本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种具有免疫响应的电活性钛植入体及其制备方法。
背景技术：
随着世界人口逐渐老龄化，和骨骼相关的疾病如骨折、骨肿瘤等疾病发病率逐渐上升，相应的治疗费用增加。尽管骨骼具有一定的再生和自我修复能力，但严重的创伤，肿瘤切除，癌症或先天性疾病导致的大段骨缺损只能通过骨移植修复。钛及钛合金由于具有与骨骼相似的杨氏模量、耐腐蚀性好等优点，已经广泛应用于骨植入体领域。但纯钛表面生物惰性对快速有效的骨整合不利，因此，通过表面改性技术提高纯钛表面的生物活性实现快速有效的骨整合具有重要意义。基于骨骼的压电特性，骨内的干细胞和成骨细胞处于一种电生理微环境中，通过在纯钛植入体表面构建有利于骨内干细胞增殖和分化的电生理微环境对于促进骨整合具有重要的现实意义。同时，鉴于骨整合是一个动态且复杂生理过程，巨噬细胞在其中发挥着不可或缺的作用。因此，构建的电生理微环境对巨噬细胞的免疫调控形成有利于骨整合的免疫微环境同样不能忽视。
近年来，已有研究表明通过在植入体表面构建适合骨内干细胞分化的电生理微环境可促进骨缺损的快速修复。然而，对于构建的电生理微环境对巨噬细胞免疫调控的研究却十分有限。
技术实现要素：
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首目的在于提供一种具有免疫响应的电活性钛植入体的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述方法制得的一种具有免疫响应的电活性钛植入体。通过构建的电生理微环境以及对巨噬细胞调控形成的免疫微环境提高骨整合效率。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种具有免疫响应的电活性钛植入体的制备方法，包括以下步骤：
将钛植入体进行砂纸打磨、清洗和干燥后，置于激光打标机上进行激光选区辐照处理，获得具有电活性的周期半导体-金属异质结钛植入体。
优选的，所述砂纸打磨具体为：使用200#、500#、1000#、3000#、5000#砂纸依次打磨钛植入体去除表面氧化层。
优选的，所述清洗具体为用丙酮、无水乙醇、去离子水依次超声清洗10～20min。
优选的，所述干燥为常规干燥。
优选的，所述激光辐照处理的条件为：激光辐照功率为2.4～3w，打标速度为100～200mm/s，扫描宽度为15～100μm。
更优选的，所述扫描宽度为30～50μm。
优选的，所述置于激光打标机上指将清洗后的钛植入体固定于激光打标机的步进电机上。
优选的，所述钛植入体为纯钛或钛基骨植入体。
上述方法制得的一种具有免疫响应的电活性钛植入体。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)通过激光选区辐照处理对钛植入体进行表面处理，该方法成本低、速度快，适合大规模生产。
(2)通过激光选区辐照处理获得的半导体-金属异质结形成的微区电场符合骨组织的电生理微环境，对骨髓间充质干细胞具有促进增殖、分化作用。
(3)通过激光选区辐照处理获得的半导体-金属异质结形成的微区电场对巨噬细胞可进行免疫调控，形成有利于骨髓间充质干细胞分化的免疫微环境。
附图说明
图1为本发明实施例1所述具有免疫响应的电活性钛植入体(标记为30-mef)的sem图。激光辐照区域标记为lt，未辐照区域为ti。
图2为本发明实施例1所述具有免疫响应的电活性钛植入体(标记为50-mef)的sem图。激光辐照区域标记为lt，未辐照区域为ti。
图3为本发明实施例1所述具有免疫响应的电活性钛植入体(标记为100-mef)的sem图。激光辐照区域标记为lt，未辐照区域为ti。
图4为实施例2中30-mef样品激光辐照区域(lt)与未辐照区域(ti)的xrd图。
图5为实施例2中30-mef样品激光辐照区域(lt)与未辐照区域(ti)的莫特-肖特基曲线图。
图6为实施例2中30-mef样品激光辐照区域(lt)与未辐照区域(ti)的载流子密度统计图。
图7为实施例3中具有电活性的样品组(30-mef、50-mef、100-mef)与纯钛组培养大鼠骨髓间充质干细胞(rbmscs)1、3、5天检测细胞增殖的cck-8结果图。
图8为实施例4中具有电活性的样品组(30-mef、50-mef、100-mef)与纯钛组培养大鼠骨髓间充质干细胞(rbmscs)7、14天检测细胞碱性磷酸酶活性结果图。
图9为实施例5中具有电活性的样品组(30-mef、50-mef、100-mef)与纯钛组培养raw264.7巨噬细胞3天检测抗炎性表型标志物cd206表达结果图。
图10为实施例5中具有电活性的样品组(30-mef、50-mef、100-mef)与纯钛组培养raw264.7巨噬细胞3天检测促炎性表型标志物ccr7表达结果图。
图11为实施例6中具有电活性的样品组(30-mef、50-mef、100-mef)与纯钛组培养raw264.7巨噬细胞3天qt-pcr检测促炎性基因inos表达结果图。
图12为实施例6中具有电活性的样品组(30-mef、50-mef、100-mef)与纯钛组培养raw264.7巨噬细胞3天qt-pcr检测抗炎性基因il-10表达结果图。
图13为实施例7中具有电活性的样品组(30-mef、50-mef、100-mef)培养raw264.7巨噬细胞3天后收集其培养基，使用此培养基培养大鼠骨髓间充质干细胞(rbmscs)7天后检测细胞碱性磷酸酶活性结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用未注明生产厂商者的原料、试剂等，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
制备具有免疫响应的电活性钛植入体
(1)纯钛植入体的预处理：使用200#、500#、1000#、3000#、5000#砂纸依次打磨植入体去除表面氧化层，然后用丙酮、无水乙醇、去离子水依次超声清洗20min，最后常规干燥。
(2)电活性植入体的构建：将步骤(1)获得的纯钛植入体固定于激光打标机的步进电机上，进行激光选区辐照处理，激光辐照功率为3w，扫描速率为100mm/s，扫描宽度分别为30μm、50μm和100μm；得到的电活性植入体分别记为30-mef、50-mef和100-mef。
对比例1
纯钛植入体的预处理：使用200#、500#、1000#、3000#、5000#砂纸依次打磨植入体去除表面氧化层，然后用丙酮、无水乙醇、去离子水依次超声清洗20min，最后常规干燥，得到预处理的纯钛。
实施例2
按照实施例1的方法条件制备具有免疫响应的电活性钛植入体。
图1～3为电活性钛植入体的扫描电子显微镜图片，如图所示，激光辐照区域标记为lt，未辐照区域标记为ti，设置相邻lt的间距为30μm、50μm、100μm。图4为lt和ti的x射线衍射分析结果，表明激光辐照区域物相转变为tio。图5为lt和ti的莫特-肖特基曲线，通过曲线结合莫特-肖特基公式计算出的载流子密度如图6所示，表明lt和ti具有显著性差异的电学性质。
实施例3
取实施例1所制备的电活性植入体30-mef、50-mef和100-mef，对比例1的纯钛组(ti)作为对照组。消毒处理后，将第三代大鼠骨髓间充质干细胞(rbmscs)按细胞密度为10000细胞/100μl接种于材料表面，培养1、3、5天后通过cck-8试剂盒测试细胞增殖情况，测试结果如图7所示，培养3天后，与纯钛组相比，具有电活性的30-mef组的吸光值上升；培养5天后，与纯钛组相比，具有电活性的30-mef、50-mef和100-mef组的吸光值具有显著性差异，表明该电活性植入体可显著促进细胞增殖。
实施例4
取实施例1所制备的电活性植入体30-mef、50-mef和100-mef，对比例1的纯钛组(ti)作为对照组。消毒处理后，将第三代大鼠骨髓间充质干细胞(rbmscs)按细胞密度为50000细胞/100μl接种于材料表面，培养7、14天后通过碱性磷酸酶试剂盒测试细胞分化情况，测试结果如图8所示，培养7、14天后，与纯钛组相比，具有电活性的30-mef、50-mef和100-mef组的碱性磷酸酶活性显著上升，表明该电活性植入体可显著促进细胞分化。
实施例5
取实施例1所制备的电活性植入体30-mef、50-mef和100-mef，对比例1的纯钛组(ti)作为对照组。消毒处理后，将第三代raw264.7巨噬细胞按细胞密度为10000细胞/100μl接种于材料表面，培养3天后通过流式细胞术检测巨噬细胞分型情况，测试结果如图9、10所示，与纯钛组相比，具有电活性的30-mef、50-mef和100-mef组的巨噬细胞表达抗炎性表型标记物cd206显著高于纯钛组，而表达促炎性表型标记物ccr7显著低于纯钛组，表明该电活性植入体可在蛋白水平调节巨噬细胞的炎症反应为抗炎型。
实施例6
取实施例1所制备的电活性植入体30-mef、50-mef和100-mef，对比例1的纯钛组(ti)作为对照组。消毒处理后，将第三代raw264.7巨噬细胞按细胞密度为10000细胞/100μl接种于材料表面，培养3天后通过qt-pcr检测巨噬细胞炎症相关基因的表达情况，测试结果如图11、12所示，与纯钛组相比，具有电活性的30-mef、50-mef和100-mef组下调了促炎性基因inos的表达，同时上调了抗炎性基因il-10的表达，表明该电活性植入体可在基因水平上调抗炎性基因的表达。
实施例7
取实施例1所制备的电活性植入体30-mef、50-mef和100-mef，对比例1的纯钛组(ti)作为对照组。消毒处理后，将第三代raw264.7巨噬细胞按细胞密度为10000细胞/100μl接种于材料表面，培养3天后分别收集两组样品表面巨噬细胞培养基，与新的培养基按照1:1比例配制成条件培养基。将第三代大鼠骨髓间充质干细胞(rbmscs)按细胞密度为50000细胞/100μl接种于孔板，用此条件培养基培养7天后，使用碱性磷酸酶试剂盒测试细胞分化情况。测试结果如图13所示，培养7天后，与纯钛组相比，具有电活性的30-mef、50-mef和100-mef组的碱性磷酸酶活性显著上升，表明该电活性植入体可通过调节巨噬细胞的免疫响应形成有利于rbmscs分化的免疫微环境。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
1.一种具有免疫响应的电活性钛植入体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将钛植入体进行砂纸打磨、清洗和干燥后，置于激光打标机上进行激光选区辐照处理，获得具有电活性的周期半导体-金属异质结钛植入体。
2.根据权利要求1所述一种具有免疫响应的电活性钛植入体的制备方法，其特征在于，所述激光辐照处理的条件为：激光辐照功率为2.4～3w，打标速度为100～200mm/s，扫描宽度为15～100μm。
3.根据权利要求2所述一种具有免疫响应的电活性钛植入体的制备方法，其特征在于，所述扫描宽度为30～50μm。
4.根据权利要求1所述一种具有免疫响应的电活性钛植入体的制备方法，其特征在于，所述置于激光打标机上指将清洗后的钛植入体固定于激光打标机的步进电机上。
5.根据权利要求1所述一种具有免疫响应的电活性钛植入体的制备方法，其特征在于，所述钛植入体为纯钛或钛基骨植入体。
6.根据权利要求1所述一种具有免疫响应的电活性钛植入体的制备方法，其特征在于，所述砂纸打磨具体为：使用200#、500#、1000#、3000#、5000#砂纸依次打磨钛植入体去除表面氧化层。
7.根据权利要求1所述一种具有免疫响应的电活性钛植入体的制备方法，其特征在于，所述清洗具体为用丙酮、无水乙醇、去离子水依次超声清洗10～20min。
8.权利要求1～7任一项所述方法制得的一种具有免疫响应的电活性钛植入体。
技术总结