本发明属于生物医药技术领域，涉及一种抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，根据免疫组织化学分析雌激素受体的状态主要分为：雌激素阳性乳腺癌和雌激素受体阴性乳腺癌。在乳腺癌中，有一小部分细胞亚群保留了自我更新和分化的能力来填充整个肿瘤，可能是促进肿瘤发生和发展的元凶，被称为乳腺癌干细胞。乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的指标包括干细胞集落形成能力、干细胞3d形成率、干细胞数、干细胞的细胞周期变化、干细胞的划痕迁移水平和增殖相关蛋白表达水平变化。嘌呤霉素是一种氨基核苷类抗生素，作为肽转移酶的抑制剂，能够通过提前终止多肽链的合成，阻止蛋白质的合成。已有研究发现嘌呤霉素对乳腺癌细胞的生长具有抑制作用，同时，还可以能够抑制结肠癌干细胞的增殖并促进肿瘤细胞的凋亡。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法，该方法利用氨基核苷类抗生素嘌呤霉素，以干细胞为靶点，采用体外培养技术和组织化学方法用于抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力。
本发明所采用的技术方案是，抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法，包括如下步骤：
步骤1，建立检测乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的体系；
步骤2，基于步骤1建立的体系，针对雌激素受体阳性乳腺癌干细胞，采用不同浓度的嘌呤霉素，抑制癌干细胞的增殖和迁移能力。
步骤1的具体过程为：
步骤1.1，将人乳腺癌细胞系mcf-7使用rpmi-1640培养基，添加10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素，培养在37℃二氧化碳培养箱中，生长至对数生长期时用于实验；
步骤1.2，取步骤1.1所得的对数生长期的细胞胰酶分别进行消化、重悬后加入干细胞标志物abcg2抗体，冰上避光孵育15min，清洗后离心弃去上清，定容后进行流式分选；
步骤1.3，将步骤1.2分选得到的乳腺癌干细胞铺板在吸附的96孔板中，以0～0.5μm浓度的嘌呤霉素处理24～72小时，待5～7天后镜下计数，测量直径，统计乳腺癌干细胞富集的乳腺微球的形成率。
乳腺癌干细胞以500个细胞/孔铺板在吸附的96孔板中，以0.5μm浓度的嘌呤霉素处理48小时，待5天后镜下计数。
步骤2的具体过程为：
步骤2.1，集落形成检测：将细胞接种在6孔板中，加药培养2周后弃去培养液，冰甲醇固定细胞后进行结晶紫染色，显微镜下计数集落；
步骤2.2，3d类器官直径测量：将乳腺微球接种至含有基底膜基质的离心管中混匀，铺板于超低吸附的12孔板中培养2天后加药处理，培养6天后测量形成的3d类器官直径；
步骤2.3，流式细胞术检测细胞周期：收集药物处理后的细胞，加入预冷70％乙醇4℃固定24小时，重悬后加入碘化丙啶染色液，室温避光后流式上样；
步骤2.4，划痕实验检测细胞迁移：将细胞接在6孔板中生长至约95％时，用枪头划痕，去除培养液后，加入药物后立即拍照，24小时后再次在相同位置拍照；
步骤2.5，westernblot检测增殖相关蛋白表达：按照蛋白质提取试剂盒提取蛋白，bca试剂盒测定蛋白浓度，sds-page进行电泳分离，转膜并封闭后加入一抗和二抗，ecl显色后扫描分析。
嘌呤霉素抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力。
本发明的有益效果是，本发明利用氨基核苷类抗生素嘌呤霉素，以干细胞为靶点，采用体外培养技术和组织化学方法用于抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力。
附图说明
图1是本发明抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法实施例中未经嘌呤霉素处理的对照组雌激素受体阳性乳腺癌干细胞集落数显示图；
图2是本发明抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法实施例中经嘌呤霉素处理的处理组雌激素受体阳性乳腺癌干细胞集落数显示图；
图3是图1和图2中对照组及处理组对应的克隆数柱状图；
图4(a)、4(b)是本发明抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法实施例中嘌呤霉素处理雌激素受体阳性乳腺癌干细胞3d结构直径显示图；
图5是与图4(a)、4(b)对应的3d结构直径柱状结构图；
图6是与图4(a)、4(b)对应的3d形成率柱状结构图；
图7(a)、7(b)是本发明抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法实施例中嘌呤霉素处理雌激素受体阳性乳腺癌细胞的显微镜放大图；
图8是与图7(a)、7(b)对应的乳腺癌细胞周期分布柱状图；
图9(a)、9(b)是本发明抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法实施例中嘌呤霉素处理0小时，雌激素受体阳性乳腺癌干细胞迁移能力变化显示图；
图10(a)、10(b)是本发明抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法实施例中嘌呤霉素处理24小时后，雌激素受体阳性乳腺癌干细胞迁移能力变化显示图；
图11是本发明抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法实施例中对照组和处理组对应的划痕愈合长度的柱状图；
图12是本发明抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法实施例中对照组和处理组的pcna和p53表达水平显示图；
图13是本发明抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法实施例中p53表达水平柱状图；
图14是本发明抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法实施例中pcna表达水平柱状图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法，该方法采用氨基核苷类抗生素和肽转移酶抑制剂嘌呤霉素，通过将雌激素受体阳性乳腺癌细胞mcf-7采用抗体标记后，进行流式细胞分选得到乳腺癌干细胞，利用不同剂量嘌呤霉素和不同时间处理，达到抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的目的。具体过程如下：
(1)将人乳腺癌细胞系mcf-7使用rpmi-1640培养基，添加10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素，培养在37℃二氧化碳培养箱中，生长至对数生长期时用于实验；
(2)取对数生长期的细胞胰酶消化后，重悬后按照推荐的浓度加入干细胞标志物abcg2抗体，冰上避光孵育15min，清洗后离心弃去上清，定容后进行流式分选；
(3)将分选得到的乳腺癌干细胞铺板于在极低吸附的96孔板中，分别以0～0.5μm浓度的嘌呤霉素处理24～72小时，待5～7天后镜下计数，测量和统计乳腺癌干细胞富集的乳腺微球直径和形成率。
通过采取上述步骤建立的检测乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的体系，通过上述步骤采取培养基给药的方法，针对雌激素受体阳性乳腺癌干细胞，采用不同浓度的嘌呤霉素，抑制癌干细胞的增殖和迁移能力，具体步骤如下：
(1)集落形成检测：将细胞接种在6孔板中，加药培养2周后弃去培养液，冰甲醇固定细胞后进行结晶紫染色，显微镜下计数集落。
(2)3d类器官直径测量：将乳腺微球接种至含有基底膜基质的离心管中混匀，铺板于超低吸附的12孔板中培养2天后加药处理，培养6天后测量形成的3d类器官直径。
(3)细胞增殖-毒性检测试剂盒检测细胞存活率：取对数生长期的乳腺癌细胞接种在96孔板中，加药培养1天后试剂孵育后在450nm测定吸光度。根据吸光值计算细胞存活率。
(4)流式细胞术检测细胞周期：收集药物处理后的细胞，加入预冷70％乙醇4℃固定24小时，重悬后加入碘化丙啶染色液，室温避光后流式上样。
(5)划痕实验检测细胞迁移：将细胞接在6孔板中生长至约95％时，用枪头划痕，去除培养液后，加入药物后立即拍照，24小时后再次在相同位置拍照。
(6)westernblot检测增殖相关蛋白表达：按照蛋白质提取试剂盒提取蛋白，bca试剂盒测定蛋白浓度，sds-page进行电泳分离，转膜并封闭后加入一抗和二抗，ecl显色后扫描分析。
以0.5μm浓度的嘌呤霉素处理48小时效果最佳，结果显示：
1.按照0.5μm浓度处理，可抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞的增殖；
2.按照0.5μm浓度处理，阻滞雌激素受体阳性乳腺癌细胞的g2/m期；
3.按照0.5μm浓度处理，可抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞的迁移；
4.按照0.5μm浓度处理，可抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖相关蛋白表达。
实施例
1.细胞培养：将人乳腺癌细胞系mcf-7使用rpmi-1640培养基，添加10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素，培养在37℃二氧化碳培养箱中，生长至对数生长期时用于实验。
2.流式细胞术进行乳腺癌干细胞分选：取对数生长期的细胞胰酶消化后，重悬后按照推荐的浓度加入干细胞标志物abcg2抗体，冰上避光孵育15min，清洗后离心弃去上清，定容后进行流式分选。
3.乳腺癌干细胞微球培养：将分选得到的乳腺癌干细胞铺板于在极低吸附的96孔板中，分别以0～0.5μm浓度的嘌呤霉素处理24～72小时，待5天和7天后镜下计数，测量和统计乳腺癌干细胞富集的乳腺微球直径和形成率。乳腺癌干细胞以500个细胞/孔铺板于在极低吸附的96孔板中，以0.5μm浓度的嘌呤霉素处理48小时，待5天后镜下计数，结果重复性好最为可靠。
4.集落形成检测：将细胞接种在6孔板中，加药培养2周后弃去培养液，冰甲醇固定细胞后进行结晶紫染色，显微镜下计数集落，嘌呤霉素处理组的集落形成能力明显低于对照组，参见图1～3。
5.3d类器官直径测量：将乳腺微球接种至含有基底膜基质的离心管中混匀，铺板于超低吸附的12孔板中培养2天后加药处理，培养6天后测量形成的3d类器官直径。嘌呤霉素处理组3d类器官的形成率(每1000个细胞形成的3d数量)和3d直径显著低于对照组，参见图4(a)、4(b)及图5、6。
6.流式细胞术检测细胞周期：收集药物处理后的细胞，加入预冷70％乙醇4℃固定24小时，重悬后加入碘化丙啶染色液，室温避光后流式上样。流式细胞周期分析结果显示，与对照组相比，嘌呤霉素处理组的g2/m期细胞的比例明显升高，具有统计学差异，表明嘌呤霉素阻滞mcf-7乳腺癌细胞的g2/m期，参见图7(a)、7(b)及图8。
7.划痕实验检测细胞迁移：将细胞接在6孔板中生长至约95％时，用枪头划痕，去除培养液后，加入药物后立即拍照，24小时后再次在相同位置拍照。划痕实验结果显示，嘌呤霉素处理组乳腺癌干细胞的24h划痕愈合率显著低于对照组，表明嘌呤霉素可以抑制乳腺癌干细胞的迁移能力，参见图9(a)、9(b)及图10(a)、10(b)及图11。
8.westernblot检测增殖相关蛋白表达：按照蛋白质提取试剂盒提取蛋白，bca试剂盒测定蛋白浓度，sds-page进行电泳分离，转膜并封闭后加入一抗和二抗，ecl显色后扫描分析。与对照组相比，嘌呤霉素处理后p53蛋白的表达显著升高，pcna蛋白表达明显降低，参见图12～14。以上结果提示，嘌呤霉素可能通过改变p53蛋白表达抑制乳腺癌干细胞的增殖。
结果显示，嘌呤霉素可能通过改变p53蛋白表达抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞的增殖和迁移。
1.抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，建立检测乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的体系；
步骤2，基于步骤1建立的体系，针对雌激素受体阳性乳腺癌干细胞，采用不同浓度的嘌呤霉素，抑制癌干细胞的增殖和迁移能力。
2.根据权利要求1所述的抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法，其特征在于，所述步骤1的具体过程为：
步骤1.1，将人乳腺癌细胞系mcf-7使用rpmi-1640培养基，添加10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素，培养在37℃二氧化碳培养箱中，生长至对数生长期时用于实验；
步骤1.2，取步骤1.1所得的对数生长期的细胞胰酶分别进行消化、重悬后加入干细胞标志物abcg2抗体，冰上避光孵育15min，清洗后离心弃去上清，定容后进行流式分选；
步骤1.3，将步骤1.2分选得到的乳腺癌干细胞铺板在吸附的96孔板中，以0～0.5μm浓度的嘌呤霉素处理24～72小时，待5～7天后镜下计数，测量直径，统计乳腺癌干细胞富集的乳腺微球的形成率。
3.根据权利要求2所述的抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法，其特征在于，所述乳腺癌干细胞以500个细胞/孔铺板在吸附的96孔板中，以0.5μm浓度的嘌呤霉素处理48小时，待5天后镜下计数。
4.根据权利要求3所述的抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法，其特征在于，所述步骤2的具体过程为：
步骤2.1，集落形成检测：将细胞接种在6孔板中，加药培养2周后弃去培养液，冰甲醇固定细胞后进行结晶紫染色，显微镜下计数集落；
步骤2.2，3d类器官直径测量：将乳腺微球接种至含有基底膜基质的离心管中混匀，铺板于超低吸附的12孔板中培养2天后加药处理，培养6天后测量形成的3d类器官直径；
步骤2.3，流式细胞术检测细胞周期：收集药物处理后的细胞，加入预冷70％乙醇4℃固定24小时，重悬后加入碘化丙啶染色液，室温避光后流式上样；
步骤2.4，划痕实验检测细胞迁移：将细胞接在6孔板中生长至约95％时，用枪头划痕，去除培养液后，加入药物后立即拍照，24小时后再次在相同位置拍照；
步骤2.5，westernblot检测增殖相关蛋白表达：按照蛋白质提取试剂盒提取蛋白，bca试剂盒测定蛋白浓度，sds-page进行电泳分离，转膜并封闭后加入一抗和二抗，ecl显色后扫描分析。
5.根据权利要求4所述的抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法，其特征在于，所述嘌呤霉素抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力。
技术总结