本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种三联培养基序贯培养人脐带间充质干细胞的方法。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)是一类来源于中胚层和外胚层并且具有自我更新、多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪、胎盘、月经血、脐带血和脐带组织中，目前已成为基因治疗领域中极具实用价值的细胞来源。不同来源的mscs具有相似的形态和表面标志物，同时也具有相似的生物学特性，但是不同的mscs数量有所差别，其分离方法也各不相同。脐带mscs是存在于脐带华通氏胶(wharton'sjelly)和血管周围组织中的一种干细胞。脐带mscs的组织来源广泛，取材方便，易于采集和运输，免疫原性低，生物学特性稳定，无异体排斥反应，分离培养相对简单，对捐献者无损害以及无伦理学限制，正逐渐成为干细胞在未来医疗应用上的理想选择和研究热点之一。
人脐带长度约60cm，大约40g，是一种胶状的结蹄组织，如何简单、经济、高效地从脐带组织中分离到脐带mscs是科研人员急于攻克的难题。目前脐带mscs原代分离的方法主要有酶消化法及组织块贴壁法。酶消化法需要使用多种酶，加上某些酶比如胶原酶等可能涉及动物来源，并且价格昂贵，经济成本高；加上该方法操作繁琐、消化时间较长，消化程度难于把控，特别是消化时间过长容易损伤细胞，导致细胞大量死亡，细胞得率偏低。而组织块贴壁法的操作简单易行，经济成本较低，但是细胞爬出时间太慢，并且原代培养时间太长，容易引起细胞老化，细胞纯度不够，进而影响该类细胞的临床应用。
公告号cn109337867b公开了一种脐带间充质干细胞分离方法，该方法综合了组织块法和酶消化法，虽然能够提高间充质干细胞的分离效率和细胞数量，但是该方法使用了胶原酶、选择培养基和生长因子，成本昂贵，不利于间充质干细胞的规模化生产。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种三联培养基序贯培养人脐带间充质干细胞的方法，该方法不但提高了间充质干细胞的分离效率和细胞数量，而且还极大地降低分离培养人脐带间充质干细胞的成本，适用于间充质干细胞的规模化生产。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种三联培养基序贯培养人脐带间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
1)分离华通氏胶；
2)将华通氏胶组织块经生理盐水洗涤后剪成1～2mm3大小，使其均匀铺于明胶预先包被的培养皿中，37度放置2h后，加入第一培养基，并在组织块上面放置无菌的盖玻片以促进组织块贴壁和间充质干细胞的生长；所述第一培养基主要由dmem高糖培养基、胎牛血清、抗生素组成，其中胎牛血清体积占比为7.5-15％；
3)待第一培养基培养至细胞生长状态稳定，改用第二培养基进行培养；所述第二培养基主要由dmem高糖培养基、胎牛血清、抗生素和间充质干细胞生长添加物组成，其中胎牛血清体积占比为7.5-15％，间充质干细胞生长添加物体积占比为0.1-0.3％；
4)传代两次后，后续重新换回第一培养基进行培养。
优选的，步骤1)中分离华通氏胶包括如下步骤：无菌条件下获得胎儿的脐带组织，在无菌生理盐水清洗，弃去血管变形处以及开口两端。撕开脐带，用组织镊剔除两条动脉、一条静脉和脐带外膜，留下内膜，内膜即为华通氏胶。优选的，所述脐带取自正常足月剖宫产胎儿。
优选的，步骤2)中加入第一培养基进行培养，前3天静置培养，第4天补加第一培养基3～4ml，观察生长情况，之后每2～3天换液一次，待大部分组织快均有细胞爬出时，去掉组织块，换液。
优选的，步骤2)中明胶预先包被的培养皿，明胶包被条件为4℃过夜。
优选的，步骤3)中待第一培养基培养至细胞生长状态稳定是指：用第一培养基对间充质干细胞进行原代培养至细胞融合度达到70～80％。
优选的，所述第一培养基、第二培养基中抗生素的含量为：100-150u/ml青霉素、100-150μg/ml链霉素和0.25-0.75μg/ml两性霉素b。
优选的，步骤2)至4)中所述培养为在37℃、5％co2环境中培养。
本发明取得的有益效果：
本发明提供了一种三联培养基序贯培养人脐带间充质干细胞的方法，与传统的组织块贴壁法不同，本发明的脐带mscs原代分离培养采用主要由dmem高糖培养基、胎牛血清、抗生素组成的第一培养基，并在组织块上面放置无菌的盖玻片以促进组织块贴壁和间充质干细胞的生长；试验证明，在原代分离培养过程中，采用相同的培养基，脐带组织上面放置无菌的盖玻片比未放置的，生长速度明显加快，细胞密度明显高于组织块未加无菌盖玻片；且细胞爬出时间和原代培养时间均短于织块未加无菌盖玻片组(p<0.05)；此外，在传代培养中，待第一培养基培养至细胞生长状态稳定后改用第二培养基(含有间充质干细胞生长添加物)进行传代培养，传代两次后，重新换回第一培养基进行后续的传代培养，整个过程中不使用商用的间充质干细胞专用培养基，并且从第4代开始直到15代，应用普通的培养基就可以满足细胞的增殖生长。分别计算第2代和第6代的mscs原料成本，其中第2代mscs的培养成本大约需要1100元人民币，第6代mscs的培养成本大约需要300元人民币。本发明的方法极大地降低了分离、培养人脐带间充质干细胞的成本，步骤简单、培养成功率高，适用于大规模的培养；且增殖能力检测和成脂分化实验结果验证了本发明的方法分离培养的mscs完全可用于再生医学相关研究领域，为更好的应用脐带血间充质干细胞奠定了坚实的基础。
附图说明
图1为原代培养第5天时mscs的细胞形态图(200×)；
图2为原代培养第14天时mscs的细胞形态图(200×)；
图3为实施例1和对比例1得到的原代培养第10天时mscs的细胞形态图(200×)；
图中，a.组织块未加无菌盖玻片；b.组织块加放无菌盖玻片。
图4为实施例1和对比例2得到的传代培养第3天时mscs的细胞形态图(200×)；
图中，a.采用普通dmem高糖培养基培养3天时的第2代细胞；b.采用三联培养基方法培养3天时的第2代细胞。
图5为原代培养和传代培养得到的mscs的生长曲线图；
图6为实施例1得到的mscs的流式检测结果图；
图7为实施例1得到的mscs的成脂分化检测结果图(200×)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；实施例及试验例中所用的仪器设备如无特别说明，均为市售常规仪器设备；所用试剂材料，如无特别说明，均为市售常规试剂材料。
实施例1
该实施例提供了对脐带组织标本进行三联培养基序贯培养人脐带间充质干细胞的方法。脐带组织采集：经产妇及其家属同意，在新乡医学院第三附属医院采集健康产妇38周～40周剖宫产脐带组织，手术室洁净条件下，将脐带组织放入预先加注有100ml的d-hanks平衡盐溶液中，密封，2℃～8℃条件下运输到实验室。具体步骤如下：
1.分离华通氏胶
无菌条件下获得正常足月剖宫产胎儿的脐带组织，在无菌生理盐水清理若干次，直至洗净血渍，弃去血管变形处以及开口两端。将脐带剪成3cm～5cm的小段，撕开脐带，使用组织镊剔除中的两条动脉、一条静脉和脐带外膜，留下内膜，内膜即为华通氏胶，放入生理盐水中洗涤2～3次。
2.组织块培养：将华通氏胶组织块剪成1～2mm3大小，将其均匀铺于明胶预先包被的培养皿中。37度放置2h后，加入适量的第一培养基，并在组织块上面放置无菌的盖玻片以促进组织块贴壁和间充质干细胞的生长，之后将培养皿置于37℃、5％co2培养箱中培养。
前3天静置培养。
第4天补加第一培养基3～4ml，观察生长情况，之后每2～3天换液一次。
第一培养基主要由dmem高糖培养基、胎牛血清、抗生素组成，其中胎牛血清体积占比为10％；在其他实施例中，第一培养基中胎牛血清体积占比的可选范围为7.5-15％，例如7.5％、12％或15％；抗生素的含量为：100-150u/ml青霉素、100-150μg/ml链霉素和0.25-0.75μg/ml两性霉素b。
3.待大部分组织快均有细胞爬出时，去掉组织块，换液，在细胞密度达到70％～80％时，改用第二培养基进行传代培养，连续培养两代。
第二培养基主要由dmem高糖培养基、胎牛血清、抗生素和间充质干细胞生长添加物组成，其中胎牛血清体积占比为10％；在其他实施例中，第一培养基中胎牛血清体积占比的可选范围为7.5-15％，例如7.5％、12％或15％；间充质干细胞生长添加物体积占比为0.2％；在其他实施例中，第一培养基中胎牛血清体积占比的可选范围为0.1-0.3％，例如0.1％、0.3％；抗生素的含量为：100-150u/ml青霉素、100-150μg/ml链霉素和0.25-0.75μg/ml两性霉素b。
4.从第4代起，后续重新换回第一培养基进行培养。
对比例1
该对比例同样采用脐带组织标本进行间充质干细胞的培养，脐带组织采集参见实施例1。该对比例在原代分离培养过程中，采用与实施例1相同的培养基，但脐带组织上面没有放置无菌的盖玻片，具体步骤如下：
1.分离华通氏胶(参见实施例1)
2.组织块培养：将组织块剪成1～2mm3大小，将其均匀铺于明胶预先包被的培养皿中。37度放置2h后，加入适量的第一培养基，将培养皿置于37℃、5％co2培养箱中培养。
前3天静置培养。
第4天补加第一培养基3～4ml，观察生长情况，之后每2～3天换液一次。
第一培养基主要由dmem高糖培养基、胎牛血清、抗生素组成，其中胎牛血清体积占比为10％；抗生素的含量为：100-150u/ml青霉素、100-150μg/ml链霉素和0.25-0.75μg/ml两性霉素b。
3.待大部分组织快均有细胞爬出时，去掉组织块，换液，在细胞密度达到70％～80％时，改用第二培养基进行传代培养，连续培养两代。
4.从第4代起，后续重新换回第一培养基进行培养。
第二培养基主要由dmem高糖培养基、胎牛血清、抗生素和间充质干细胞生长添加物组成，其中胎牛血清体积占比为10％，间充质干细胞生长添加物体积占比为0.2％；抗生素的含量为：100-150u/ml青霉素、100-150μg/ml链霉素和0.25-0.75μg/ml两性霉素b。
对比例2
该对比例采用普通dmem高糖培养基对脐带组织标本进行间充质干细胞的培养，脐带组织采集参见实施例1，具体步骤如下：
1.分离华通氏胶(参见实施例1)
2.组织块培养：将组织块剪成1～2mm3大小，将其均匀铺于明胶预先包被的培养皿中。37度放置2h后，加入适量的dmem高糖培养基，将培养皿置于37℃、5％co2培养箱中培养。
前3天静置培养。
第4天补加dmem高糖培养基3～4ml，观察生长情况，之后每2～3天换液一次。
dmem高糖培养基主要由dmem培养基、胎牛血清、抗生素组成，其中胎牛血清体积占比为10％；抗生素的含量为：100-150u/ml青霉素、100-150μg/ml链霉素和0.25-0.75μg/ml两性霉素b。
3.待大部分组织块均有细胞爬出时，去掉组织块，换液，在细胞密度达到70％～80％时，继续采用dmem高糖培养基传代培养。
试验例
该试验例采用实施例1提供的三联培养基序贯培养人脐带间充质干细胞的方法对脐带组织标本进行间充质干细胞培养；并将对比例1及对比例2提供的方法作为对照，通过观察细胞生长状态，绘制脐带间充质干细胞的体外生长曲线，流式细胞术检测细胞表面标记物，成脂分化能力检测等实验，对培养获得的脐带间充质干细胞进行系列鉴定。
(一)mscs的形态学特征和细胞得率
在倒置相差显微镜下观察原代培养的细胞形态学特征，本发明实施例1方法培养结果分别见图1和图2，原代培养第5天时组织块可见mscs爬出(图1)，原代培养第14天时细胞融合度可达到70％～80％(图2)。
对比例1与实施例1的区别在于，对比例1的组织块未加无菌盖玻片，对原代培养第10天时的mscs进行细胞形态观察和统计学分析，结果见图3和表1。由图可知，组织块加放无菌盖玻片的细胞密度(图3b)明显高于组织块未加无菌盖玻片(图3a)；此外，组织块加放无菌盖玻片组(实施例1)的细胞爬出时间和原代培养时间均短于织块未加无菌盖玻片组(对比例1)，差异具有统计学意义(p<0.05)(表1)。
表1两组mscs培养效果比较
注：与未加无菌盖玻片组相比较，*p<0.05
对比例2与实施例1的区别在于，对比例2采用普通dmem高糖培养基培养，对传代培养第3天时mscs的细胞形态进行观察，同时采用台盼蓝染液对细胞活力进行计算，计算公式为：细胞活力＝活细胞数/(死细胞数 活细胞数)×100，结果见图4和表2。采用三联培养基方法培养3天时的第2代细胞的细胞密度和细胞活力均明显高于采用普通dmem高糖培养基培养3天时的第2代细胞，即三联培养基方法的细胞得率明显优于普通dmem高糖培养基。
表2两组mscs培养得率比较
注：与对比例相比较，*p<0.05
(二)mscs的生长曲线
分别取第2代，第6代和第12代的mscs，制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104/ml，按200ul/孔接种至24孔板，置于37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱内培养。从第2天起，每天随机选择两个孔分别消化计数，取其平均值作为当天的细胞数目，连续观察计数12天，绘制mscs的体外生长曲线，如图5所示。生长曲线显示，第2代，第6代和第12代的mscs增殖速度及生长周期无明显变化，具体的，第1～3天为细胞的生长潜伏期，从第4天开始，细胞进入对数生长期，进而开始大量增殖，倒置显微镜下可以观察到细胞突起向周围不断伸展，细胞密度逐渐增加，彼此相连，到第10天达到高峰，以后速度减慢，进入平台期。
(三)mscs的表型鉴定
取第6代的mscs，使用0.25％胰酶消化后，1000rpm离心10min，弃上清液，用pbs洗涤沉淀3次，重悬计数1×106个细胞，分别加入20μl流式单抗，包括cd45-fitc和cd44-fitc，常温下避光放置30min，然后1000rpm离心5min，待去除未结合的抗体后，加入400μl的pbs重悬，使用流式细胞仪进行检测，具体操作按照仪器的使用规则进行。
流式细胞表型鉴定结果如图6所示，表明本发明分离培养的mscs能够稳定均一的高表达干细胞标志物cd44，几乎不表达造血前体细胞的标志抗原cd45。
(四)mscs的分化潜能实验
取第6代的mscs，制成单细胞悬液，接种于6孔板内，置于37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中培养。待细胞达到80％融合时，细胞换液，更换为人脐血间质干细胞成脂诱导分化培养基a液，诱导3天后，弃a液，更换为人脐血间质干细胞成脂诱导分化培养基b液，24h后，弃b液，重新换回a液。a液与b液如此交替作用3轮，大约12天，继续用b液维持培养3天，直到脂滴变大和变圆。待本轮成脂诱导分化结束后，采用4％中性甲醛溶液进行固定，经0.3％的油红o染液染色鉴定后，将培养板置于倒置显微镜下，观察成脂的染色效果。经分化培养后，油红o染色结果见图7，图中显示mscs均可见脂滴形成，表明本方法分离培养的mscs经过多轮传代后仍具有多向分化潜能。
基于上述实验结果，本发明的人脐带间充质干细胞的培养方法分离、培养的即为人脐带间充质干细胞，并且采用本发明的人脐带血间充质干细胞的培养方法简单，整个过程中不使用商用的间充质干细胞专用培养基，并且从第4代开始直到15代，应用普通的培养基就可以满足细胞的增殖生长，极大地降低了分离、培养的成本，该方法适用于大规模的脐带间充质干细胞的培养并将其用于相关疾病治疗。
1.一种三联培养基序贯培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)分离华通氏胶；
2)将华通氏胶组织块经生理盐水洗涤后剪成1～2mm3大小，使其均匀铺于明胶预先包被的培养皿中，37℃放置2h后，加入第一培养基进行培养；培养过程中，在组织块上面放置无菌的盖玻片以促进组织块贴壁和间充质干细胞的生长；所述第一培养基主要由dmem高糖培养基、胎牛血清、抗生素组成，其中胎牛血清体积占比为7.5-15％；
3)待第一培养基培养至细胞生长状态稳定，改用第二培养基进行传代培养；所述第二培养基主要由dmem高糖培养基、胎牛血清、抗生素和间充质干细胞生长添加物组成，其中胎牛血清体积占比为7.5-15％，间充质干细胞生长添加物体积占比为0.1-0.3％；
4)传代两次后，后续重新换回第一培养基进行培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中分离华通氏胶包括如下步骤：无菌条件下获得胎儿的脐带组织，无菌生理盐水清洗并弃去血管变形处以及开口两端，撕开脐带，用组织镊剔除两条动脉、一条静脉和脐带外膜，留下内膜，内膜即为华通氏胶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述脐带取自正常足月剖宫产胎儿。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中加入第一培养基进行培养，前3天静置培养，第4天补加第一培养基3～4ml，观察生长情况，之后每2～3天换液一次，待大部分组织快均有细胞爬出时，去掉组织块，换液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中明胶预先包被的培养皿，明胶包被条件为4℃过夜。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中待第一培养基培养至细胞生长状态稳定是指：用第一培养基对间充质干细胞进行原代培养至细胞融合度达到70～80％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培养基、第二培养基中抗生素的含量为：100-150u/ml青霉素、100-150μg/ml链霉素和0.25-0.75μg/ml两性霉素b。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)至4)中所述培养为在37℃、5％co2环境中培养。
技术总结