本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及一种骨髓间充质干细胞的培养基及培养方法。
背景技术：
骨髓(bonemarrow)存在于骨松质腔隙和长骨骨髓腔内，由多种类型的细胞和网状结缔组织构成，根据其结构不同分为红骨髓(redbonemar-row)和黄骨髓(yellowbonemarrow)。红骨髓是人体的造血器官，分布于骨髓腔内，它主要是由血窦和造血组织构成。初生时期，骨内充满的全部是红骨髓，具有活跃的造血功能。成年后，红骨髓主要存在于一些扁骨、不规则骨和长骨的骨骺内，以椎骨、胸骨和髂骨处最为丰富，造血功能也最为活跃。
除造血功能之外，红骨髓还有防御、免疫和创伤修复等多种功能。其创伤修复功能主要缘于其中的骨髓间充质干细胞(bmsc)，它们保留着向成纤维细胞、成骨细胞分化的潜能。一些学者利用红骨髓培养的骨髓间充质干细胞植入骨折及骨缺损处，证实它们可促进骨组织形成，有利于骨折的愈合和缺损的修复。
骨髓间充质干细胞(bmsc)，是一类起源于中胚层的成体干细胞，具有自我更新及多向分化潜能,可分化为多种间质组织,如骨骼、软骨、脂肪、骨髓造血组织等，是一种理想的间充质干细胞(mcscnchymalstemcells,msc)临床研究及应用的来源。
由于心脑血管疾病和退行性疾病好发于老年人，bmscs自体移植在防治这些与衰老相关疾病方面具有极广阔的应用前景。然而现有的分离培养方法对老年人bmscs的分离培养效果不够理想，获得的细胞纯度和活力较低，影响了bmscs对中老年人疾病的治疗。因此，急需提供一种适用于中老年人bmscs体外培养的培养基及培养方法，以提高bmscs的细胞活力，用于治疗老年患者的心脑血管疾病和退行性疾病等疾病。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种骨髓间充质干细胞的培养基及培养方法。利用该培养基培养获得的骨髓间充质干细胞纯度高、活力好、细胞增殖速度快。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供骨髓间充质干细胞的培养基，包括：elitegro-adv、左旋谷氨酰胺、重组人egf和基础培养基。
elitegro-adv是不含动物血清，非异种细胞培养补充剂，提供丰富的人源生长因子和细胞因子，可作为fbs(胎牛血清)的有效替代品，以支持细胞扩增。
一些实施方案中，本发明培养基包括基础培养基和如下浓度的组分：
elitegro-adv5vol％，左旋谷氨酰胺2mmol/l，重组人egf10ug/l。
一些具体实施例中，本发明培养基包括基础培养基和如下浓度的组分：
elitegro-adv5vol％，左旋谷氨酰胺2mmol/l，重组人egf10ug/l。
一些实施方案中，所述基础培养基为dmem-lg培养基。
本发明还提供一种骨髓间充质干细胞的分离培养方法，包括：
将骨髓单细胞悬液经密度梯度离心，收集含单个核细胞的上清液；
将上清液离心重悬后经免疫磁珠分离，获得骨髓间充质干细胞；
将所述骨髓间充质干细胞接种至本发明所述的培养基中依次进行原代培养和传代培养。
一些实施方案中，所述密度梯度离心为使用percoll分离液900g离心30min；所述percoll分离液的密度为1.073g/ml。本发明中，所述percoll分离液由如下方法制成：将密度为1.13g/ml的percoll原液，用0.9％生理盐水调整至密度1.073g/ml。
本发明中，所述骨髓单细胞悬液和所述percoll分离液的体积比为l：2。
经过密度梯度离心后获得含单个核细胞的上清液，将所述上清液离心重悬后经免疫磁珠分离，获得骨髓间充质干细胞。其中，免疫磁珠分离的抗体为cd45抗体。
本发明中，将分离获得的骨髓间充质干细胞接种至本发明所述的培养基中依次进行原代培养和传代培养。其中，所述接种的密度为1×104/ml。所述原代培养和传代培养为5％co2、37℃恒温培养；所述原代培养和继代培养的过程中每2～5天换液一次。
本发明提供的骨髓间充质干细胞的培养基包括elitegro-adv、左旋谷氨酰胺、重组人egf和基础培养基。利用该培养基分离培养的老年人骨髓间充质干细胞，具有纯度高、活性强等特点，与从年轻人骨髓中获得的骨髓间充质干细胞相比，在免疫表型、细胞倍增时间、细胞活性等方面没有显著差异，与传统培养方法相比，显著提高了细胞增殖速度。
附图说明
图1示本发明骨髓间充质干细胞分离培养方法的流程示意图；
图2示实施例1中p1代骨髓间充质干细胞显微镜下细胞形态；
图3示实施例1中流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞特异性表面抗原的阳性流式图；
图4示实施例1中流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞特异性表面抗原阴性流式图；
图5示实施例1中骨髓间充质干细胞经碘化丙啶(pi)染色后的流式细胞检测结果；
图6示本发明培养基与传统培养基培养的骨髓间充质干细胞生长曲线的比较结果。
具体实施方式
本发明提供了一种骨髓间充质干细胞的培养基及培养方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明提供的具体实施例中，骨髓间充质干细胞的分离培养方法(见图1)包括如下步骤：
①.骨髓的采集：
骨髓的量依患者体重而定，一般收集50～100毫升骨髓液即可。
②.骨髓的密度梯度离心:
骨髓以24号注射针头反复吹打成单细胞悬液，600g离心5min，小心吸去上层悬浮脂肪。
离心管中预置percoll分离液，percoll原液比重1.13g/ml，用0.9％生理盐水调整至密度1.073g/ml。注意将骨髓沿管壁缓慢滴加入percoll液面上，两者(骨髓：percoll)体积为l：2；900g离心30min。
可见离心管中液体分为5层，毛细吸管吸取percoll层上云雾状有核细胞层，加入10mlpbs，600g离心15min，弃上清液获取有核细胞，细胞计数。
③.获得细胞的免疫磁珠分选：
确定细胞数量后，细胞悬液300g离心10min，加入300ulbuffer重悬浮细胞，细胞最多108。加入100ulfcrblocking，100ulcd45microbeads，充分混合，冰箱孵育，30min。加入5-10mlbuffer洗涤细胞，然后离心300g，10min500ulbuffer重悬浮细胞。
将分选柱放置于合适的分选器的磁场中，用500ul的buffer冲洗柱子，将细胞悬液加入柱子，收集通过的未标记细胞。用3×500ul的buffer冲洗柱子，将收集到的未标记细胞合并。
④.筛选得到骨髓间充质干细胞的培养：
骨髓间充质干细胞原代培养
以104/ml密度，用改良的骨髓间充质干细胞培养基接种于t75培养瓶中5％co2、37℃恒温培养，接种后，每天倒置显微镜观察细胞贴壁情况，根据细胞贴壁情况，于接种后2～5天换液。换液后在低倍镜下可清楚地见到多个克隆形成，加入新鲜改良的骨髓间充质干细胞培养基，继续在相同的条件下培养。
骨髓间充质干细胞传代培养
原代细胞达到80％融合(一般需7～14天)进行传代培养。吸去培养液，加入pbs10ml，清洗2遍；吸尽pbs后加入胰酶替代物2m1，37℃放置1min，待细胞变圆形浮起，加入pbs10ml，终止消化。收集细胞到离心管内，1000rpm离心5min，吸去上清液；加入改良的骨髓间充质干细胞培养基，吹打混匀，以1:5的数量传代，接种于新的t75培养瓶中，5％co2、37℃恒温培养。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：
(一)本发明分离培养方法
该分离方法包括骨髓的采集、骨髓的密度梯度离心、细胞的免疫磁珠分选、骨髓间充质干细胞的培养、骨髓间充质干细胞悬液的检测。
(1)合作医院采集一份骨髓，捐献者年龄72周岁，采集量50ml，采集后6小时到达实验室。
(2)骨髓的密度梯度离心：骨髓以24号注射针头反复吹打成单细胞悬液，600g离心5min，小心吸去上层悬浮脂肪。离心管中预置percoll分离液，percoll原液比重1.13g/ml，用0.9％生理盐水调整至密度1.073g/ml。注意将骨髓沿管壁缓慢滴加入percoll液面上，两者(骨髓：percoll)体积为l：2；900g离心30min。可见离心管中液体分为5层，毛细吸管吸取percoll层上云雾状有核细胞层，加入10mlpbs，600g离心15min，弃上清液获取有核细胞，细胞计数为5.3×107。
(3)细胞的免疫磁珠分选：细胞悬液300g离心10min，加入300ulbuffer重悬浮细胞。加入100ulfcrblocking，100ulcd45microbeads，充分混合，冰箱孵育，30min。加入5mlbuffer洗涤细胞，然后离心300g，10min500ulbuffer重悬浮细胞。将分选柱放置于合适的分选器的磁场中，用500ul的buffer冲洗柱子，将细胞悬液加入柱子，收集通过的未标记细胞。用3×500ul的buffer冲洗柱子，将收集到的未标记细胞合并。
(4)骨髓间充质干细胞的培养：骨髓间充质干细胞原代培养，以104/ml密度，用改良的骨髓间充质干细胞培养基接种于t75培养瓶中5％co2、37℃恒温培养，接种后，每天倒置显微镜观察细胞贴壁情况，根据细胞贴壁情况，于接种后第4天换液。原代细胞于第10天达到80％融合，进行传代培养(图2)。吸去培养液，加入pbs10ml，清洗2遍；吸尽pbs后加入胰酶替代物2m1，37℃放置1min，待细胞变圆形浮起，加入pbs10ml，终止消化。收集细胞到离心管内，1000rpm离心5min，吸去上清液；加入改良的骨髓间充质干细胞培养基，吹打混匀，以1:5的数量传代，接种于新的t75培养瓶中，5％co2、37℃恒温培养3～4d。其中，所述改良的骨髓间充质干细胞培养基组成如下：
elitegro-adv5vol％，左旋谷氨酰胺2mmol/l，重组人egf10ug/l；dmem-lg基础培养基补足。
(5)干细胞冻存：将p2代细胞每t75培养瓶用10毫升氯化钠注射液冲洗2遍，胰酶替代物2毫升消化，10毫升氯化钠注射液稀释终止，取所得细胞悬液10微升与0.4％台盼蓝10ul混匀后，用移液器打入血球计数板中，静置1分钟后，显微镜下观察活率并计数；消化所得细胞悬液经过1000rpm离心10分钟后，根据细胞计数结果，每106细胞加入1毫升无血清细胞冻存液，混匀后平均加入冻存管中，每管1.5毫升，共冻存10管。
(二)骨髓间充质干细胞微生物检测
(1)需氧厌氧菌检测：将打入细胞培养液的需氧厌氧菌培养瓶一对的条码扫入血培养仪并且编好号码，然后上入到血培养仪内观察，检测7天，7天后如果结果为阴性即出具细菌检测合格报告，如果检测结果为阳性，则出具阳性报告；
(2)支原体检测：配置两种培养基，支原体肺炎培养基和半流体培养基，将配置好的培养基121.0℃灭菌15分钟，然后进行分装，每份样品接种每种培养基两管，共四管放入36.0℃培养7天，7天以后取每种培养基一管再转种两管，与前面的四管加起来共八管培养21天，每三天观察一次结果；从接种后起28天内如果结果为阴性出具支原体检测阴性报告，如果为阳性则出具支原体阳性检测报告；
(3)骨髓间充质干细胞的流式细胞检测：
cd73检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将cd73的control试剂摇匀，向质控管中加入20微升，再将cd73试剂摇匀，向样品管中加入20微升cd73试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升上述培养方法步骤(4)的传代细胞样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30min，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升pbs，混匀后1500转/min离心5min，后弃去上清，加入240微升的pbs后混匀上机，检测阳性结果≧95％则为合格；
cd90检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将cd90的control试剂摇匀，向质控管中加入20微升，再将cd90试剂摇匀，向样品管中加入10微升cd90试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30min，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升pbs，混匀后1500转/min离心5min，后弃去上清，加入240微升的pbs后混匀上机，检测阳性结果≧95％则为合格；
cd105检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将cd105的control试剂摇匀，向质控管中加入10微升，再将cd105试剂摇匀，向样品管中加入5微升cd105试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30min，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升pbs，混匀后1500转/min离心5min，后弃去上清，加入240微升的pbs后混匀上机，检测阳性结果≧95％则为合格；
cd45检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将cd45的control试剂摇匀，向质控管中加入20微升，再将cd45试剂摇匀，向样品管中加入20微升cd45试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30min，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升pbs，混匀后1500转/min离心5min，后弃去上清，加入240微升的pbs后混匀上机，检测阳性结果≦2％则为合格；
hla-dr检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将hla-dr的control试剂摇匀，向质控管中加入20微升，再将hla-dr试剂摇匀，向样品管中加入20微升hla-dr试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30min，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升pbs，混匀后1500转/min离心5min，后弃去上清，加入240微升的pbs后混匀上机，检测阳性结果≦2％则为合格。
骨髓间充质干细胞悬液的检测:微生物检测均为阴性，流式细胞检测结果如图3、4所示。碘化丙啶(pi)染色后进行流式细胞检测，结果见图5。
(三)结果分析
结果显示，骨髓间充质干细胞的相关标志物均达到99％以上，说明本发明分离培养获得的骨髓间充质干细胞具有较高的纯度，碘化丙啶(pi)染色后的流式细胞检测结果显示，活细胞比例为94.3％，说明本发明分离培养的骨髓间充质干细胞体外培养能够保持较高的活性。
实施例2：
(1)合作医院采集两份骨髓，捐献者年龄为75周岁(1号样本)和28周岁(2号样本)，采集量均为50ml，采集后5小时到达实验室。
(2)骨髓的密度梯度离心：骨髓以24号注射针头反复吹打成单细胞悬液，600g离心5min，小心吸去上层悬浮脂肪。离心管中预置percoll分离液，percoll原液比重1.13g/ml，用0.9％生理盐水调整至密度1.073g/ml。注意将骨髓沿管壁缓慢滴加入percoll液面上，两者(骨髓：percoll)体积为l：2；900g离心30min。可见离心管中液体分为5层，毛细吸管吸取percoll层上云雾状有核细胞层，加入10mlpbs，600g离心15min，弃上清液获取有核细胞，细胞计数1号样本为3.8×107，2号样本为5.2×107
(3)细胞的免疫磁珠分选：细胞悬液300g离心10min，分别加入300ulbuffer重悬浮细胞。分别加入100ulfcrblocking，100ulcd45microbeads，充分混合，冰箱孵育，30min。分别加入5mlbuffer洗涤细胞，然后离心300g，10min500ulbuffer重悬浮细胞。将两个分选柱放置于合适的分选器的磁场中，分别用500ul的buffer冲洗柱子，将细胞悬液加入柱子，收集通过的未标记细胞。分别用3×500ul的buffer冲洗柱子，分别将收集到的未标记细胞合并。
(4)骨髓间充质干细胞的培养：1号骨髓间充质干细胞原代培养，以104/ml密度，用改良的骨髓间充质干细胞培养基接种于t75培养瓶中5％co2、37℃恒温培养，接种后，每天倒置显微镜观察细胞贴壁情况，根据细胞贴壁情况，于接种后第4天换液。原代细胞于第10天达到80％融合，进行传代培养。吸去培养液，加入pbs10ml，清洗2遍；吸尽pbs后加入胰酶替代物2m1，37℃放置1min，待细胞变圆形浮起，加入pbs10ml，终止消化。收集细胞到离心管内，1000rpm离心5min，吸去上清液；加入改良的骨髓间充质干细胞培养基，吹打混匀，以1:5的数量传代，接种于新的t75培养瓶中，5％co2、37℃恒温培养。2号骨髓间充质干细胞原代培养，以104/ml密度，用传统培养基(dmem-lg培养基，含10％胎牛血清)接种于t75培养瓶中5％co2、37℃恒温培养，接种后，每天倒置显微镜观察细胞贴壁情况，根据细胞贴壁情况，于接种后第4天换液。原代细胞于第11天达到80％融合，进行传代培养。吸去培养液，加入pbs10ml，清洗2遍；吸尽pbs后加入胰酶替代物2m1，37℃放置1min，待细胞变圆形浮起，加入pbs10ml，终止消化。收集细胞到离心管内，1000rpm离心5min，吸去上清液；加入传统培养基，吹打混匀，以1:5的数量传代，接种于新的t75培养瓶中，5％co2、37℃恒温培养。
其中，改良的骨髓间充质干细胞培养基组成如下：
elitegro-adv5vol％，左旋谷氨酰胺2mmol/l，重组人egf10ug/l；dmem-lg基础培养基补足。
对比例1步骤(4)采用传统培养基进行培养、传代，其他步骤与实施例2相同。其中传统培养基为含10％volfbsdedmem-lg。
骨髓间充质干细胞生长曲线测定：两组细胞分别取p1、p5代对数生长期细胞，用胰酶替代物消化收集，调整单细胞悬液密度为5×103个/ml，按1ml/孔(5×103个细胞)接种于12孔培养板内，每组细胞接种30个孔，各孔的接种密度一致置。37℃、5％co2气相和饱和湿度的co2培养箱中培养，用pbs配制5mg/ml的mtt溶液，0.22微膜过滤除菌，4度保存。从第24h开始，每隔24h随机取3个孔，每孔加入200μl5mg/mlmtt液，继续培养4h后，吸出孔内培养液；向每孔加入0.5mldmso。将培养板置于微孔板振荡器上振荡10min，使结晶物溶解。酶联免疫检测仪检测各孔od值，检测波长570nm,以时间为横坐标，平均od值为纵坐标，记录并绘制细胞生长曲线(图6)。
结果显示，相比传统培养基培养，本发明改良后的骨髓间充质干细胞培养基所培养的骨髓间充质干细胞，无论在p1代还是p5代，细胞增殖能力均明显提高。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.一种骨髓间充质干细胞的培养基，其特征在于，包括：elitegro-adv、左旋谷氨酰胺、重组人egf和基础培养基。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，包括基础培养基和如下浓度的组分：
elitegro-adv5vol％，左旋谷氨酰胺2mmol/l，重组人egf10ug/l。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，包括基础培养基和如下浓度的组分：
elitegro-adv5vol％，左旋谷氨酰胺2mmol/l，重组人egf10ug/l。
4.根据权利要求1～3任一项所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基为dmem-lg培养基。
5.一种骨髓间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括：
将骨髓单细胞悬液经密度梯度离心，收集含单个核细胞的上清液；
将上清液离心重悬后经免疫磁珠分离，获得骨髓间充质干细胞；
将所述骨髓间充质干细胞接种至权利要求1～4任一项所述的培养基中依次进行原代培养和传代培养。
6.根据权利要求5所述的分离培养方法，其特征在于，所述密度梯度离心为使用percoll分离液900g离心30min，所述percoll分离液的密度为1.073g/ml。
7.根据权利要求5所述的分离培养方法，其特征在于，所述骨髓单细胞悬液和所述percoll分离液的体积比为l：2。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述免疫磁珠分离的抗体为cd45抗体。
9.根据权利要求5所述的分离培养方法，其特征在于，所述接种的密度为1×104/ml。
10.根据权利要求5所述的分离培养方法，其特征在于，所述原代培养和传代培养为5％co2、37℃恒温培养；所述原代培养和继代培养的过程中每2～5天换液一次。
技术总结