本发明属于基因工程和分子酶工程技术领域，具体涉及一种耐热右旋糖酐蔗糖酶突变体及其制备方法，以及该突变体在一步法催化蔗糖生成微分子量右旋糖酐及其右旋糖酐衍生品中的应用。
背景技术：
右旋糖酐(dextran)，又称右旋糖苷、右聚糖、葡聚糖、多聚葡萄糖，是由右旋糖酐蔗糖酶(dextransucrase，dsr，ec2.4.5.1)的催化作用，将蔗糖分子中的d-葡萄糖基转移到受体分子上，形成一种由若干葡萄糖基连接而成的高分子多糖聚合物，同时伴有果糖的生成。右旋糖酐主链以α-d-1，6糖苷键连接，侧链分支点是由α-d-1，3和α-d-1，2连接，是最早发现的微生物多糖，也是较早作为代血浆应用的微生物多糖。右旋糖酐由于质地疏松柔软，具有安全、无毒、无臭、无味、黏性高、生物相容性好、水溶性好及持水性强等多种优点，广泛应用于制药、食品、化工、农牧业和色谱分析等多个领域。其中，低分子量(分子量为10000-20000da)、微分子量的右旋糖酐(分子量为10000da以下)具有更大的经济价值和更广阔的市场前景，低分子量的右旋糖酐与铁形成复合物，治疗严重贫血；微分子量的硫酸葡聚糖则具有抗病毒特性。微分子量的右旋糖酐也可以改善微循环，预防或消除血管内红细胞聚集和血栓形成，有扩充血容量及渗透利尿作用，可用于治疗急性失血性休克、心肌梗塞、脑血栓、周围血管病及防止弥散性血管内凝血等功效，在临床医学上有广泛的应用。低、微分子量右旋糖酐还可以进一步形成一系列用途极为广泛的衍生物。右旋糖酐衍生物通常是以低、微分子量的右旋糖酐为主要载体，与其它金属化合物进行络合反应，生成右旋糖酐金属络合物，是人体和禽畜类重要的微量元素补充剂，或具有多种药理活性，有广泛的应用前景，主要有右旋糖酐铁、右旋糖酐锌、右旋糖酐铜和右旋糖酐钙等。不同类型的右旋糖酐金属络合物的制备过程大同小异，通常先将低、微分子量的右旋糖酐在弱碱性条件下进行活化，再分别与不同的金属化合物进行络合反应，经过产物分离、纯化和精制，即得到不同用途的成品。因此，高效制备低分子、微分子右旋糖酐已备受相关研究者的关注。
右旋糖酐蔗糖酶是制备右旋糖酐的关键酶，由于酶的来源不同，酶本身的功能特性、催化程度的差异性，其可以转化蔗糖合成分子量大小不同的右旋糖酐或低聚糖，相对分子质量从5×103～3×108da不等。目前，国内制备低、微分子右旋糖酐通常是发酵法和双酶法为主要手段，从1957年开始，中国医学科学院输血及血液学研究所对国产右旋糖酐进行了较为系统的研究，选出了产右旋糖酐的新菌种-1226号肠膜状明串珠菌(leuconostocmesenteroides，lm-1226)，上世纪60年代已向全国推广。这些方法都是先以右旋糖酐蔗糖酶转化蔗糖获得较大分子量的右旋糖酐，再使用酸水解法(使用hcl分解)或者酶水解(使用右旋糖酐酶)的方法分解大分子右旋糖酐，最终获得低、微分子量右旋糖酐产物。由于酸水解法引入了氯离子，酶水解法引入了新的蛋白杂质，酸解或酶水解大分子右旋糖酐使得产物的分子量都难以控制，分子量大小相差很大，其生产过程温度低(25-30℃)，发酵液粘稠度大，物料传递慢，转化效率低，工艺控制复杂，产品的分离纯化较为困难(张九花等，甘蔗糖业，2018(2)，52-58.)。因此，通过右旋糖酐蔗糖酶一步法直接催化蔗糖制备低、微分子量的右旋糖酐已成为研究热点。2017年，法国人marionclaverie等(m.claverieetal.2017.)研发一种右旋糖酐蔗糖酶突变体dsr-m2δ，该突变体是通过截取了leuconostoccitreumnrrlb-1299菌的右旋糖酐蔗糖酶164-1433区间氨基酸组成的肽段，突变体酶可转化蔗糖直接生成低分子量的右旋糖酐，该突变体酶的反应温度为30℃，酶的热稳定性尚待改善，但其研究成果证明了通过分子酶工程技术对右旋糖酐蔗糖酶进行改良，是制备低、微分子量的右旋糖酐有效手段。南京工业大学的专利(申请号：202010730704.x)公开了一种右旋糖酐蔗糖酶突变体及其制备方法与应用，其突变体可催化蔗糖生成微分子量右旋糖酐，其技术成果和存在的缺陷与法国人marionclaverie的大致相同。为了改良酶的热稳定性，合肥工业大学的专利(申请号201710615998.x)公开了一种表达耐热型右旋糖酐蔗糖酶的基因工程菌及其构建方法和用途，其双突变体酶的活性和热稳定性有所提高，在25℃有最佳酶活性，但其突变体酶在40℃后酶活性急剧下降。王超等人(c.wangetal.2017.)对肠膜状明串珠菌(leuconostocmesenteroides0326)的右旋糖酐蔗糖酶进行分子剪接，截取肽链不同区间的肽段进行表达或截短表达，其突变酶催化蔗糖生成低分子量或微分子量的右旋糖酐产物或寡聚糖产物，但其突变体最适温度在25～30℃之间，当温度达40℃时其活力几乎完全丧失。由此可见，借助现代基因工程和分子酶工程技术，对右旋糖酐蔗糖酶分子进行深入的改良和优化设计，获得新酶学特性、热稳定性强的右旋糖酐蔗糖酶是有可能的。
本发明旨在开发热稳定性强，可产业化应用的右旋糖酐蔗糖酶，其可以直接催化蔗糖制备低分子量、微分子量右旋糖酐，从而实现规模化单酶法直接制备低、微分子量右旋糖酐及其衍生物，将具有重大的学术价值和现实应用意义。
技术实现要素：
本发明克服了现有制备低分子量、微分子量右旋糖酐技术方面的不足，公开了一种耐热右旋糖酐蔗糖酶突变体及其制备方法与应用，是本发明人通过对多个不同来源的右旋糖酐蔗糖酶的氨基酸序列进行比对分析，并通过同源建模、结构优化、分子设计及分子剪切等手段，优化设计了一个新型右旋糖酐蔗糖酶，即右旋糖酐蔗糖酶突变体dsrvδ，这个突变体酶的耐热稳定性强，其在58-68℃条件下表现良好的热稳定性，可以催化蔗糖直接制备低分子量、微分子量右旋糖酐，可进一步制备各种右旋糖酐衍生物。
本发明所述的右旋糖酐蔗糖酶突变体dsrvδ，其制备方法是以柠檬明串珠菌(leuconostoccitreum)右旋糖酐蔗糖酶蛋白dsrv(pid:ahc21928.1)为基础和出发点，具体是通过序列比对、同源建模和分子设计及分子剪切，主要截取保留上述dsrv蛋白37-1430区间氨基酸组成的肽段，并经过结构优化最终得到右旋糖酐蔗糖酶突变体dsrvδ，其氨基酸序列如seqidno.1所示。为了高效表达和制备这个右旋糖酐蔗糖酶突变体，按照突变体dsrvδ氨基酸序列，考虑其蛋白表达和纯化的需要，参照大肠杆菌密码子偏好性的原则，对其编码基因的核苷酸序列进行密码子优化，得到其对应的突变体基因dsrvδ的核苷酸序列，其核苷酸序列如seqidno.2所示。依照突变体基因dsrvδ的核苷酸序列，通过全基因合成的方法，得到突变体基因dsrvδ的dna片段，该dna片段再与表达载体pet-22b( )进行连接后转化大肠杆菌宿主e.colibl21(de3)，再进行突变体酶的高效表达和酶学性质研究，及其催化蔗糖生成右旋糖酐的相关实验。
通过本发明的办法优化设计得到一个新型右旋糖酐蔗糖酶突变体dsrvδ，该右旋糖酐蔗糖酶突变体最适催化的ph为5.7，最适温度为63℃，其在58-68℃表现良好的热稳定性，该突变体可一步法催化蔗糖真接生成低分子量、微分子量的右旋糖酐，无需酸水解和酒精分级沉淀过程。该突变体在较高温度条件下催化蔗糖直接生成低分子量、微分子量的右旋糖酐，具有底物及产物溶解度大，转化液粘稠度低，无杂菌生长，产物分离简便，操作简单的特点，是一种工艺简单，适合工业化制备低、微分子量的右旋糖酐及其衍生物的简便、经济和高效的方法。
本发明是综合运用现代生物信息学和分子生物学的理论和手段，对柠檬明串珠菌(leuconostoccitreum)右旋糖酐蔗糖酶蛋白dsrv进行序列比对、同源建模、结构比对分析和分子设计，并以此为依据，剪除酶分子上冗余的结构，主要截取保留上述dsrv蛋白37-1430区间氨基酸组成的肽段，并经过结构优化最终得到酶分子量较小的，热稳定性强的右旋糖酐蔗糖酶突变体dsrvδ，该突变体可直接催化蔗糖直接生成低、微分子量的右旋糖酐及其衍生物。新型右旋糖酐蔗糖酶突变体具有良好的热稳定性，更有利于降低微分子量右旋糖酐及其衍生物的生产成本和扩大其应用领域。
本发明的耐热右旋糖酐蔗糖酶突变体的热稳定性较好，突变酶在生产、制备、包装及储运等过程中无需冷链条件，酶在高温条件下能保持很好的催化活性，能在生产中适应生产的不稳定条件，酶活力在高温条件下不易失活，也可以制成固定化酶(某些固定化载体如pva在50℃左右将凝固)，保持长时间的催化能力，有利于提高酶的利用效率。此外，耐热右旋糖酐蔗糖酶在较高的温度下进行反应，高温条件下作为底物的蔗糖溶解度的增加有利于提高底物利用效率，产物即右旋糖酐在高温条件下溶解度增大，可以降低转化液的粘稠度，有利于物料传递和交换以加快反应速度，同时也可以减少生产过程中降温所需的耗能，而且还可以一定程度上防止杂菌的污染，这些优点有利于降低生产成本。本发明是理论和实验实践相结合的成功例子，其研究策略和实施技术方案也大大减少科研实践中的盲目性和不可遇见性，有效节约了科研资源和生产成本，体现了技术成果和实施手段的先进性。
附图说明
图1右旋糖酐蔗糖酶突变体dsrvδ的蛋白表达sds-page图。
图2右旋糖酐蔗糖酶突变体dsrvδ的ph分析图。
图3右旋糖酐蔗糖酶突变体dsrvδ热稳定性分析图。
图4右旋糖酐蔗糖酶突变体dsrvδ催化蔗糖生成的右旋糖酐的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，下述实例所述内容属于本发明的主要内容，但是并不仅仅限于这些内容。需要说明的是，有些对本领域专业人员来说是显而易见的修改或扩展内容，虽然并未在本专利说明书中出现，但也应属于本发明的专利请求范围。
实验材料、试剂及实验方法说明:本发明及实施例所述的菌株及载体，如宿主细胞大肠杆菌e.colibl21(de3)和表达载体pet-22b( )等材料均通过商业途径购买；酶类及其他生化试剂、培养基等实验耗材均从生化试剂公司买到，固体lb培养基加1.5％(w/v)琼脂和浓度为100μg/ml氨苄青霉素；实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)书中所列具体方法和步骤实行，或按照试剂盒和产品说明书进行；突变酶的高效表达、酶活检测、转化实验、产物鉴定与检测等方法均参照相关已报导的常规方法和文献进行。
实施例1.右旋糖酐蔗糖酶突变体dsrvδ基因的合成及其重组菌构建
本发明人通过对柠檬明串珠菌(leuconostoccitreumnrrlb-1299)、肠膜状明串珠菌(leuconostocmesenteroides0326)及其其它嗜热菌等来源的右旋糖酐蔗糖酶dsr进行同源比对分析，具体通过序列比对、同源建模、结构比对及优化、分子设计及分子剪切，主要截取保留上述dsrv蛋白的37-1430区间氨基酸组成的肽段，并经过结构优化设计最终得到右旋糖酐蔗糖酶突变体dsrvδ，其氨基酸序列如seqidno.1所示。发明人再按照突变体dsrvδ氨基酸序列，同时考虑其蛋白高效表达和纯化的需要，依照大肠杆菌密码子偏好性的原则，对其编码基因的核苷酸序列进行密码子优化，得到其突变体基因dsrvδ的核苷酸序列，其核苷酸序列如seqidno.2所示。
通过有资质的生物技术公司，按照全基因合成方法得到其突变体基因dsrvδ的dna片段，将此dna片段与表达载体pet-22b( )进行连接得到重组表达载体pet-22b-dsrvδ，再导入大肠杆菌宿主细胞bl21(de3)菌株得到重组大肠杆菌bl21(de3)/pet-22b-dsrvδ，以该重组菌进行右旋糖酐蔗糖酶突变体dsrvδ的高效表达以及酶的制备，将制备的右旋糖酐蔗糖酶突变体酶用于催化转化蔗糖生成右旋糖酐及其衍生物的相关实验。
实施例2.右旋糖酐蔗糖酶突变体dsrvδ诱导表达与酶学性质研究
在涂有重组大肠杆菌bl21(de3)/pet-22b-dsrvδ平板上，挑一个单菌落于5mllb(含100μg/ml氨苄青霉素，amp)液体培养基中，37℃，220rpm培养过夜。从5ml的lb菌液中按2％的接种量接种到装有200mllb(含100μg/mlamp)液体培养基的500ml摇瓶中，当在37℃和220rpm培养菌体浓度至od600为0.5～0.7时，加入iptg至终浓度为1mmol/l，同时加入5ml无菌的tris-hci溶液(ph值6.4，100mmol/l)，在30℃和220rpm的摇床中振荡培养4h-8h。取诱导培养5h后的培养液200ml，离心收集菌体，按每克菌体加5ml的破胞缓冲液(20mm醋酸钠缓冲液，ph5.4、20mmcacl2、0.2g/lsodiumamide)重悬菌体，加入tritonx-100至终浓度0.5％，超声波破胞后(工作时间10sec，间隔时间10sec，60个循环)，于4℃12000rpm离心15min取上清液即得粗酶液。同时，对诱导表达的重组菌进行sds-page电泳检测突变体的表达情况，如图1所示，空白对照的大肠杆菌bl21(de3)/pet-22b没有目标条带出现(lane2)，突变体酶(lane1)的分子量大小约为155kda，表明该突变体酶表达成功，其分子量大小与其理论值相符。
右旋糖酐蔗糖酶的酶活测定采用3，5-二硝基水杨酸法(即dns法)：其原理是右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖中的葡萄糖基被聚合成葡聚糖，同时释放出果糖，果糖是一种还原糖，所以可以通过检测果糖的含量来检测右旋糖酐蔗糖酶的活性。
右旋糖酐蔗糖酶活力测定方法：取200μl反应缓冲溶液(200mmol/l蔗糖；20mmol/l醋酸钠缓冲溶液，ph5.6；20mmol/lcacl2)于冰上浴预冷5min后，用排枪分装入96孔反应板，加入20μl适当倍数稀释酶液，在最适温度下准确反应20min(以沸水灭活的酶10min为空白对照)，加入200μldns终止反应，然后沸水浴5min使充分显色，再置冷水中冷却，经过适当的稀释，用酶标仪检测其od520值，计算酶的活力。
酶活力单位定义：在最适反应温度及最适ph条件下，每min生成1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位(1u)。
以蔗糖为底物，配制含有同一底物浓度的不同ph值的反应缓冲液(ph值5.0～6.2之间)，按前述的方法测定不同ph对右旋糖酐蔗糖酶活力的影响，相对活力最高的ph即为该酶的最适ph，实验表明本发明的右旋糖酐蔗糖酶突变酶最适ph为5.7(图2)。
在最适ph条件下，以蔗糖为底物按上述方法制备反应缓冲溶液，用薄壁96孔反应板分装100μl的反应液，采用梯度pcr仪将酶促反应的温度控制在50℃～70℃之间，在不同的温度条件下，用dns法测定果糖的生成量，确定酶的最适反应温度。如图3所示，突变酶最适温度是63℃，右旋糖酐蔗糖酶突变酶在58-68℃温度范围内保持80％以上的活力，表现出良好的热稳定性。
实施例3.右旋糖酐蔗糖酶突变体dsrvδ转化蔗糖的制备右旋糖酐的实验
按本发明实施例2的方法，制备足够量的右旋糖酐蔗糖酶突变体粗酶液，进行转化蔗糖生成右旋糖酐的实验。发明人在5.0l的玻璃反应釜中加入2000ml的醋酸钠缓冲溶液(20mmol/l醋酸钠，ph5.7，25mmol/lcacl2)，以100rpm转速搅拌并开始升高釜体的温度，同时加入蔗糖，加入的蔗糖总量为600g，蔗糖经搅拌充分溶解后，通过水浴循环将反应釜温度控制在63℃左右，再加入右旋糖酐蔗糖酶突变体粗酶液1000u，在63℃温度、100rpm条件下催化反应15小时，反应期间每隔3小时取样以检测右旋糖酐的分子量(样品稀释200～300倍使用高效液相色谱法(hplc)测量溶液中右旋糖酐的分子量及产物的含量)。当反应釜转化至15小时时终止反应，将反应釜的温度升至85℃保温1小时以灭活右旋糖酐蔗糖酶，用纱布滤过变性酶蛋白等杂质后，转化液再置于沸水浴中30分钟灭活残留的右旋糖酐酶，经真空过滤得到清澈透明的滤液，即为含有低或微分子量右旋糖酐和果糖的混溶液。混合溶液经醇沉淀分离方法除掉果糖，即得到只含有低分子量的右旋糖酐溶液。右旋糖酐溶液再加热浓缩到一半的体积，冷却到室温至右旋糖酐结晶析出，再通过真空旋转蒸发浓缩的方法进一步蒸干水分(真空度控制在30～50hpa，温度控制在45～50℃)，即得右旋糖酐粗成品。
经hplc法检测，催化反应进行到3、6、9、12和15小时时，反应体系中右旋糖酐平均分子量分别大约达到4436、8512、13020、14771和15135(da)，当反应进行到9小时以后，其产物的分子量增长速率明显减慢，因此，通过适当地控制转化反应的时间，该突变体可转化蔗糖制备不同分子量的低、微分子量等级的右旋糖酐产物。
按本实例3的方法，转化反应6小时后终止反应，对产物进行提取和纯化，得到微分子量的右旋糖酐产品，其hplc法检测分析结果如图4的(b)所示，其产物右旋糖酐的分子量主要集中在8500da左右(保留时间16.125min)，产物中含有极少量的寡聚糖。图4的(a)为右旋糖酐标准品的hplc色谱图，分子量分别为15000da和8000da，其保留时间分别为13.616min和16.234min，图4的(a)和(b)在4～6min出现的是溶剂峰。
实施例4.右旋糖酐蔗糖酶突变体dsrvδ转化蔗糖的制备右旋糖酐衍生物的实验
本发明制备的右旋糖酐衍生物主要是常用的右旋糖酐铁、铜、锌等金属络合物的制备。按本发明实施例3的方法，当制备得到只含有低分子量右旋糖酐溶液时(混合液经醇沉淀的方法除掉了果糖成分)，无需对右旋糖酐进行纯化和干燥处理，而是在反应釜里直接浓缩或稀释得到右旋糖酐含量为40％的溶液，再加入终浓度为5％(w/v)的柠檬酸钠作为络合催化剂，于70-80℃搅拌1小时进行活化；再以20％氢氧化钠溶液调节使其溶液呈弱碱性，保持70-80℃搅拌2-3小时；将反应体系降温至60℃，用盐酸溶液调节ph至5.8-6.0，滴加终浓度为0.4-0.5mol/l的三氯化铁溶液，同时滴加20％氢氧化钠溶液使ph稳定在5.8-6.5之间，再升温到70-80℃、100rpm搅拌3-5小时进行络合反应，后冷却到室温，即得到低分子量右旋糖酐铁粗品溶液。
按本发明实施例3的方法制备得到含有分子量约5000da的溶液(混合液经醇沉淀的方法除掉了果糖成分)，在反应釜里直接浓缩或稀释得到右旋糖酐含量为50％的溶液，保持100rpm搅拌，加入20％氢氧化钠溶液使其弱碱性，控温80～90℃，经90min反应进行活化，滴加氯化铜溶液使其终深度为0.5mol/l，滴加过程中用20％的氢氧化钠溶液控制其ph为5.0～6.0，控温60～70℃反应120min，反应完毕后冷却到室温，即得到低分子量右旋糖酐铜粗品溶液。
按本发明实施例3的方法制备得到含有分子量约5000da的溶液(混合液经醇沉淀的方法除掉了果糖成分)，在反应釜里直接浓缩或稀释得到右旋糖酐含量为30％的溶液，保持100rpm搅拌，加入20％氢氧化钠溶液使其呈弱碱性，控温90～100℃，经120min反应进行活化，滴加氯化锌溶液使其终深度为0.4mol/l，滴加过程中用20％的氢氧化钠溶液控制其ph为5.5～6.5，控温70～80℃反应150min，反应完毕，后冷却到室温，即得到低分子量右旋糖酐锌粗品溶液。
上述的方法制备得到的右旋糖酐铁、铜、锌粗品溶液，分别加入3倍量的85％乙醇，洗涤后进行抽滤，沉淀物用适量水溶解后进行抽滤去掉杂质，再经过醇洗、水洗，最后用95％的乙醇洗涤，得到纯度较好的产物，干燥后即得右旋糖酐铁、铜、锌元素的金属络合物(即衍生物)。
应该理解的是，对本领域的研究人员来说，根据上述说明的方法加以改进或变换，例如，所述的耐热右旋糖酐蔗糖酶突变体或其功能等同的突变体，或氨基酸序列高度相似的突变体，除了来源于柠檬明串珠菌(leuconostoccitreum)之外，还可以来源于肠膜状明串珠菌(leuconostocmesenteroides)、口腔链球菌(oralstreptococcus)、乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)、大蒜明串珠菌(leuconostocgarlicum)、leuconostocsuionicum、芽孢杆菌属、放线菌、酸假孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜热thermus属thermusthermophilus等菌株。所述的载体适于在大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母等宿主中表达，也可通过电转化法、原生质体转化法和同源整合等方法将本发明的右旋糖酐蔗糖酶突变体转入原核或者真核宿主中，以实现右旋糖酐蔗糖酶突变体的表达和制备。或者按照上述说明的办法通过酶工程技术对本发明所述的突变体的某些区段的氨基酸残基进行剪除或替换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
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<110>广西产研院生物制造技术研究所有限公司
<120>一种耐热右旋糖酐蔗糖酶突变体及其制备方法与应用
<130>一种耐热右旋糖酐蔗糖酶突变体及其制备方法与应用
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1.一种耐热右旋糖酐蔗糖酶突变体，其特征在于，其制备方法是截取柠檬明串珠菌(leuconostoccitreum)右旋糖酐蔗糖酶dsrv的37-1430区间氨基酸肽段并经结构优化得到的蛋白质，其氨基酸序列如seqidno.1所示。
2.一种编码权利要求1所述突变体的基因，其特征在于，其核苷酸序列如seqidno.2所示。
3.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求2中所述的突变体基因。
4.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述表达载体转化的原核细胞或真核细胞。
5.权利要求1所述的突变体酶，在催化蔗糖和含有蔗糖成分的原料制备右旋糖酐的应用，以及在制备右旋糖酐衍生物中的应用。
技术总结