒，可以从污水、土壤、粪便等环境分离，可以说有细菌的地方就有噬菌体的存在，极易从环境中获得。
噬菌体具有天然的裂解细菌的性能，一旦细菌表面含有噬菌体识别的受体就会迅速吸附，裂解细菌后，噬菌体会停止繁殖逐渐排出体外，不会产生耐药性，所以是抗生素的一个良好代替品。
目前国内外已经有很多公司正在研究噬菌体并将其应用在生活生产之中，我国在1958年利用噬菌体来治疗炼钢工人邱财康因被钢水烧伤而产生的细菌感染，挽救了他的生命；美国在2006年就允许将噬菌体作为食品添加剂，用于杀灭肉制品中的李氏杆菌；韩国一家饲料公司在2010年将沙门氏菌噬菌体加入到饲料中，用于杀灭饲料中的鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。由此看来，噬菌体作为安全无毒有效的天然杀菌剂有着很大的应用价值以及广阔的市场前景。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供一种大肠杆菌噬菌体，可以防治因致病性大肠杆菌引起的仔猪腹泻，可以实现对养殖场环境及养殖器械的消毒，以及肉制品的防腐剂。本发明是这样实现的：
本发明一个方面提供了一种大肠杆菌噬菌体vb-ecop-zpd342，保藏编号为cgmccno.18863。
在本发明的技术方案中，大肠杆菌噬菌体为头部长60-70nm，宽50-60nm，尾长30-40nm短尾噬菌体，噬菌体在固体培养基上可以形成透亮噬菌斑，形态大小一致，边缘清晰规则，直径为1.5mm。
在本发明的技术方案中，大肠杆菌噬菌体vb-ecop-zpd342的基因组含有与噬菌体宿主识别相关的三个尾部纤维(tailfibersprotein)蛋白基因序列，分别如seqidno.1～3所示；dna连接酶(dnaligase)基因的序列如seqidno.4所示；dna聚合酶(dnapolymerase)基因的序列如seqidno.5所示；裂解酶(phageexonuclease)基因序列，如序列seqidno.6所示。
本发明另一个方面提供了一种药物或饲料添加剂，其包含本发明的大肠杆菌噬菌体。
本发明另一个方面提供了所述噬菌体制备治疗或预防大肠杆菌所致疾病的药物中的用途。
在本发明的技术方案中，大肠杆菌所致疾病选自大肠杆菌所致仔猪腹泻。
本发明另一个方面提供了所述噬菌体作为设备或环境的杀菌消毒制剂中的应用。
本发明另一个方面提供了所述噬菌体制剂在作为肉制品防腐剂的作用。
在本发明的技术方案中，噬菌体对大肠杆菌的应用浓度为1×104pfu/ml-1×1010pfu/ml，优选为1×108pfu/ml。
在本发明中，大肠杆菌噬菌体vb-ecop-zpd342，保藏编号为cgmccno.18863，保藏时间为2019年11月4日，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心。
有益效果
本发明提供了一种大肠杆菌噬菌体，可以防治因致病性大肠杆菌引起的仔猪腹泻，可以实现对养殖场环境及养殖器械的消毒，以及肉制品的防腐剂。本发明的噬菌体裂解率高，ph和温度耐受性好，杀灭对抗生素多重耐药的致病性大肠杆菌，应用于制备防治致病性大肠杆菌感染的药物中可以实现广谱杀菌的效果。且无毒副作用，安全性高。所述噬菌体具有较好的亲水相，容易配制成喷洒液或者注射液，对环境中的大肠杆菌可进行有效杀灭。
附图说明
图1.噬菌体vb-ecop-zpd342噬菌斑照片。
图2.噬菌体vb-ecop-zpd342电镜照片。
图3.噬菌体vb-ecop-zpd342的热稳定性图。
图4.噬菌体vb-ecop-zpd342的ph稳定性图。
图5.噬菌体vb-ecop-zpd342的杀菌效果时效图。
具体实施方式
为方便了解本发明的技术方案，以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
实施例1噬菌体的分离及其生物学特征
菌种的复苏及菌液的制备
挑取大肠杆菌冻存液在ss培养基上分区划线，放入37℃温箱中培养16-24h，过夜后，用无菌白枪头挑取单菌落，接种5ml的营养肉汤中，放入摇床37℃，170rpm振荡12h，即得到菌液。
噬菌体的分离与纯化
将从猪场带回来的粪样、污水等放入盛有营养肉汤的三角瓶中，每个三角瓶中按比例加入1％的大肠杆菌，搅拌均匀后，放入摇床37℃，170rpm振荡过夜。将过夜的混合样品液体，11000rpm，离心5min，用0.22μm滤器进行过滤，形成噬菌体原液；将噬菌体原液与宿主菌混合，37℃孵育5min后倒双层平板，待凝固后放入37℃的恒温箱中倒置培养，6～8h后观察结果，若有噬菌体存在，则会在培养基上形成透明、规则的圆形空斑，即为噬菌斑。用无菌镊子抠取单个噬菌斑，放在1ml的营养肉汤中，放在摇床170rpm，培养30min，30min后将其11000rpm离心5min，取上清液用双层平板法得到单个噬菌斑，如此重复3～5次直至得到大小、形态一致的噬菌斑。
噬菌体的增殖和效价测定
各取100μl宿主菌和噬菌体抠斑浸出液加入到5ml营养肉汤中，再取100μl宿主菌加入另一个5ml营养肉汤中，作为对照，同时放入37℃，170rpm摇床中培养3-4h，待混合液变清亮，得到噬菌体增殖液。10倍比稀释噬菌体增殖液，双层平板法测效价，每个稀释度分别做3个平行样。计数时，取稀释度为10-7的3个平行数计数，结果分别为：58、60、64个噬菌斑，计算效价为6×109pfu/ml。纯化的噬菌体如图1所示，噬菌体在2％的营养琼脂培养基中形成透亮空斑，大小、形态均一，边缘清晰规则，直径为1.5mm。
噬菌体电镜观察
取高于1×108pfu/ml噬菌体样品20μl滴于微孔铜网上，沉淀15min，用滤纸吸去多余的液体。在铜网上滴加15μl的2％的磷钨酸(pta)，染色5min，用滤纸吸去多余的染液，干燥后用透射电镜观察并拍照。形态结果如图2。结果可见该噬菌体为头部长60-70nm，宽50-60nm，尾长30-40nm短尾噬菌体，命名为vb-ecop-zpd342。大肠杆菌噬菌体vb-ecop-zpd342，保藏编号为cgmccno.18863，保藏时间为2019年11月4日，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心。
噬菌体的热稳定性试验
将5.3×109pfu/ml的噬菌体vb-ecop-zpd342增殖液分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，水浴中作用20min、40min、60min，每个温度设两个平行组，双层平板法测定噬菌体的效价。
结果可见噬菌体在40℃-70℃作用1h后，噬菌体效价仍然很高，70℃作用1h后，噬菌体效价稍有下降，但仍然在109pfu/ml以上；80℃作用20min后噬菌体效价下降4个滴度，1h噬菌体完全失活。具体结果见图3，由此可见vb-ecop-zpd342的热稳定性较高。
噬菌体的ph稳定性检测
取无菌试管中加入不同ph值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的nb肉汤4.5ml，各三支，置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，各加入500μl5.3×109pfu/ml的噬菌体增殖液，混匀37℃水浴作用1h、2h、3h。作用结束之后，向混合液中加入适量的hcl或者naoh使混合液的ph值约为7，双层平板法测定噬菌体的效价。
具体结果见图4，可见在ph5～11范围内噬菌体vb-ecop-zpd342效价稳定，基本不变。说明该噬菌体对ph的适应范围较广。
噬菌体的最佳感染复数(moi)测定
按照常规方法增殖噬菌体vb-ecop-zpd342以及该噬菌体的宿主菌，测定噬菌体及宿主菌效价，并将噬菌体vb-ecop-zpd342和宿主菌进行适当的稀释。按照感染复数为10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001的比例各取100μlvb-ecop-zpd342和宿主菌加入到nb肉汤中，于37℃，170rpm摇床中培养至液体变澄清，记录液体澄清时间。噬菌体澄清后，11000rpm离心5min，取离心液进行适当的稀释，用双层平板法测定噬菌体的的效价，结果见表1。
表1噬菌体的最佳感染复数(moi)测定结果
结果可见噬菌体的最佳感染复数是0.00001，该条件下噬菌体感染宿主菌产生子代噬菌体的滴度为4.13×1010pfu/ml，在7个感染复数中噬菌体滴度最高。
实施例2噬菌体vb-ecop-zpd342的全基因组测序
使用illuminamiseq(sandiego,ca,usa)测序仪对噬菌体进行全基因组测序。使用miseqreagentkitv2试剂盒构建600bp测序文库，主要流程如下：对基因组dna进行超声打断，末端补平，并加上特异接头后，扩增纯化筛选dna，即得到构建的测序文库。使用软件newbler2.9对噬菌体原始测序数据进行组装和拼接。最后得到噬菌体基因组大小为39014bp，为双链dna，g c的含量为48.76％，含有51个预测的开放阅读框。
使用在线工具blastp和保守域数据库(cdd)分别对噬菌体vb-ecop-zpd342的51个orfs蛋白序列进行比对，其中，噬菌体vb-ecop-zpd342含已知编码功能蛋白45个，其余orfs为假想蛋白。此外，根据基因组测序结果进一步可得：该噬菌体基因组含有与噬菌体宿主识别相关的三个尾部纤维(tailfibersprotein)蛋白基因序列分别见序列表seqidno.1～3，位置分别为28195-28785bp、28806-31196bp和38592-39014bp；dna连接酶(dnaligase)基因的序列见序列表中seqidno.4，位置为11967-12992bp；dna聚合酶(dnapolymerase)基因的序列见序列表中seqidno.5，位置为19068-21182bp；与裂解能力相关的裂解酶(phageexonuclease)基因序列见序列表中seqidno.6，位置为15794-16249bp。
上述基因的具体信息见下表2。
表2噬菌体pg07的基因序列信息表
seqidno.1tailtubularproteinhzp2
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＞seqidno.2tailtubularproteinc5
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＞seqidno.3tailfibersprotein
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＞seqidno.4dnaligase
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＞seqidno.5dnapolymerase
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＞seqidno.6phageexonuclease
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实施例3噬菌体裂解谱的测定和体外裂解试验
噬菌体裂解谱的测定
采用双层平板法测定噬菌体的裂解谱，步骤如下：按照实施例1中的方法制备宿主菌的菌悬液，100株致病性大肠杆菌分别来源于腹泻仔猪、牛、羊和兔样品以及大肠杆菌标准株k88、k99、987p、k88ac。用双层平板法检测是否裂解，待上层琼脂凝固后，置于37℃的恒温箱中倒置培养6～8h后观察结果，见表3。
表3大肠杆菌噬菌体裂解谱
噬菌体vb-ecop-zpd342的裂解谱宽，针对100株致病性大肠杆菌流行株，噬菌体vb-ecop-zpd342能够裂解其中92株，裂解率为92％，该噬菌体能够裂解k88、k99、987p、f41、lt1、st1、st2、f18ac、stx2e的大肠杆菌，并且不仅能裂解猪源致病性大肠杆菌，对牛源、羊源和兔源的大肠杆菌也可以裂解。
vb-ecop-zpd342对大肠杆菌进行体外裂解试验(od值法)
按照一定的比例加入大肠杆菌和噬菌体vb-ecop-zpd342，大肠杆菌的终浓度为1×108cfu/ml，噬菌体的终浓度分别为1×109pfu/ml，1×108pfu/ml，1×107pfu/ml，对照组加入与噬菌体相同量的无菌肉汤，菌液和噬菌体混合后在37℃温箱中培养。每隔一定的时间测定od值直至混合液变清亮，涂布平板法测定作用一定时间后各组菌的残留量，见表4和表5。
表4各时间段od值变化
表5od值测定结束后菌残留量的测定
根据表4、表5可知，vb-ecop-zpd342对大肠杆菌的裂解效果很好，3个不同浓度的噬菌体对大肠杆菌的裂解率能达到99.9％以上，只是时间长短不同，但是4.5h以内都能够达到较好的杀灭效果。
实施例4噬菌体vb-ecop-zpd342的安全性试验
选择12只体重为18～20g的健康20只，雌雄各半，分成试验组和对照组，每组小鼠雌雄各半，试验组灌服200μl2×109pfu/ml噬菌体vb-ecop-zpd342，对照组灌服200μl无菌生理盐水，连续灌服7d，观察小鼠的行为表现，并剖检观察小鼠脏器的变化。
结果可见，实验组和对照组小鼠行为无异常，剖检肝脏、肺脏、心脏、脾脏、肾脏等脏器正常，与对照组无明显差别，说明该噬菌体无毒，安全性高。
实施例5噬菌体vb-ecop-zpd342对大肠杆菌的消毒效果
以青岛某猪场作为试验地点，将浓度为1×108cfu/ml的致病性大肠杆菌取1ml均匀喷洒在10cm×10cm猪料槽表面，相同面积的20个区域，10个区域喷洒致病性大肠杆菌后用1×108pfu/ml的噬菌体对其表面喷洒，喷洒量为1ml，对照组10个区域分别喷洒1ml生理盐水，喷洒噬菌体或生理盐水后1h、2h、3h、4h、5h分别用5ml生理盐水冲洗器具表面，每个时间点2个平行，使用平板涂布法计数检测大肠杆菌的数量。
检测结果显示，1h后喷洒噬菌体的料槽表面大肠杆菌的数量下降到104cfu/m2，2h后器具表面大肠杆菌的数量下降到10cfu以下，3h后器具表面检测不到大肠杆菌，对照喷洒生理盐水的料槽的大肠杆菌数量保持在较高水平，说明该噬菌体可以有效杀灭养殖环境(养殖场器具)中的大肠杆菌。
实施例6噬菌体vb-ecop-zpd342对患病仔猪的治疗
在养殖场收集10头相同程度的患病仔猪，分为噬菌体组和抗生素组，每组5只，每一组单独饲养，防止污染。患病仔猪噬菌体治疗组进行腹腔注射2×109pfu/ml的噬菌体vb-ecop-zpd3421ml，连续注射3d；抗生素组进行抗生素恩诺沙星常规治疗，7d内观察仔猪状态。结果见表6。
表6仔猪攻毒治疗情况
根据表6可知，噬菌体对发病仔猪的保护率为80％，抗生素组对发病仔猪的保护率为40％，说明腹腔注射噬菌体对大肠杆菌引起仔猪腹泻具有良好的治疗作用。
实施例7噬菌体vb-ecop-zpd342对肉制品的防腐作用
从市场买来1块新鲜肉制品，切成符合要求的组织块，每个组织块长宽高分别为4cm×3cm×1.5cm，重量为25g，16个组织块，均喷洒在猪肉表面均匀喷洒2.5ml的1×106cfu/ml的大肠杆菌，试验组8块肉制品喷洒1×107pfu/ml的噬菌体，喷洒量为1ml，对照组喷洒相同体积的生理盐水，25℃放置，检测1h、2h、3h后的载菌量，每次将25g猪肉组织块研磨生理盐水重悬，检测猪肉中大肠杆菌的数量，结果显示，1h后试验组中的大肠杆菌含量为到1.25×102cfu/g，对照组中的大肠杆菌含量为1.2×105cfu/g；2h后试验组中的大肠杆菌含量为9cfu/g，对照组中的大肠杆菌含量为3.6×105cfu/g；3h后试验组中的大肠杆菌含量为0cfu/g，对照组中的大肠杆菌含量为9.8×105cfu/g；说明该噬菌体对猪肉中的大肠杆菌可以起到抑制作用，可以对猪肉达到防腐效果。
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<110>青岛诺安百特生物技术有限公司
<120>一种仔猪腹泻大肠杆菌噬菌体及其应用
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1.一种大肠杆菌噬菌体vb-ecop-zpd342，保藏编号为cgmccno.18863。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体vb-ecop-zpd342，其基因组含有与噬菌体宿主识别相关的三个尾部纤维蛋白基因序列，分别如seqidno.1～3所示；dna连接酶基因的序列如seqidno.4所示；dna聚合酶基因的序列如seqidno.5所示；裂解酶基因序列，如序列seqidno.6所示。
3.一种药物或饲料添加剂，其包含权利要求1或2所述的大肠杆菌噬菌体。
4.权利要求1或2所述大肠杆菌噬菌体制备治疗或预防大肠杆菌所致疾病的药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，所述大肠杆菌所致疾病选自大肠杆菌所致仔猪腹泻。
6.权利要求1或2所述大肠杆菌噬菌体在作为肉制品防腐剂的用途。
7.权利要求1或2所述大肠杆噬菌体在作为环境消毒剂中的用途。
8.一种预防和或治疗大肠杆菌引起的疾病的药物或饲料添加剂，其有效成分包括权利要求1或2所述的大肠杆菌噬菌体，优选地，所述的大肠杆菌噬菌体作为唯一活性成分；优选地，所述的药物为口服药物、喷雾制剂药物。
9.一种杀灭大肠杆菌的消毒剂，其有效成分包括权利要求1或2所述的大肠杆菌噬菌体，优选地，权利要求1或2所述的大肠杆菌噬菌体作为唯一活性成分。
10.一种肉制品防腐剂，其有效成分包括权利要求1或2所述的大肠杆菌噬菌体，优选地，权利要求1或2所述的大肠杆菌噬菌体作为唯一活性成分。
技术总结