本发明属于生物医用材料的技术领域，具体涉及一种负载hhc36的聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料及其制备方法和应用。
背景技术：
骨组织缺损是创伤骨科常见的临床问题，大面积的骨缺损处理不当会导致骨的不愈合甚至坏死。目前，骨缺损的治疗方法有自体骨移植和异体骨移植，但骨来源的短缺和排异反应一定程度上限制了其应用。新型多功能骨替代材料的开发成为该领域的研究热点。骨缺损修复的成功不仅取决于骨替代物与骨组织的有效整合，还取决于骨替代材料周围是否为无菌环境。细菌感染是外科手术后可能发生的最严重的并发症之一。据估计，尽管使用了严格的消毒操作程序，一次外科手术的感染率在0.5％到5％之间，二次手术的再感染率可高达10％。因此，开发既能高效促进骨再生修复，又能通过局部缓释持续抗菌的多功能生物材料对于解决感染性骨缺损的临床治疗难题具有重要意义。
随着细菌适应性的提高，传统抗生素的有效性不断受到威胁。阳离子抗菌肽(amps)广泛存在于生物体中，是免疫系统的重要组成部分，具有低毒，低免疫原性和快速杀菌活性以及基本不会使细菌产生耐药性等优点。然而，在体内由于蛋白酶水解或高离子强度等使amps易于降解或失活，amps在临床上的应用受到限制。对于外科手术而言，amps的局部递送是植入体周围感染治疗的理想解决方案，这是因为它具有更高的抗菌效率，更低的细菌耐药性以及更好地控制抗菌剂分布以避免全身毒性。
天然骨组织具有从纳米尺度到宏观层次的多级复杂构造，故其具有强大的力学性能和生物功能。因此，开发具有微/纳米多级结构的多功能型生物材料，模拟天然骨组织的组成、结构和性能，具有重要的临床应用前景。羟基磷灰石具有良好的生物相容性，低免疫原性，优异的成骨活性和ph依赖性降解，被广泛用作药物和生长因子的载体。此外，三维中空结构材料因独特的结构和超高的比表面积使其在药物递送中具有突出的性能。然而单纯的羟基磷灰石脆性大，力学稳定性较差。因此，通过仿生合成技术，可获得具有多级微/纳米结构、高比表面积和优异生物相容性的中空ha颗粒，并可通过聚多巴胺对其进行表面改性，这类ha微纳米颗粒可同时提供良好的骨修复性能和实现对抗菌剂的高效装载，故可用于多功能型感染性骨缺损治疗材料的开发。
文献(wang,n.,etal.,nisin-loadedpolydopamine/hydroxyapatitecomposites:biomimeticsynthesis,andinvitrobioactivityandantibacterialactivityevaluations.colloidsandsurfacesa:physicochemicalandengineeringaspects,2020.602:p.125101.)虽通过聚多巴胺作为模板剂实现羟基磷灰石的原位矿化，但形成的复合微球不具备介孔结构，释药速率较快，且未体现光热协同抗菌效果。
技术实现要素：
为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种负载hhc36的聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料及其制备方法和应用。
本发明针对现有感染性骨缺损治疗材料设计性能上存在的缺点和不足之处，提供了一种负载hhc36的聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料及其制备方法。
该复合微纳米颗粒由具有仿生结构的ha颗粒与多巴胺在tris·hcl(ph＝8.5)中均匀分散后，离心洗涤多次，冷冻干燥，得到聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料。随后将所得的复合材料与抗菌肽hhc36在去离子水中均匀分散后，离心去上清，冷冻干燥，最终得到负载hhc36的聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料。聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料具有高比表面，其分级微纳结构具有较高的成骨活性和骨诱导性；复合微纳米颗粒具有高载药量和局部递送功能，其能够产生光热效应快速杀菌，生物相容性良好；载药量高时复合颗粒可以有效杀灭骨缺损组织周围环境中的细菌生长，载微量药物时复合颗粒可以有效得抑制周围环境中的细菌滋生，其微纳结构促进骨组织再生修复。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
一种负载hhc36的聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将磷酸氢二铵固体加入水中，溶解，将溶液ph值调至5.8-6.2，得到溶液1；将硝酸钙固体加入到溶液1中溶解，并将其ph值调至4.6-5.2，得到溶液2；将柠檬酸钠加入到溶液2中溶解，进行反应，离心去上清液、冷冻干燥，得到羟基磷灰石复合材料；
(2)将步骤(1)所述的羟基磷灰石复合材料超声分散于tris·hcl缓冲液中，加入多巴胺溶解得混合液，避光搅拌，离心，洗涤，干燥，得到聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料；
(3)将步骤(2)所述聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料与抗菌肽hhc36加入到水中搅拌得混合液，孵育后离心，冷冻干燥，得到负载hhc36的聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料。
优选的，步骤(1)所述溶液1中磷酸氢二铵的浓度为1-30mm；
进一步优选地，步骤(1)所述磷酸氢二铵溶液的浓度为1-24mm。
优选的，所述硝酸钙与溶液1的摩尔体积比为1-90:1mmol/l；
进一步优选地，所述硝酸钙与溶液1的摩尔体积比为1-60:1mmol/l。
优选的，所述硝酸钙与柠檬酸钠的摩尔比为5-8:1。
进一步优选地，所述硝酸钙与柠檬酸钠的摩尔比为6-7:1。
优选的，步骤(1)所述反应的温度为150-200℃，反应的时间为1-12h。
进一步优选地，步骤(1)所述反应的温度为160-200℃，反应的时间为2-6h。
优选的，步骤(2)所述混合液中，tris·hcl的浓度为1-50mm；所述tris·hcl缓冲液的ph为7.2-9.0。
进一步优选地，步骤(2)所述混合液中，tris·hcl的浓度为0.1-20mm；更优选地，步骤(2)所述tris·hcl的浓度为10mm。
优选的，步骤(2)所述避光搅拌的时间为0.1-24h。
进一步优选的，步骤(2)所述避光搅拌的时间为3-8h；更优选地，避光搅拌的时间为4-6h。
优选的，步骤(2)所述混合液中，羟基磷灰石复合材料的浓度为0.1-20mg/ml；
进一步优选的，步骤(2)所述混合液中，羟基磷灰石复合材料的浓度为0.5-5mg/ml。
优选的，所述多巴胺与羟基磷灰石粉复合材料的质量比为0.1-1.5:1；
进一步优选的，所加多巴胺与羟基磷灰石复合材料的质量比为0.1-1:1。
优选的，步骤(3)所述混合液中，聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料的浓度为0.1-40mg/ml。
进一步优选的，步骤(3)所述聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料的浓度为0.5-5mg/ml。
优选的，步骤(3)所述聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料与抗菌肽hhc36的质量比为1:0.1-5；
进一步优选的，步骤(3)所述聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料与抗菌肽hhc36的质量比为1:0.1-2。
优选的，所述孵育的时间为1-24h；
进一步优选的，所述孵育吸附的时间为10-24h。
优选的，所述水为去离子水。
上述的制备方法制得的负载hhc36的聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料。
上述的一种负载hhc36的聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料在制备感染性骨缺损药物中的应用。
本发明中使用的负载hhc36的聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料具有更优异的促成骨效果，使得负载抗菌肽hhc36的复合材料兼具促骨修复和抗菌性能。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
本发明制备得到的微纳米颗粒具有独特的分级结构和较高的载药量；
本发明制备得到的复合微纳米颗粒具有良好的生物相容性，具有良好的光热效应，可在短期内高效杀菌；
在感染性骨缺损部位填充负载一定量的抗菌肽hhc36的复合微纳米颗粒，利用复合材料的高效抗菌活性和高促成骨活性，可以有效促进感染性骨缺损的再生修复。
附图说明
图1为实施例1-2和实施例4中制得的聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料的扫描电镜图。其中，a为实施例1的羟基磷灰石与多巴胺投料比为1:0时复合微球的形貌；b为实施例2的羟基磷灰石与多巴胺投料比为1:0.6时复合微球的形貌；c为实施例4的羟基磷灰石与多巴胺投料比为1:1.0时复合微球的形貌。
图2为实施例1和实施例3中制得的ha颗粒(曲线a)和功能化的ha复合微球(曲线b)的n2吸附-脱附曲线。
图3为实施例1和实施例3中制得的ha颗粒(曲线a)和功能化的ha复合微球(曲线b)的孔径分布图。
图4为实施例2制得的聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料0.5mg/ml和1mg/ml的光热效应评价曲线。
图5为实施例5制得的复合微纳米颗粒对金黄色葡萄球菌的抗菌性能评价图，左为对照组，右为复合微纳米颗粒处理组。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
高比表面积的仿生羟基磷灰石微纳米颗粒的制备，包括如下步骤：
分级结构的羟基磷灰石粉体的制备：配制浓度为24mm的磷酸氢二铵溶液，用硝酸将其ph调节为6.0，得到溶液1。将硝酸钙加入上述溶液1中，使硝酸钙与溶液1的摩尔体积比为40:1mmol/l，搅拌使其充分混合，并将其ph值调至5.0，得到溶液2。随后向溶液2中加入柠檬酸钠，柠檬酸钠与溶液1的摩尔体积比为6:1mmol/l，充分搅拌后，将混合物转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，在180℃下反应3h。所得沉淀物离心，冷冻干燥，制备得到分级结构的微纳米ha颗粒。
实施例2
聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料的制备，包括以下步骤：
称取50mg实施例1制得的ha颗粒分散于49.5ml的10mm的tris·hcl缓冲液(ph＝8.5)中，同时分别称取30mg多巴胺加入其中，避光置于滚轴混匀器上反应6h。随后将获得的反应液离心洗涤多次，冷冻干燥，得到聚多巴胺表面功能化的分级结构的微纳米羟基磷灰石复合微球。
实施例3
聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料的制备，包括以下步骤：
称取50mg实施例1制得的ha颗粒分散于49.5ml的10mm的tris·hcl缓冲液(ph＝8.5)中，同时分别称取40mg多巴胺加入其中，避光置于滚轴混匀器上反应6h。随后将获得的反应液离心洗涤多次，冷冻干燥，得到聚多巴胺表面功能化的分级结构的微纳米羟基磷灰石复合微球。
实施例4
聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料的制备，包括以下步骤：
称取50mg实施例1制得的ha颗粒分散于49.5ml的10mm的tris·hcl缓冲液(ph＝8.5)中，同时分别称取50mg多巴胺加入其中，避光置于滚轴混匀器上反应6h。随后将获得的反应液离心洗涤多次，冷冻干燥，得到聚多巴胺表面功能化的分级结构的微纳米羟基磷灰石复合微球。
实施例5
负载hhc36的聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料的制备，包括以下步骤：
称取5mg实施例3制得的聚多巴胺功能化的ha颗粒，向其中加入5ml浓度为1mm的抗菌肽hhc36溶液，置于37℃摇床孵育过夜，离心去上清液，冷冻干燥，得到负载hhc36的复合微纳米颗粒。
实施例6
采用场发射扫描电镜观察实施例1-2和实施例4中复合微纳米颗粒的形貌特征如图1所示。
其中，a为实施例1的羟基磷灰石与多巴胺投料比为1:0时复合微球的形貌；b为实施例2的羟基磷灰石与多巴胺投料比为1:0.6时复合微球的形貌；c为实施例4的羟基磷灰石与多巴胺投料比为1:1.0时复合微球的形貌。
结果表明，所制备的羟基磷灰石微纳米颗粒具有大量的介孔结构(图1a)；当ha颗粒与多巴胺的质量比为1:0.6时，多巴胺分子在ha颗粒表面的组装主要呈现出二维涂层的形式(图1b)；随着多巴胺比例的提高，其ha颗粒的表面上自组装的呈现涂层和纳米颗粒双重形式(图1c)。
实施例7
采用n2吸附-脱附法分析了实施例1和实施例3中复合微纳米颗粒的比表面积和孔径分布。
结果表明，如图2所示，ha粉体的比表面积为120.2m2/g，聚多巴胺表面功能化的ha复合微球的比表面积为88.2m2/g。深入分析发现，ha颗粒较大的比表面积主要归因于其在3-5nm范围内的介孔结构，而聚多巴胺表面功能化的ha复合微球中大部分介孔分布在3-10nm(图3)。
实施例8
利用光热成像仪对实施例2中的聚多巴胺表面功能化的复合材料的热效应进行了评价。
图4为实施例2制得的聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料0.5mg/ml和1mg/ml的光热效应评价曲线。
结果表明，当颗粒浓度为0.5mg/ml时，不同功能化涂层的复合微球在808nm红外光作用下的温度均可以达到50℃，这为复合材料提供了有效的热效应。
实施例9
通过平板计数法对实施例5中的复合微纳米颗粒对金黄色葡萄球菌的抗菌性能进行了评价。
图5为实施例5制得的复合微纳米颗粒对金黄色葡萄球菌的抗菌性能评价图，左为对照组，右为复合微纳米颗粒处理组。
结果表明，复合微纳米颗粒作用2h后，琼脂板上几乎没有菌落形成，表明复合微球具有快速且高效的抗菌活性。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
1.一种负载hhc36的聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将磷酸氢二铵固体加入水中，溶解，将溶液ph值调至5.8-6.2，得到溶液1；将硝酸钙固体加入到溶液1中溶解，并将其ph值调至4.6-5.2，得到溶液2；将柠檬酸钠加入到溶液2中溶解，进行反应，离心去上清液、冷冻干燥，得到羟基磷灰石复合材料；
(2)将步骤(1)所述的羟基磷灰石复合材料超声分散于tris·hcl缓冲液中，加入多巴胺溶解得混合液，避光搅拌，离心，洗涤，干燥，得到聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料；
(3)将步骤(2)所述聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料与抗菌肽hhc36加入到水中搅拌得混合液，孵育后离心，冷冻干燥，得到负载hhc36的聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述溶液1中磷酸氢二铵的浓度为1-30mm，所述硝酸钙与溶液1的摩尔体积比为1-90:1mmol/l；所述硝酸钙与柠檬酸钠的摩尔比为5-8:1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述反应的温度为150-200℃，反应的时间为1-12h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述混合液中，tris·hcl的浓度为1-50mm；所述tris·hcl缓冲液的ph为7.2-9.0。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述避光搅拌的时间为0.1-24h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述混合液中，羟基磷灰石复合材料的浓度为0.1-20mg/ml；所述多巴胺与羟基磷灰石粉复合材料的质量比为0.1-1.5:1。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述混合液中，聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料的浓度为0.1-40mg/ml。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料与抗菌肽hhc36的质量比为1:0.1-5；所述孵育的时间为1-24h。
9.一种由权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的负载hhc36的聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料。
10.权利要求9所述的一种负载hhc36的聚多巴胺功能化的羟基磷灰石复合材料在制备感染性骨缺损药物中的应用。
技术总结