本发明属于生物医药技术领域，涉及红细胞团簇制备方法的优化，具体涉及一种具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法。
背景技术：
已公开的两篇专利cn111826349a、cn111826351a均使用了红细胞团簇材料用于外周血中的循环肿瘤细胞(ctcs)的特异性捕获及富集。基于叶酸(或抗体)修饰的红细胞膜蛋白与表面修饰微球之间存在分子间作用力的原理，红细胞可吸附在表面修饰微球上；而由于红细胞表面所带的负电荷导致其互相之间存在静电斥力，这可能造成红细胞难以在微球表面形成满满表层吸附状态，通过预先红细胞表面静电吸附阳离子型聚合物聚凝胺分子，即可大大减弱红细胞之间的静电斥力，从而实现微球表面红细胞满层吸附。微球表面紧密吸附叶酸(或抗体)修饰的红细胞后所形成的红细胞团簇在靶向ctcs的同时，可以很好地避免与白细胞发生非特异性吸附，从而使得最终捕获得到高纯度的ctcs。
事实上，即使叶酸(或抗体)修饰的红细胞预先用聚凝胺吸附以降低红细胞之间的排斥力，也存在一定可能无法得到表面红细胞覆盖较紧密的红细胞团簇，也就是说现有的红细胞团簇制备技术无法稳定可控制备获得理想的红细胞团簇，制备技术亟待进一步优化和改进。
技术实现要素：
本发明的目的在于解决现有红细胞团簇制备技术中存在的问题，提供一种具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法。红细胞团簇的理想形貌指的是核心微球表面被尽量多的红细胞所吸附覆盖，形成的红细胞团簇所暴露的核心微球表面十分分散，吸附态红细胞之间距离足够近，均不利于白细胞在核心微球表面的非特异性吸附；而游离态ctcs则可以通过与红细胞表面通过抗原抗体特异性结合来实现被捕获。
本发明首先对红细胞团簇形成的原理进行了分析。根据前人的研究成果，核心微球表面的羧基或者氨基可与蛋白分子形成氢键作用力，从而对蛋白发生吸附。而红细胞膜表面分布有膜蛋白分子，因此核心微球通过吸附红细胞膜表面的膜蛋白实现了对红细胞的吸附。对于不太新鲜的红细胞样本来说，膜表面蛋白含量可能发生衰减，从而不利于核心微球对衰老红细胞的吸附，因此分析不新鲜的血液样本提取出的红细胞无法制备得到完善的红细胞团簇。鉴于此，每次都使用新鲜血液提取的红细胞来制备红细胞团簇，很多情况下确实能够获得较理想的红细胞团簇，但仍然存在失败的情况，由此说明了红细胞新鲜度并不是最关键的影响因素。
多次实验后发现，按照现有的红细胞团簇制备方法，即使不新鲜的红细胞也存在可能制备得到相对理想的红细胞团簇。不考虑红细胞新鲜度的情况下，每次加入了dspe-peg-fa修饰后得到的红细胞形貌存在少量的不同，部分实验得到的是光滑圆润的球形红细胞，而部分实验则得到的是表面带有尖刺的球形红细胞，同时由前者制备得到的红细胞团簇大多不够理想，而后者则大多都为理想的红细胞团簇，由此说明了红细胞修饰了dspe-peg-fa后的形貌对最终制备得到的红细胞团簇的理想程度存在相关性。
红细胞表面叶酸的修饰是通过dspe-peg-x类型分子的dspe段在细胞膜中的疏水作用力来实现的，原理如图1所示。而修饰到的dspe-peg-fa中的peg链段互相之间存在一定的空间位阻，那么当dspe-peg-fa修饰量较大时，peg链段之间的空间排斥即导致了红细胞外形的改变，由原本的圆盘状转变成球形。由此联想到，如果dspe-peg-fa的修饰量较小，那么对红细胞形貌的改变程度应该较小，因此本发明首先探究了红细胞表面dspe-peg-x的修饰量对其形貌的影响。研究中发现，当红细胞膜表面dspe-peg-x修饰量不大时，dspe-peg-x分子之间互相产生的空间位阻较小，仅对红细胞的表面产生凸起形变；而当红细胞表面dspe-peg-x的修饰量较大时，peg链段之间存在较大的空间位阻，会导致红细胞形状转化带尖刺的球形；当dspe-peg-x的修饰量进一步增大，尖刺变得更小，红细胞整体形状变得更圆润，如图2所示。进一步的实验发现，dspe-peg-x修饰量较小的红细胞的形变能力较好，而修饰量较大的圆球形的棘形红细胞则形变能力较差，如图3所示。
在红细胞团簇制备过程中，需要通过吹悬的方式将红细胞团簇与多余的红细胞分开，从而将多余的红细胞分离出去，获得纯粹的红细胞团簇。对于形变能力较好的红细胞来说，其与表面修饰微球贴近时，红细胞通过发生形变的方式与微球形成较大面积的接触，由此产生的吸附力较大，吹悬操作的冲击力很难导致红细胞从微球表面脱离，因而最终可获得的表面紧密吸附红细胞层的红细胞团簇。然而，对于形变能力较差的红细胞来说，其刚性也相对较大，那么其与表面修饰微球贴近时，难以通过红细胞的形变而发生较大面积的接触，因而二者之间的吸附作用力相对较弱，吹悬操作所产生的冲击力容易引发吸附的红细胞从红细胞团簇表面剥落的后果，进而导致最终难以获得表面紧密吸附红细胞层的红细胞团簇。
从现有实验结果来看，过多的dspe-peg-x修饰会导致红细胞刚性太强，进而导致微球表面吸附量发生减少。图4表示了五种形貌的红细胞与相同量微球制备团簇的结果，从图中可以看出，随着红细胞形貌的变化，制备得到红细胞团簇的红色发生了规律性变化，红色深浅代表着红细胞吸附量的区别，颜色越深的样本红细胞吸附量越大。从左至右，样本1的dspe-peg-x的修饰量最大，所对应的红细胞越接近球形，刚性也就越大，其所制备的红细胞团簇上红细胞吸附量最少，因而红细胞团簇表观颜色最浅。随着dspe-peg-x的修饰量逐渐降低，样本2和3的红细胞团簇表观颜色逐渐加深，说明随着dspe-peg-x的修饰量降低，红细胞形变能力也越强，使得红细胞团簇的红细胞吸附量逐渐增加。随着dspe-peg-x的修饰量进一步降低，样本3和4的表观颜色差别不大，说明即使dspe-peg-x的修饰量进一步降低，而红细胞形变能力也变化不大，最终红细胞团簇所吸附的红细胞量也变化不大。样本5是用无dspe-peg-x分子修饰的原始红细胞制备的红细胞团簇，这种红细胞表面仅仅修饰了聚凝胺，不修饰dspe-peg-x分子的原始红细胞形变能力最强，因而同样能够获得理想的红细胞团簇，其表观颜色与样本3和样本4都差别不大。
从以上探索实验的结果可总结出，制备理想团簇的关键在于利用合适的表面修饰方法使红细胞保持足够的形变能力。具体对于表面修饰dspe-peg-x分子的红细胞来说，需要能够控制该分子在红细胞表面修饰量在合理的范围内，才能最终获得理想的红细胞团簇。
基于上述内容，本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法，为通过控制红细胞表面dspe-peg-x分子的修饰量，实现红细胞形貌的可控调节，从而可控制备得到具有足够形变能力的红细胞，以这种红细胞为基础可制备得到具有理想形貌的红细胞团簇。红细胞团簇的制备方法可参考中国专利cn111826349a(一种基于尺寸过滤法富集循环肿瘤细胞的红细胞团簇)、cn111826351a(一种基于磁性分离法富集循环肿瘤细胞的磁性红细胞团簇)。所述的制备方法中，红细胞与dspe-peg-x的用量关系优选为5×107个红细胞:0.04mg以下的dspe-peg-x。
进一步地，所述的具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照下述方法a或b在红细胞表面修饰上叶酸或rgd或肿瘤细胞靶向的抗体
a、红细胞表面修饰上叶酸或rgd：往红细胞分散液中加入dspe-peg-fa或dspe-peg-rgd，孵育后，离心、洗涤获得表面修饰叶酸或rgd的红细胞。其中，红细胞与dspe-peg-fa或dspe-peg-rgd的用量比例关系为每5×107个红细胞加入0.04mg以下的dspe-peg-fa或dspe-peg-rgd。
b、红细胞表面修饰上抗体：往红细胞分散液中加入dspe-peg-biotin，孵育后，离心、洗涤获得biotin修饰的红细胞；将biotin修饰的红细胞加到sa(链霉亲和素)溶液中混匀，孵育后，离心洗涤获得sa修饰的红细胞；将sa修饰的红细胞加到生物素化抗体溶液中混匀，孵育后，离心洗涤获得修饰抗体的红细胞。其中，红细胞、dspe-peg-biotin、sa、生物素化抗体的用量比例关系为5×107个红细胞:0.04mg以下的dspe-peg-biotin:10～100μg的sa:0.5～5μg的生物素化抗体。
(2)红细胞表面聚凝胺的修饰
将步骤(1)表面修饰上叶酸、rgd或抗体的红细胞加到聚凝胺溶液中混匀，孵育后，离心洗涤获得表面修饰聚凝胺与叶酸、rgd或抗体的红细胞，将其用pbs分散备用。其中，表面修饰上叶酸、rgd或抗体的红细胞中的红细胞与聚凝胺的用量比例关系5×107个红细胞:1～5mg的聚凝胺。
(3)红细胞团簇的制备
将表面修饰羧基或氨基的磁性微球与步骤(2)得到的红细胞混合均匀后，离心使得红细胞与微球离心至离心管底部以保证二者之间相互贴近，再进行孵育，最后将混合物重悬用磁力架对其进行磁性分离洗涤，将过量的游离红细胞洗涤去除，最后获得磁性红细胞团簇，即具有理想形貌的红细胞团簇。
进一步地，步骤(1)的方法a中，所述的红细胞分散液为用pbs溶液分散红细胞得到；往红细胞分散液中加入dspe-peg-fa或dspe-peg-rgd为加入含dspe-peg-fa或dspe-peg-rgd的pbs溶液；所述的dspe-peg-fa或dspe-peg-rgd的分子量为2000～10000；所述的孵育为4～37℃下静置孵育0.5～30min。
更进一步地，步骤(1)的方法a为：根据红细胞分散液的红细胞含量，每定量取出5×107个红细胞，定量加入含有0～0.04mg分子量为2000～10000的dspe-peg-fa或dspe-peg-rgd的pbs溶液，在4℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次获得表面修饰叶酸或者rgd的红细胞。
进一步地，步骤(1)的方法b中，所述的红细胞分散液为用pbs溶液分散红细胞得到；往红细胞分散液中加入dspe-peg-biotin为加入含dspe-peg-biotin的pbs溶液；所述的dspe-peg-biotin的分子量为2000～10000；所述的sa溶液为sa的pbs溶液，生物素化抗体溶液为生物素化抗体的pbs溶液；第一次孵育为4～37℃下静置孵育0.5～30min；第二、三次孵育为4～37℃下静置孵育30min～2h。
更进一步地，步骤(1)的方法b为：根据红细胞分散液的红细胞含量，每定量取出5×107个红细胞，定量加入含有0～0.04mg分子量为2000～10000的dspe-peg-biotin的pbs溶液，4℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次即获得biotin修饰的红细胞；将biotin修饰的红细胞与50～1000μl浓度为100μg/ml的sa溶液混合均匀，37℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次即获得sa修饰的红细胞；最后将sa修饰的红细胞与100μl～1000μl浓度为5μg/ml的生物素化抗体溶液混合均匀，37℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次获得表面修饰肿瘤细胞靶向抗体的红细胞。
进一步地，步骤(2)中，所述的聚凝胺溶液为聚凝胺的pbs溶液；分散红细胞所用溶液为pbs；所述的孵育为4～37℃下静置孵育0.5～30min。
更进一步地，步骤(2)为：将步骤(1)按5×107个红细胞的用量得到的表面修饰上叶酸、rgd或抗体的红细胞与50～500μl的浓度为10mg/ml的聚凝胺pbs溶液混合，在4℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次获得表面修饰聚凝胺与fa、rgd或抗体的红细胞，将其分散至pbs溶液中备用。
进一步地，步骤(3)中，红细胞数量为磁性微球数量的50～500倍，离心的条件为200～600g离心1～10min；孵育为4～37℃下静置孵育0.5～30min。
更进一步地，步骤(3)为：将表面修饰羧基或氨基的磁性微球用pbs洗涤三遍，再加入100倍以上微球个数的步骤(2)得到的红细胞，二者混合均匀后在离心机内以400g的离心速度离心1min，使得红细胞与微球离心至离心管底部以保证二者之间相互贴近，离心后将其置于4℃下静置孵育30min，最后将离心管底部的混合物吹悬后，用磁力架对其进行磁性分离洗涤，将过量的游离红细胞洗涤去除，获得磁性红细胞团簇，即具有理想形貌的红细胞团簇。
红细胞团簇的仿生材料已被用于外周血中的ctcs的特异性捕获与富集，其表面红细胞包裹的致密度决定了最终富集得到的ctcs的纯度。现有技术存在不稳定因素，难以保证每次制备得到表面致密吸附红细胞的红细胞团簇。本发明提供了可稳定制备理想型红细胞团簇的技术方案，所获得理想型红细胞团簇通过其表面修饰物可高特异性识别捕获肿瘤细胞，而团簇表面所包裹的大量红细胞又可以避免其他无关细胞的非特异性吸附，因此可对目标肿瘤细胞进行高效高特异性地富集。
附图说明
图1是红细胞表面修饰dspe-peg-fa的原理图。
图2是红细胞表面dspe-peg-x修饰量对红细胞形貌的影响图。
图3是红细胞表面不同dspe-peg-x修饰量对形变能力的影响对比图，其中，图3(a)所示红细胞对应于图2(a)的红细胞，图3(b)所示红细胞对应于图2(e)的红细胞。
图4是不同形貌的红细胞制备得到的红细胞团簇溶液的颜色图，样本1-5中的红细胞团簇分别为对比例2、对比例1、实施例3、实施例2、实施例1制备的红细胞团簇。
图5是图2(a)中不修饰dspe-peg-x分子的原始红细胞制备的红细胞团簇的明场图。
图6是图2(b)中修饰了dspe-peg-fa分子的原始红细胞制备的红细胞团簇的明场图。
图7是图2(c)中修饰了dspe-peg-biotin分子的原始红细胞制备的红细胞团簇的明场图。
图8是图2(d)中修饰了dspe-peg-fa分子的原始红细胞制备的红细胞团簇的明场图。
图9是图2(e)中修饰了dspe-peg-rgd分子的原始红细胞制备的红细胞团簇的明场图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
【实施例1】图2(a)中不修饰dspe-peg-x分子的原始红细胞制备的红细胞团簇
用percoll分离液分离全血获得纯红细胞，然后用pbs溶液将红细胞洗涤三遍，并用pbs溶液分散红细胞，通过细胞计数板对红细胞分散液中红细胞含量进行计数。不修饰dspe-peg-x的原始红细胞形貌如图2(a)所示。
聚凝胺修饰：根据红细胞分散液的红细胞含量，定量取出0.5×108个红细胞加入100μl的浓度为10mg/ml的聚凝胺pbs溶液，在4℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次即获得表面修饰聚凝胺的红细胞，将其分散至pbs溶液中备用。
红细胞团簇的制备：将表面修饰羧基的磁性微球(天津市倍思乐色谱技术开发中心，磁性聚苯乙烯微球，粒径5～6μm)用pbs洗涤三遍，再加入100倍微球计数个数的修饰红细胞，二者混合均匀后在离心机内以400g的离心速度离心1min，使得红细胞与微球离心至离心管底部以保证二者之间相互贴近，离心后将其置于4℃下静置孵育30min，最后将离心管底部的混合物吹悬后，用磁力架对其进行磁性分离洗涤，将过量的游离红细胞洗涤去除，最后获得磁性红细胞团簇。
红细胞团簇明场照片如图5所示。从图中可以看出，图2(a)中的红细胞制备的红细胞团簇比较理想。从红细胞团簇的光学显微镜照片来看，绝大部分的红细胞团簇的表面被满满覆盖了一层红细胞，团簇核心微球所暴露的表面太分散，因而不利于白细胞被核心微球所非特异性吸附，表面紧密的红细胞层堆积有利于红细胞团簇对白细胞的排斥效果，进而可实现高纯度的ctcs捕获。
【实施例2】图2(b)中修饰了dspe-peg-fa分子的原始红细胞制备的红细胞团簇
用percoll分离液分离全血获得纯红细胞，然后用pbs溶液将红细胞洗涤三遍，并用pbs溶液分散红细胞，通过细胞计数板对红细胞分散液中红细胞含量进行计数。
叶酸修饰：根据红细胞分散液的红细胞含量，定量取出2×108个红细胞，定量加入含有0.02mg分子量为5000的dspe-peg-fa的pbs溶液，在4℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次即可获得叶酸修饰的红细胞，其形貌如图2(b)所示。
聚凝胺修饰：将修饰上叶酸的红细胞与300μl的浓度为10mg/ml的聚凝胺pbs溶液混合，在4℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次即获得表面修饰聚凝胺与叶酸的红细胞，将其分散至pbs溶液中备用。
红细胞团簇的制备：将表面修饰羧基的磁性微球用pbs洗涤三遍，再加入100倍微球计数个数的修饰红细胞，二者混合均匀后在离心机内以400g的离心速度离心1min，使得红细胞与微球离心至离心管底部以保证二者之间相互贴近，离心后将其置于4℃下静置孵育30min，最后将离心管底部的混合物吹悬后，用磁力架对其进行磁性分离洗涤，将过量的游离红细胞洗涤去除，最后获得磁性红细胞团簇。
红细胞团簇明场照片如图6所示。从图中可以看出，图2(b)中的红细胞制备的红细胞团簇比较理想。从红细胞团簇的光学显微镜照片来看，绝大部分的红细胞团簇的表面被满满覆盖了一层红细胞，团簇核心微球所暴露的表面太分散，因而不利于白细胞被核心微球所非特异性吸附，表面紧密的红细胞层堆积有利于红细胞团簇对白细胞的排斥效果，进而可实现高纯度的ctcs捕获。
【实施例3】图2(c)中修饰了dspe-peg-biotin分子的原始红细胞制备的红细胞团簇
用percoll分离液分离全血获得纯红细胞，然后用pbs溶液将红细胞洗涤三遍，并用pbs溶液分散红细胞，通过细胞计数板对红细胞分散液中红细胞含量进行计数。
epcam抗体修饰：根据红细胞分散液的红细胞含量，定量取出1.5×108个红细胞，定量加入含有0.12mg分子量为10000的dspe-peg-biotin的pbs溶液，4℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次即获得表面修饰biotin的红细胞；将biotin修饰的红细胞与200μl浓度为100μg/ml的sa溶液混合均匀，37℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次即获得表面修饰sa的红细胞；最后将sa修饰的红细胞与500μl浓度为5μg/ml的生物素化的epcam抗体溶液混合均匀，37℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次即获得表面修饰epcam抗体的红细胞，其形貌如图2(c)所示。
聚凝胺修饰：将修饰上epcam抗体的红细胞与200μl的浓度为10mg/ml的聚凝胺pbs溶液混合，在4℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次即获得表面修饰聚凝胺与epcam抗体的红细胞，将其分散至pbs溶液中备用。
红细胞团簇的制备：将表面修饰羧基的磁性微球用pbs洗涤三遍，再加入100倍微球计数个数的修饰红细胞，二者混合均匀后在离心机内以400g的离心速度离心1min，使得红细胞与微球离心至离心管底部以保证二者之间相互贴近，离心后将其置于4℃下静置孵育30min，最后将离心管底部的混合物吹悬后，用磁力架对其进行磁性分离洗涤，将过量的游离红细胞洗涤去除，最后获得磁性红细胞团簇。
红细胞团簇明场照片如图7所示。从图中可以看出，图2(c)中的红细胞制备的红细胞团簇比较理想。从红细胞团簇的光学显微镜照片来看，绝大部分的红细胞团簇的表面被满满覆盖了一层红细胞，团簇核心微球所暴露的表面太分散，因而不利于白细胞被核心微球所非特异性吸附，表面紧密的红细胞层堆积有利于红细胞团簇对白细胞的排斥效果，进而可实现高纯度的ctcs捕获。
【对比例1】图2(d)中的修饰了dspe-peg-fa的红细胞制备的红细胞团簇
用percoll分离液分离全血获得纯红细胞，然后用pbs溶液将红细胞洗涤三遍，并用pbs溶液分散红细胞，通过细胞计数板对红细胞分散液中红细胞含量进行计数。
叶酸修饰：根据红细胞分散液的红细胞含量，定量取出1×108个红细胞，定量加入含有0.4mg分子量为2000的dspe-peg-fa的pbs溶液，在4℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次即可获得叶酸修饰的红细胞，其形貌如图2(d)所示。
聚凝胺修饰：将修饰上叶酸的红细胞与200μl的浓度为10mg/ml的聚凝胺pbs溶液混合，在4℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次即获得表面修饰聚凝胺与叶酸的红细胞，将其分散至pbs溶液中备用。
红细胞团簇的制备：将表面修饰羧基的磁性微球用pbs洗涤三遍，再加入100倍微球计数个数的修饰红细胞，二者混合均匀后在离心机内以400g的离心速度离心1min，使得红细胞与微球离心至离心管底部以保证二者之间相互贴近，离心后将其置于4℃下静置孵育30min，最后将离心管底部的混合物吹悬后，用磁力架对其进行磁性分离洗涤，将过量的游离红细胞洗涤去除，最后获得磁性红细胞团簇。
红细胞团簇明场照片如图8所示。从图中可以看出，图2(d)中的红细胞制备的红细胞团簇很不理想，存在较多的缺陷。从红细胞团簇的光学显微镜照片来看，较大部分的红细胞团簇的表面存在明显缺口，即团簇核心微球所的部分表面上未吸附修饰红细胞，暴露的核心微球表面对于白细胞会发生明显的非特异性吸附的效果，这对于ctcs捕获后的纯度存在极大的不利影响。
【对比例2】图2(e)中的修饰了dspe-peg-rgd的红细胞制备的红细胞团簇
用percoll分离液分离全血获得纯红细胞，然后用pbs溶液将红细胞洗涤三遍，并用pbs溶液分散红细胞，通过细胞计数板对红细胞分散液中红细胞含量进行计数。
rgd修饰：根据红细胞分散液的红细胞含量，定量取出1×108个红细胞，定量加入含有0.4mg分子量为2000的dspe-peg-rgd的pbs溶液，在4℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次即可获得叶酸修饰的红细胞，其形貌如图2(e)所示。
聚凝胺修饰：将修饰上rgd的红细胞与200μl的浓度为10mg/ml的聚凝胺pbs溶液混合，在4℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次即获得表面修饰聚凝胺与rgd的红细胞，将其分散至pbs溶液中备用。
红细胞团簇的制备：将表面修饰羧基的磁性微球用pbs洗涤三遍，再加入100倍以上微球计数个数的修饰红细胞，二者混合均匀后在离心机内以400g的离心速度离心1min，使得红细胞与微球离心至离心管底部以保证二者之间相互贴近，离心后将其置于4℃下静置孵育30min，最后将离心管底部的混合物吹悬后，用磁力架对其进行磁性分离洗涤，将过量的游离红细胞洗涤去除，最后获得磁性红细胞团簇。
红细胞团簇明场照片如图9所示。从图中可以看出，图2(e)中的红细胞制备的红细胞团簇很不理想，存在较多的缺陷。从红细胞团簇的光学显微镜照片来看，较大部分的红细胞团簇的表面存在明显缺口，即团簇核心微球所的部分表面上未吸附修饰红细胞，暴露的核心微球表面对于白细胞会发生明显的非特异性吸附的效果，这对于ctcs捕获后的纯度存在极大的不利影响。
上述所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
1.一种具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法，其特征在于：所述的制备方法为通过控制红细胞表面dspe-peg-x分子的修饰量，实现红细胞形貌的可控调节，从而可控制备得到具有足够形变能力的红细胞，以这种红细胞为基础可制备得到具有理想形貌的红细胞团簇；其中，x代表叶酸、rgd或biotin；红细胞与dspe-peg-x的用量关系为5×107个红细胞:0.04mg以下的dspe-peg-x。
2.一种具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)按照下述方法a或b在红细胞表面修饰上叶酸或rgd或肿瘤细胞靶向的抗体
a、红细胞表面修饰上叶酸或rgd：往红细胞分散液中加入dspe-peg-fa或dspe-peg-rgd，孵育后，离心、洗涤获得表面修饰叶酸或rgd的红细胞；其中，红细胞与dspe-peg-fa或dspe-peg-rgd的用量比例关系为每5×107个红细胞加入0.04mg以下的dspe-peg-fa或dspe-peg-rgd；
b、红细胞表面修饰上抗体：往红细胞分散液中加入dspe-peg-biotin，孵育后，离心、洗涤获得biotin修饰的红细胞；将biotin修饰的红细胞加到sa溶液中混匀，孵育后，离心洗涤获得sa修饰的红细胞；将sa修饰的红细胞加到生物素化抗体溶液中混匀，孵育后，离心洗涤获得修饰抗体的红细胞；其中，红细胞、dspe-peg-biotin、sa、生物素化抗体的用量比例关系为5×107个红细胞:0.04mg以下的dspe-peg-biotin:10～100μg的sa:0.5～5μg的生物素化抗体；
(2)红细胞表面聚凝胺的修饰
将步骤(1)表面修饰上叶酸、rgd或抗体的红细胞加到聚凝胺溶液中混匀，孵育后，离心洗涤获得表面修饰聚凝胺与叶酸、rgd或抗体的红细胞，将分散备用；其中，表面修饰上叶酸、rgd或抗体的红细胞中的红细胞与聚凝胺的用量比例关系5×107个红细胞:1～5mg的聚凝胺；
(3)红细胞团簇的制备
将表面修饰羧基或氨基的磁性微球与步骤(2)得到的红细胞混合均匀后，离心后进行孵育，再将混合物重悬用磁力架对其进行磁性分离洗涤，得到具有理想形貌的红细胞团簇。
3.根据权利要求2所述的具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法，其特征在于：步骤(1)的方法a中，所述的dspe-peg-fa或dspe-peg-rgd的分子量为2000～10000，所述的孵育为4～37℃下静置孵育0.5～30min。
4.根据权利要求2所述的具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法，其特征在于：步骤(1)的方法a为：根据红细胞分散液的红细胞含量，每定量取出5×107个红细胞，定量加入含有0～0.04mg分子量为2000～10000的dspe-peg-fa或dspe-peg-rgd的pbs溶液，在4℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次获得表面修饰叶酸或者rgd的红细胞。
5.根据权利要求2所述的具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法，其特征在于：步骤(1)的方法b中，所述的dspe-peg-biotin的分子量为2000～10000，第一次孵育为4～37℃下静置孵育0.5～30min，第二、三次孵育为4～37℃下静置孵育30min～2h。
6.根据权利要求2所述的具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法，其特征在于：步骤(1)的方法b为：根据红细胞分散液的红细胞含量，每定量取出5×107个红细胞，定量加入含有0～0.04mg分子量为2000～10000的dspe-peg-biotin的pbs溶液，4℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次即获得biotin修饰的红细胞；将biotin修饰的红细胞与50～1000μl浓度为100μg/ml的sa溶液混合均匀，37℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次即获得sa修饰的红细胞；最后将sa修饰的红细胞与100μl～1000μl浓度为5μg/ml的生物素化抗体溶液混合均匀，37℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次获得表面修饰肿瘤细胞靶向抗体的红细胞。
7.根据权利要求2所述的具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的孵育为4～37℃下静置孵育0.5～30min。
8.根据权利要求2所述的具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法，其特征在于：步骤(2)为：将步骤(1)按5×107个红细胞的用量得到的表面修饰上叶酸、rgd或抗体的红细胞与50～500μl的浓度为10mg/ml的聚凝胺pbs溶液混合，在4℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次获得表面修饰聚凝胺与fa、rgd或抗体的红细胞，将其分散至pbs溶液中备用。
9.根据权利要求2所述的具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，红细胞数量为磁性微球数量的50～500倍，离心的条件为200～600g离心1～10min，孵育为4～37℃下静置孵育0.5～30min。
10.根据权利要求2所述的具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法，其特征在于：步骤(3)为：将表面修饰羧基或氨基的磁性微球用pbs洗涤三遍，再加入100倍以上微球个数的步骤(2)得到的红细胞，二者混合均匀后在离心机内以400g的离心速度离心1min，离心后将其置于4℃下静置孵育30min，最后将离心管底部的混合物吹悬后，用磁力架对其进行磁性分离洗涤，获得具有理想形貌的红细胞团簇。
技术总结