本发明属于生物医用骨修复材料制备领域，尤其涉及一种负载生长因子的可注射纳米复合水凝胶材料及其构建方法与应用。
背景技术：
血管结构受损可阻止营养物质自由运输，最终导致新骨形成失败。骨内血管在营养物质运输和循环旁分泌因子中起着重要作用。因此，除了骨诱导因子外，能够介导血管系统的血管内皮生长因子(vegf)引起了许多研究者的广泛关注。vegf可直接刺激人源成骨细胞的迁移和分化[mayr-wohlfartu,waltenbergerj,hausserh,etal.vascularendothelialgrowthfactorstimulateschemotacticmigrationofprimaryhumanosteoblasts[j].bone,2002,30(3):472-7.]。尽管vegf的活性与骨形成有直接关系，但它的应用更倾向于通过与骨诱导因子联合递送以促进骨组织的再生修复。
二维黑磷纳米材料(bpnss)作为新型的二维纳米活性材料，可为体内生物矿化提供良好的成核位点，生物矿化对于骨组织的再生修复具有重要意义[rauccimg,fasolinoi,caporalim,etal.exfoliatedblackphosphoruspromotesinvitroboneregenerationandsuppressesosteosarcomaprogressionthroughcancer-relatedinflammationinhibition[j].acsappliedmaterials&interfaces,2019,11(9):9333-9342.]。例如，yang等人提出将bpnss的降解产物原位转化为能够增强骨再生过程的磷基制剂，可将其应用于骨再生医学领域[yangb,yinj,cheny,etal.2d-black-phosphorus-reinforced3d-printedscaffolds:astepwisecountermeasureforosteosarcoma[j].advmater,2018,30(10):1705611.]。此外，bpnss可通过静电作用、范德华力、疏水相互作用和π-π堆积等非共价作用力与活性分子或药物进行结合[zengx,luom,liug,etal.polydopamine-modifiedblackphosphorousnanocapsulewithenhancedstabilityandphotothermalperformancefortumormultimodaltreatments[j].advsci(weinh),2018,5(10):1800510.]。利用bpnss作为vegf载体并应用于骨再生修复领域的研究尚未有报道。
技术实现要素：
为解决生长因子不能长期存在于体内环境，同时兼顾其促成骨分化性能等生物学性能的问题，本发明提供一种负载生长因子的可注射纳米复合水凝胶材料及其构建方法与应用。本发明将物理交联型水凝胶经过高温处理后，将负载有生长因子的纳米材料嵌合于该物理交联网络，从而构建负载生长因子的自愈合及可注射纳米复合水凝胶材料。
本发明的目的通过下述方案之一实现。
一种负载生长因子的可注射纳米复合水凝胶材料的构建方法，包括以下步骤：
(1)将生长因子加入纳米材料分散液中混合均匀，再孵育，得到生长因子-纳米材料分散液；所述纳米材料为纳米黑磷(bpnss)；
(2)将脱氧核糖核酸(dna)溶解，然后进行高温处理，再加入所述生长因子-纳米材料分散液，得到预聚物；
(3)将所述预聚物进行充分交联，得到负载生长因子的可注射纳米复合水凝胶材料。
优选的，步骤(1)所述孵育的温度为4-37℃，时间为6-24小时。
优选的，步骤(2)所述高温处理的温度为90-100℃，时间为1-10min。
优选的，所述负载生长因子的可注射纳米复合水凝胶材料中，dna浓度为0.03-0.05g/ml，纳米材料浓度为50ppm-200ppm，生长因子浓度为0.5-3μg/ml。
优选的，所述孵育的时间为12小时，所述高温处理的温度为95℃。
优选的，步骤(1)所述生长因子为血管内皮生长因子(vegf)。
优选的，步骤(1)所述混合是在室温下搅拌30-120分钟。
优选的，步骤(2)所述dna来源于鲑鱼睾丸的脱氧核糖核酸钠盐，sigma-aldrich，分子量约为1.3×106g/mol。
优选的，步骤(2)所述dna溶解于杜氏磷酸盐缓冲液(dpbs)中，所述dna溶解的温度为35-55℃。
优选的，步骤(2)中，加入生长因子-纳米材料分散液的温度为30-50℃；所述高温处理的搅拌速度为50-200rpm。
由以上所述的构建方法得到的一种负载生长因子的可注射纳米复合水凝胶材料。
以上所述的一种负载生长因子的可注射纳米复合水凝胶材料在制备骨缺损药物中的应用。
本发明以dna聚合物碱基对之间的氢键作用构建物理交联水凝胶网络，以bpnss作为骨诱导活性组分，以vegf作为成血管活性分子，构建一种负载vegf的dna纳米复合水凝胶材料，同时兼顾水凝胶材料的成血管及成骨活性等生物学性能。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明通过bpnss非共价物理结合vegf，并嵌合于dna动态物理交联网络构建具有成骨及成血管活性的纳米复合水凝胶材料。不仅保证生长因子在生理环境中的长效作用性，同时兼顾水凝胶材料的成骨活性等生物学性能。
(2)本发明通过引入黑磷纳米片，可明显增强dna水凝胶网络对于生长因子的有效控释。
附图说明
图1为实施例1中所使用bpnss的tem图片。
图2为实施例1中所使用vegf的tem图片。
图3为实施例2中所制备的vegf-bpnss的tem图片。
图4为实施例2中的dna与bp/dna水凝胶的流变图。
图5为实施例3中所制备的vegf-bp/dna水凝胶的实物图。
图6为实施例3中所制备的vegf-bp/dna水凝胶的注射照片。
图7为实施例2中水凝胶的vegf释放曲线图。
图8为实施例2中水凝胶培养huvecs细胞12小时后细胞迁移定量结果图。
图9为实施例2中水凝胶培养bmscs细胞7天后alp基因表达水平图。
图10实施例3中水凝胶培养huvecs细胞3天后vwf基因表达水平图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所示的范围。
实施例1
步骤一：负载vegf的bpnss(vegf-bpnss)的制备
(1)将0.6μgvegf与200μl浓度为300ppm的bpnss分散液混合；
(2)室温下搅拌30分钟；
(3)37℃孵育6小时，得到vegf-bpnss分散液。图1所示为所使用的bpnss的tem图片。图2为所使用vegf的tem图片。
步骤二：负载vegf的可注射纳米复合水凝胶(vegf-bp/dna)的制备
(1)将0.036gdna聚合物(来源于鲑鱼睾丸的脱氧核糖核酸钠盐，sigma-aldrich，分子量约为1.3×106g/mol)溶解于1mldpbs，在50℃下搅拌至dna聚合物充分溶解，得到dna预聚物；
(2)将dna预聚物进行100℃高温水浴1分钟后，迅速转移至40℃恒温水浴锅，并加入200μlvegf-bpnss分散液，充分搅拌得到vegf-bp/dna预聚物；
(3)将预聚物转移至模具中，在室温下静置交联6小时，得到vegf-bp/dna(其中，dna浓度为0.03g/ml，bpnss浓度为50ppm，vegf浓度为0.5μg/ml)，可用于递送vegf的可注射纳米复合水凝胶材料。
实施例2
步骤一：负载vegf的bpnss(vegf-bpnss)的制备
(1)将2.4μgvegf与200μl浓度为600ppm的bpnss分散液混合；
(2)室温下搅拌60分钟；
(3)4℃孵育12小时，得到vegf-bpnss分散液。图3所示为制备的vegf-bpnss的tem图片。
步骤二：负载vegf的可注射纳米复合水凝胶(vegf-bp/dna)的制备
(1)将0.06gdna聚合物(来源于鲑鱼睾丸的脱氧核糖核酸钠盐，sigma-aldrich，分子量约为1.3×106g/mol)溶解于1mldpbs，在50℃下搅拌至dna聚合物充分溶解，得到dna预聚物；
(2)将dna预聚物进行95℃高温水浴5分钟后，迅速转移至40℃恒温水浴锅，并加入200μlvegf-bpnss分散液，充分搅拌得到vegf-bp/dna预聚物；
(3)将预聚物转移至模具中，在室温下静置交联6小时，得到vegf-bp/dna(其中，dna浓度为0.05g/ml，bpnss浓度为100ppm，vegf浓度为2μg/ml)，可用于递送vegf的可注射纳米复合水凝胶材料。
图4为本实施例的dna与bp/dna水凝胶的应变扫描曲线。dna和bp/dna水凝胶的储存模量(g’)均大于损耗模量(g”)，bpnss的引入明显增大了dna水凝胶的g’，表明bpnss可有效提升dna水凝胶网络的微观力学性能。
本发明首次将bpnss及生长因子联合应用于dna可注射水凝胶中。负载生长因子的bpnss嵌合于dna动态物理交联网络，显著增强了dna水凝胶的成血管活性及成骨诱导性，同时也改善了生长因子在生理环境中作用时间短的问题。相比于单一组分的dna水凝胶(图7中标记为vegf/dna，与本实施例制备的vegf-bp/dna的区别在于不加入bpnss)，bpnss的引入可明显增强dna水凝胶网络对于vegf的有效控释(见图7)。如图8所示为本实施例的vegf-bp/dna水凝胶作用培养基培养12小时后，人脐静脉内皮细胞(huvecs)细胞迁移的定量结果，相比于bp/dna水凝胶组(图中标记为bp/dna，与本实施例制备的vegf-bp/dna的区别在于不加入vegf)，负载vegf的bp/dna水凝胶能够显著促进huvecs细胞的迁移，由此表明bp/dna水凝胶网络可有效保留vegf的生物活性。
图9所示为水凝胶培养骨髓间充质干细胞(bmscs)细胞7天后碱性磷酸酶(alp)基因的mrna表达水平，相比于dna水凝胶组(图中标记为dna，与本实施例制备的vegf-bp/dna的区别在于不加入bpnss和vegf)，bp/dna水凝胶(图中标记为bp/dna，与本实施例制备的vegf-bp/dna的区别在于不加入vegf)能够显著促进细胞alp基因的表达，vegf的负载进一步增强了bp/dna水凝胶对细胞alp基因表达的上调作用，vegf与bpnss协同促进bmscs细胞的成骨分化。
实施例3
步骤一：负载vegf的bpnss(vegf-bpnss)的制备
(1)将3.6μgvegf与400μl浓度为600ppm的bpnss分散液混合；
(2)室温下搅拌120分钟；
(3)25℃孵育24小时，得到vegf-bpnss分散液；
步骤二：负载vegf的可注射纳米复合水凝胶(vegf-bp/dna)的制备
(1)将0.048gdna聚合物(来源于鲑鱼睾丸的脱氧核糖核酸钠盐，sigma-aldrich，分子量约为1.3×106g/mol)溶解于0.8mldpbs，在50℃下搅拌至dna聚合物充分溶解，得到dna预聚物；
(2)将dna预聚物进行90℃高温水浴10分钟后，迅速转移至40℃恒温水浴锅，并加入400μlvegf-bpnss分散液，充分搅拌得到vegf-bp/dna预聚物；
(3)将预聚物转移至模具中，在室温下静置交联6小时，得到vegf-bp/dna(其中，dna浓度为0.04g/ml，bpnss浓度为200ppm，vegf浓度为3μg/ml)，可用于递送vegf的可注射纳米复合水凝胶材料。
图5为本实施例所制备的vegf-bp/dna水凝胶的实物图。
图6为本实施例所制备的vegf-bp/dna水凝胶的注射照片。
图10所示为水凝胶培养huvecs细胞3天后血管性血友病因子(vwf)基因的mrna表达水平，相比于dna水凝胶(图中标记为dna，与本实施例制备的vegf-bp/dna的区别在于不加入bpnss和vegf)和bp/dna水凝胶(图中标记为bp/dna，与本实施例制备的vegf-bp/dna的区别在于不加入vegf)，本实施例的vegf-bp/dna水凝胶组显著上调了细胞vwf基因的表达水平，vegf的负载显著增强了dna和bp/dna水凝胶的成血管分化性能。
1.一种负载生长因子的可注射纳米复合水凝胶材料的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将生长因子加入纳米材料分散液中混合均匀，再孵育，得到生长因子-纳米材料分散液；所述纳米材料为纳米黑磷；
(2)将dna溶解，然后进行高温处理，再加入所述生长因子-纳米材料分散液，得到预聚物；
(3)将所述预聚物进行充分交联，得到负载生长因子的可注射纳米复合水凝胶材料。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述孵育的温度为4-37℃，时间为6-24小时。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述高温处理的温度为90-100℃，时间为1-10min。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述负载生长因子的可注射纳米复合水凝胶材料中，dna浓度为0.03-0.05g/ml，纳米材料浓度为50ppm-200ppm，生长因子浓度为0.5-3μg/ml。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述孵育的时间为12小时，所述高温处理的温度为95℃。
6.根据权利要求1-5任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述生长因子为血管内皮生长因子。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述dna溶解于杜氏磷酸盐缓冲液中，所述dna溶解的温度为35-55℃；所述dna来源于鲑鱼睾丸的脱氧核糖核酸钠盐，分子量为1.3×106g/mol。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，加入生长因子-纳米材料分散液的温度为30-50℃。
9.由权利要求1-8任一项所述的构建方法得到的一种负载生长因子的可注射纳米复合水凝胶材料。
10.权利要求9所述的一种负载生长因子的可注射纳米复合水凝胶材料在制备骨缺损药物中的应用。
技术总结