本发明涉及一种细胞株，具体为一种鼠源性口腔鳞状细胞癌细胞株、制备方法及其应用。
背景技术：
肿瘤细胞系是肿瘤研究中常用的工具，对研究肿瘤的发生、发展的过程，转移的分子发生机制，潜在的治疗靶点筛选，治疗药物效果的评估都具有重要的作用。人源性口腔鳞癌细胞系可以很好地保留患者肿瘤的遗传背景和生物学特性，但是由于种属间的差异产生的免疫排斥，人源性口腔鳞癌细胞系在免疫健全的小鼠上的成瘤效果差强人意。如果使用人源性肿瘤细胞系在免疫缺陷的小鼠上成瘤则又忽略了肿瘤和免疫系统之间的互相作用在肿瘤的发生、发展中发挥的重要作用。
现有的人源性口腔鳞癌细胞系在免疫健全小鼠上成瘤效果均不佳，极大地阻碍了肿瘤免疫的小鼠模型的建立以及后续肿瘤和免疫系统互相作用机制的研究。
技术实现要素：
为了解决现有在免疫健全小鼠上具有成瘤性的鼠源性口腔鳞癌细胞系的缺失，本发明提供了一种小鼠口腔鳞癌细胞株、制备方法及其应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种鼠源性口腔鳞状细胞癌细胞株，生物保藏说明：小鼠口腔鳞癌细胞jc1于2021年4月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏编号为cctccno:c202162。
本发明所述的一种鼠源性口腔鳞状细胞癌细胞株的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将4-硝基喹啉-n-氧化物(4-nitroquinoline-n-oxide,4-nqo)加入小鼠饮水，诱导小鼠口腔鳞状细胞癌，取得小鼠口腔鳞癌肿瘤组织；
步骤二：将小鼠肿瘤组织进行消化、原代培养，得到小鼠肿瘤原代细胞；将原代细胞采用单克隆筛选的方法，挑出一株单克隆细胞；
步骤三：将上述单克隆细胞进行纯化，并且进行连续传代，筛选出细胞株，得到小鼠口腔鳞状细胞癌细胞株。
进一步的，步骤一中所用小鼠品系为c57bl/6j。
进一步的，步骤二中原代培养方法为：将小鼠肿瘤组织用组织剪剪成1*1*1mm的小块，依次加入中性蛋白酶和胰酶进行消化，然后贴壁培养，得到原代细胞。本发明所述的鼠源性口腔鳞状细胞癌细胞株在临床前药物治疗效果评价的应用。
本发明所述的鼠源性口腔鳞状细胞癌细胞株在肿瘤免疫治疗药物的筛选和效果中的应用。
有益效果：本发明提供了一种鼠源性口腔鳞状细胞癌细胞株、制备方法及其应用，小鼠鳞癌细胞在免疫缺陷裸鼠和免疫健全c57bl/6j小鼠上均能成瘤，解决了现有的人源性口腔鳞癌细胞系在免疫健全小鼠上成瘤效果均不佳的问题，在肿瘤免疫的小鼠模型的建立以及后续肿瘤和免疫系统互相作用机制的研究中具有重要的价值。
附图说明
图1为小鼠舌部鳞状细胞癌肉眼观图。
图2为小鼠肿瘤组织切片he染色图。
图3为小鼠肿瘤组织切片免疫组织化学染色图(左：ck，右：ki-67)。
图4为小鼠鳞癌细胞镜下观图。
图5为小鼠鳞癌细胞免疫荧光染色图(从左到右，ck，vimentin，ki-67)。
图6为小鼠鳞癌细胞细胞周期流式检测图。
图7为免疫健全小鼠皮下成瘤瘤体切片he染色图。
图8为免疫健全小鼠皮下成瘤瘤体切片免疫荧光染色图(绿：cd3，红：cd8，靛蓝：pd-1，蓝：dapi)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合附图对本发明进行进一步说明。
实施例1小鼠口腔鳞状细胞癌细胞株的制备方法
步骤一：将4-nqo(100微克/毫升)加入c57bl/6j小鼠的饮水中，诱导20周，换成正常饮水，继续饲养4周，见小鼠舌背部长出一菜花样病灶，基底部有浸润，诊断为口腔鳞状细胞癌(图1)。用高温高压灭菌过的组织剪和刀片迅速切除肿瘤组织，浸泡在含有20％胎牛血清和1％青霉素 链霉素双抗的高糖dmem培养液中，迅速转移到生物安全柜中操作。用含有1％双抗的pbs缓冲液反复冲洗，得到小鼠肿瘤组织；
步骤二：将上述的小鼠肿瘤组织用灭菌过的组织剪剪成1*1*1mm的小块，用pbs冲洗后，加入1毫升胰酶，在37℃细胞培养箱中孵育20分钟，加入过量的含有20％胎牛血清和1％双抗的高糖dmem培养液中和胰酶，终止消化，1000rpm离心5分钟，去除上清液，用含有20％胎牛血清和1％双抗的高糖dmem培养液重悬肿瘤组织，进行贴壁培养，每2天换液一次，得到原代细胞；
步骤三：对步骤二得到的原代细胞进行纯化，用含有20％胎牛血清和1％双抗的高糖dmem培养液培养细胞，每3天传代一次，连续培养超过30代，细胞仍然增殖活跃；
步骤四：采用有限稀释法对步骤三获得的细胞进行单克隆筛选，将步骤三所得的细胞消化，制备成单细胞悬液，然后用培养液稀释到10个细胞/1毫升的浓度，以100微升/孔的密度将细胞悬液接种在96孔板中，每2天换液一次，挑选出单克隆细胞，将单克隆细胞进行连续传代，传至超过50代后，细胞增殖仍然活跃，即得到小鼠源性的口腔鳞状细胞癌细胞株(图4)。
实施例2小鼠口腔鳞癌细胞株的检测鉴定
(1)形态观察
细胞形态呈多边形、椭圆形或肾形，成团接触生长，细胞核较大，胞浆丰富。
(2)免疫荧光染色检测
步骤一：将细胞接种于细胞爬片上，待细胞密度为40％～50％时，用pbs缓冲液冲洗两次，每次5分钟，加入4％多聚甲醛固定30分钟，用pbs缓冲液再冲洗两次，每次5分钟；
步骤二：每片加入100微升的3％过氧化氢溶液，目的为阻断内源性过氧化氢酶，以减少非特异性染色，室温孵育30分钟，pbs缓冲液冲洗3次，每次5分钟；
步骤三：每片加入100微升的5％山羊血清，室温孵育20分钟；
步骤四：每片加入100微升的一抗，4度孵育过夜；
步骤五：pbs缓冲液冲洗3次，每次5分钟，每片加入100微升的荧光二抗，室温孵育30分钟；
步骤五：pbs缓冲液冲洗3次，每次5分钟，每片加入100微升的dapi染料，室温孵育5分钟；
步骤六：pbs缓冲液冲洗3次，每次5分钟，滴加防荧光淬灭封片剂，封片，镜下观察，结果如图5。
(3)细胞周期检测：
步骤一：将细胞接种于六孔板中，待细胞密度为40％～50％时，用pbs缓冲液冲洗两次，每次5分钟，1000rpm离心5分钟；
步骤二：用1毫升预冷的pbs缓冲液重悬细胞，边震荡边加入3毫升无水乙醇，4度过夜；
步骤三：4度2000rpm离心5分钟，弃上清，pbs缓冲液冲洗2次，弃上清；
步骤四：加入400微升pi/rnasestainingbuffer，避光孵育15分钟；
步骤五：bd流式细胞仪上机检测，结果见图6。
实施例3小鼠口腔鳞癌细胞株的动物模型的建立
步骤一：将c57bl/6j小鼠麻醉，在上背部脱毛，将上述的细胞制备成1*107个细胞/1毫升的细胞悬液，每只小鼠接种100微升细胞；
步骤二：每周两次观察小鼠状态，测量小鼠肿瘤大小(肿瘤体积＝肿瘤最大径*最小径*最小径/2)，称量小鼠体重；
步骤三：在肿瘤达到1000mm2之前对小鼠实施安乐死，收集小鼠肿瘤组织，甲醛固定，石蜡包埋，切片；
步骤四：对切片进行he和免疫荧光染色，结果见图7、图8。
综上所述，在光学显微镜下观察，细胞呈多边形或椭圆形，成团贴壁生长，细胞核较大，胞浆丰富。he染色见细胞核圆形、椭圆形或肾形，核仁较清晰。所述细胞的免疫荧光染色显示：上皮标记物角蛋白ck强阳性，上皮间充质转化(epthelialmesenchymaltransformation，emt)相关标志物vimentin呈阳性，ki-67染色阳性。通过实验结果得出，小鼠鳞癌细胞在免疫缺陷裸鼠和免疫健全c57bl/6j小鼠上均能成瘤。
1.一种鼠源性口腔鳞状细胞癌细胞株。
2.权利要求1所述的一种鼠源性口腔鳞状细胞癌细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将4-硝基喹啉-n-氧化物加入小鼠饮水，诱导小鼠口腔鳞状细胞癌，取得小鼠口腔鳞癌肿瘤组织；
步骤二：将小鼠肿瘤组织进行消化、原代培养，得到小鼠肿瘤原代细胞；将原代细胞采用单克隆筛选的方法，挑出一株单克隆细胞；
步骤三：将上述单克隆细胞进行纯化，并且进行连续传代，筛选出细胞株，得到小鼠口腔鳞状细胞癌细胞株。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤一中所用小鼠品系为c57bl/6j。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤二中原代培养方法为：将小鼠肿瘤组织用组织剪剪成1*1*1mm的小块，依次加入中性蛋白酶和胰酶进行消化，然后贴壁培养，得到原代细胞。
5.权利要求1所述的鼠源性口腔鳞状细胞癌细胞株在临床前药物治疗效果评价的应用。
6.权利要求1所述的鼠源性口腔鳞状细胞癌细胞株在肿瘤免疫治疗药物的筛选和效果中的应用。
技术总结