本发明涉及一种工作细胞库的制备方法，具体涉及一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
脂肪间充质干细胞(adiposemesenchymalstemcells,adsc)是存在于脂肪组织的成体多潜能干细胞，在一定条件下可分化为骨、软骨、心肌、平滑肌、神经及内皮等多种组织细胞。由于脂肪组织来源丰富，体内的储备量大，取材相对容易，少量组织即可以获得大量的干细胞，衰亡率低等优势，因此人脂肪间充质干细胞在临床上具有很高的应用价值。
干细胞工作库就是将干细胞置于深低温状态下长期保存，一个完善的干细胞工作细胞库能够为临床细胞治疗提供良好的、充足的细胞来源。目前，国内已经建立了人脐带干细胞库，胎盘干细胞库、骨髓干细胞库，但对于脂肪间充质干细胞工作细胞库的构建和制备的相关研究较少，技术不够成熟。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，提供了一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，能够为脂肪间充质干细胞的临床应用提供价值。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，包括以下步骤：
(1)无菌采集人体脂肪；
(2)胶原酶消化；
(3)脂肪间充质干细胞分离与原代培养；
(4)脂肪间充质干细胞传代培养；
(5)脂肪间充质干细胞冻存；
(6)脂肪间充质干细胞质量检验；
(7)脂肪间充质干细胞入库。
作为一种优选的方案，所述无菌采集脂肪之后需要进行油脂去除处理，首先将脂肪组织转入离心管中，加入质量分数为0.9％的氯化钠注射液洗涤，离心后分层，收集上层脂肪组织并用质量分数为0.9％的氯化钠注射液洗涤4-6次。
作为一种优选的方案，所述脂肪间充质干细胞分离与原代培养包括以下步骤：(1)用无血清培养体系重悬细胞，接种培养至恒温恒湿co2培养箱中；(2)24-48h后，观察细胞生长情况，若看到30％及以上的梭状细胞贴壁可进行半量换液；；(3)后续每隔2-3天全量换液；(4)培养至5-7天可观察到贴壁细胞融合度达到80％及以上，则可进行收获传代至工作库细胞冻存。
作为一种优选的方案，所述培养箱的条件为温度37℃、5％co2、湿度94～96％。
作为一种优选的方案，所述传代培养的传代完成的标志为细胞融合度达到80％。
作为一种优选的方案，所述干细胞冻存用的冻存保护液包括：dmso10v/v％-20v/v％、培养基40v/v％-50v/v％、人血清白蛋白40v/v％-50v/v％。
作为一种优选的方案，所述培养基无血清，包括基础培养基、重组胰岛素、重组生长因子、人血白蛋白、转铁蛋白。
作为一种优选的方案，所述基础培养基为低糖型dmem培养基、高糖型dmem培养基、无血清无酚红mem培养基中的一种。
作为一种优选的方案，所述干细胞质量检验项目包括：细胞形态、细胞数量、细胞活率、微生物检测、支原体、内毒素、病毒检测、端粒酶活性、细胞表型、str图谱、染色体核型、三系分化能力、免疫学反应。
作为一种优选的方案，所述病毒检测包括abo/rh血型分型、hla分型、hiv、hbv、hcv、tp检测。
有益效果：
(1)本发明提供了一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，可以将干细胞在深低温状态下长期保存，可以为临床细胞治疗提供良好的、充足的细胞来源。
(2)干细胞的冻存保护液包括40v/v％-50v/v％的人血白蛋白和dmso10v/v％-20v/v％，能够提高脂肪间充质干细胞冻存的存活稳定性和细胞复苏率，减少冻存过程中冰晶的形成，通过人血白蛋白和dmso协同作用可以减少细胞冻存和复苏过程中温度的剧烈变化对细胞的损害。
(3)干细胞的冻存保护液采用无血清培养基，不含有非人源的血清或蛋白，防止引入外源性污染和过敏原，避免引起不良反应，还能够提高冻存后脂肪间充质干细胞的活率，并保持良好的干细胞特性。
(4)采用重组胰岛素、人血白蛋白和转铁蛋白替代血清，能够保证脂肪间充质干细胞在冻存环境中的活性，维持细胞生长和增殖，同时加入了重组生长因子，在冻存过程中减少对细胞的损伤，保证细胞的存活率和复苏后细胞的分化能力。
(5)干细胞工作库的制备方法中包括干细胞的质量检验，通过对脂肪间充质干细胞入库前的全检，确保工作库细胞符合质量标准。
具体实施方式
结合以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可进一步地理解本发明的内容。除非另有说明，本文中使用的所有技术及科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本发明中提供的任何定义不一致，则以本发明中提供的术语定义为准。
在本文中使用的，除非上下文中明确地另有指示，否则没有限定单复数形式的特征也意在包括复数形式的特征。还应理解的是，如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义，“包括”、“包括有”、“具有”、“包含”和/或“包含有”，当在本说明书中使用时表示所陈述的组合物、步骤、方法、制品或装置，但不排除存在或添加一个或多个其它组合物、步骤、方法、制品或装置。此外，当描述本发明的实施方式时，使用“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。除此之外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
为了实现上述目的，本发明提供了一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，包括以下步骤：
(1)无菌采集人体脂肪；
(2)胶原酶消化；
(3)脂肪间充质干细胞分离与原代培养；
(4)脂肪间充质干细胞传代培养；
(5)脂肪间充质干细胞冻存；
(6)脂肪间充质干细胞质量检验；
(7)脂肪间充质干细胞入库。
在一些优选的实施方式中，在无菌环境下采集人体腹部皮下脂肪组织，然后进行油脂去除处理，首先将脂肪组织转入离心管中，加入质量分数为0.9％的氯化钠注射液洗涤，离心后分层，收集上层脂肪组织并用质量分数为0.9％的氯化钠注射液洗涤4-6次。
向脂肪组织中加入等体积的胶原酶消化，37℃水浴消化20-30min，加入等体积的完全培养基终止酶解消化，然后进行离心5-10min，移除上层清液和悬浮的残余组织，收集下层部分。
所述胶原酶是i型胶原酶，所述i型胶原酶的浓度为1～3wt.％，所述完全培养基为无血清培养基，所述无血清培养基的加入量是消化液体积的6～8倍。
在一些优选的实施方式中，脂肪间充质干细胞分离与原代培养包括以下步骤：(1)用无血清培养体系重悬细胞，接种培养至恒温恒湿co2培养箱中；(2)24-48h后，观察细胞贴壁情况，若看到30％及以上的梭状细胞贴壁可进行半量换液；(3)后续每隔2-3天全量换液；(4)培养至5-7天可观察到贴壁细胞融合度达到80％及以上，则可进行收获传代至工作库细胞冻存。
用于终止酶解消化和原代培养的无血清培养基与冻存液中所用的无血清培养基是同一种。
在一些优选的实施方式中，所述培养箱的条件为温度37℃、5％co2，湿度94～96％。
在一些优选的实施方式中，所述传代培养的传代完成标志为细胞融合度达到80％。
细胞融合度是指细胞贴壁并且完全舒展后，细胞生长面积占培养皿面积的百分比。
在一些优选的实施方式中，用于冻存的干细胞优选为p3～p5代的融合度为80～90％的脂肪间充质干细胞。
在一些优选的实施方式中，所述干细胞冻存用的冻存保护液包括：dmso10v/v％-20v/v％、培养基40v/v％-50v/v％、人血清白蛋白40v/v％-50v/v％。
一方面冻存保护液中加入40v/v％-50v/v％的人血白蛋白，它在细胞复苏过程中可以有效调节渗透压，维持细胞的活性；同时可在溶液形成冰晶之前，在细胞膜外部竞争性的结合细胞膜表面的水分子，从而降低细胞外溶液的电解质浓度，避免细胞会被溶质损伤；另一方面dmso属于小分子物质，容易穿透细胞膜，与细胞内溶液中的水分子发生水合作用，弱化水的结晶过程，减少冻存过程中冰晶的形成。然而dmso存在一定的毒性，与蛋白质疏水基团发生作用，导致蛋白质变性，因此本发明控制dmso的含量在10v/v％-20v/v％，且本体系中加入的人血白蛋白含量远大于dmso的含量，可以降低dmso对细胞的毒害，具有保护细胞的作用。在人血白蛋白和dmso的协同作用下，可以显著降低冻存过程中温度迅速下降与上升对脂肪间充质干细胞的损害，因此能够提高其冻存的存活稳定性和细胞复苏率。
在一些优选的实施方式中，所述培养基无血清，包括基础培养基，还包括以下组分：重组胰岛素、重组生长因子、人血白蛋白、转铁蛋白。
常用的细胞冻存液是由dmso和胎牛血清组成。胎牛血清(fbs)中含有异种蛋白质，它本身有携带细菌、病毒、蛋白传染性疾病或朊病毒的风险。另外，有研究表明干细胞在培养过程中可以吞噬培养基中的蛋白，内含有牛血清蛋白(7mg-30mg/108个细胞)，可以使受者体内产生抗牛蛋白抗体，引起免疫反应，从而导致患者尤其在重复输注间充质干细胞治疗后治疗失效。并且还会容易引起外源性污染，导致细胞形态变异，尤其是动物血清内具有潜在的动物源性内毒素或病毒，对人体健康构成较大的风险。本发明采用无血清培养基的冻存液，可以提高冻存后脂肪间充质干细胞的活率，并保持良好的干细胞特性。
采用重组胰岛素、人血白蛋白和转铁蛋白替代血清，能够实现含血清培养基相似的维持和促进细胞生长的功能。
通过基因重组表达制备的重组胰岛素，几乎不含杂质，不会在体内产生抗体，它能够抑制蛋白质和脂肪的分解，促进细胞生长，并且具有对细胞的抗凋亡作用。在培养基中加入人血白蛋白可以为复苏后的细胞生长提供所需的氨基酸类营养物质，以保证细胞的活性。
由于自由基对细胞膜、蛋白质具有较大的损伤作用，为避免脂肪间充质干细胞在冻存环境中自由基的产生，防止细胞受到伤害，本发明在冻存液的培养基中加入转铁蛋白，转铁蛋白通过与其在细胞表面的受体结合，将铁离子转运并释放到细胞内后，这些铁离子会与需铁蛋白结合，然后发挥维持细胞生长和增殖的作用，否则细胞内的需铁蛋白将无法获得铁离子，因而会失去活性，导致细胞生长停滞或死亡。
培养基中加入了重组生长因子，可以减少冻存过程中对细胞的损伤作用，并且对复苏后的脂肪间充质干细胞的生长、分化能力具有促进作用。
在一些优选的实施方式中，无血清培养基中组分浓度为：重组胰岛素2～9μg/ml、重组生长因子25～30μg/l、人血白蛋白4～6g/l、转铁蛋白4.5～9.8μg/ml。
更优选地，无血清培养基中组分浓度为：重组胰岛素5～8μg/ml、重组生长因子27～29μg/l、人血白蛋白4g/l、转铁蛋白5～7.5μg/ml。
在一些优选的实施方式中，所述基础培养基为低糖型dmem培养基、高糖型dmem培养基、无血清无酚红mem培养基中的一种，更优选地，所述基础培养基为无血清无酚红mem培养基。
在一些优选的实施方式中，所述干细胞质量检验包括：细胞形态、细胞数量、细胞活率、微生物检测、支原体、内毒素、病毒检测、端粒酶活性、细胞表型、str图谱、染色体核型、三系分化能力、免疫学反应。
在一些优选的实施方式中，所述病毒检测包括abo/rh血型分型、hla分型、hiv、hbv、hcv、tp检测，若以上各指标的检测结果呈现阴性，表明干细胞符合安全标准。
为了保证脂肪间充质干细胞工作细胞库的安全和成功制备，上述过程均在无菌环境下进行。
实施例1
本实施例提供了一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，包括以下步骤：
(1)无菌采集人体脂肪：在无菌环境下负压抽吸采集人体腹部皮下的脂肪组织，取10ml脂肪组织，将其置于50ml的离心管中，加入质量分数为0.9％的氯化钠注射液，400g/min离心5min，收集上层脂肪组织并用质量分数为0.9％的氯化钠注射液反复洗涤4次。
(2)胶原酶消化：向得到的脂肪组织加入1.5wt.％的i型胶原酶进行消化，在37℃下水浴25min，加入等体积的无血清培养基终止消化，然后400g/min离心7min，收集下层部分。
(3)脂肪间充质干细胞分离与原代培养：向消化得到的下层部分加入质量分数为0.9％的氯化钠注射液重悬经100μm滤网过滤，400g/min离心5min，得到细胞沉淀；用无血清培养体系重悬细胞，以细胞密度为1×105个/cm2接种至75cm2培养瓶中，将培养瓶放入37℃、湿度95％、5％co2的培养箱中培养；48h后，观察细胞贴壁情况，发现有30％以上的梭状细胞贴壁，则进行半量换液；后续每隔2-3天全量换液，培养至7天，用显微镜下观察细胞生长情况，发现贴壁细胞融合度达到80％以上，则进行消化传代培养。
(4)脂肪间充质干细胞传代培养：待细胞融合度达到80％时，则表明完成了一次传代，当完成p3传代后，取细胞原液进行细胞计数。
(5)脂肪间充质干细胞冻存：以冻存细胞浓度为1×107个/ml，计算预计冻存的细胞总体积，按冻存总体积向收获的脂肪间充质干细胞补足冻存保护液，混匀得到细胞悬液，将细胞悬液用移液管分装至冻存管中，每管3ml。将冻存标签贴在冻存管上，冻存标签包括细胞批号、细胞名称；先以1℃/min的速率降至-45℃下预冻3h，然后以0.5℃/min的速率降至-80℃保温5h，完成后转移至液氮环境中进行保存。
所述冻存保护液包括：dmso10v/v％、无血清培养基45v/v％、人血清白蛋白45v/v％，所述无血清培养基包括无血清无酚红基础培养基，按以下各成分的浓度加入对应的比例，重组胰岛素6μg/ml、vegf16528μg/l、人血白蛋白4g/l、转铁蛋白7μg/ml。
(6)脂肪间充质干细胞质量检验：冻存操作时，取p3代脂肪间充质干细胞上清、细胞悬液由质检部门检测，检测项目包括：细胞形态、细胞数量、细胞活率、微生物检测、支原体、内毒素、病毒检测、端粒酶活性、细胞表型、str图谱、染色体核型、三系分化能力、免疫学反应。
对p3代脂肪间充质干细胞进行病毒检测，包括abo/rh血型分型、hla分型、hiv、hbv、hcv、tp检测。
脂肪间充质干细胞质量检验的标准见表1。
表1
(7)脂肪间充质干细胞入库：由于微生物检测及病毒检测的结果会有滞后，在干细胞入库前将冻存的p3代脂肪间充质干细胞入暂存库，待得到所有检测结果并确认符合标准后，方可将细胞置于液氮罐中进行长期保存。
实施例2
本实施例提供了一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，包括以下步骤：
(1)无菌采集人体脂肪：在无菌环境下负压抽吸采集人体腹部皮下的脂肪组织，取15ml脂肪组织，将其置于50ml的离心管中，加入质量分数为0.9％的氯化钠注射液，400g/min离心5min，收集上层脂肪组织并用质量分数为0.9％的氯化钠注射液反复洗涤5次。
(2)胶原酶消化：向得到的脂肪组织加入1.5wt.％的i型胶原酶进行消化，在37℃下水浴30min，加入等体积的无血清培养基终止消化，然后400g/min离心7min，收集下层部分。
(3)脂肪间充质干细胞分离与原代培养：向消化得到的下层部分加入质量分数为0.9％的氯化钠注射液重悬经100μm滤网过滤，400g/min离心5min，得到细胞沉淀；用无血清培养体系重悬细胞，以细胞密度为1×105个/cm2接种至75cm2培养瓶中，将培养瓶放入37℃、湿度95％、5％co2的培养箱中培养；36h后，观察细胞贴壁情况，发现有30％以上的梭状细胞贴壁，则进行半量换液；后续根据细胞生长情况进行换液，培养至6天，用显微镜下观察细胞生长情况，发现贴壁细胞融合度达到80％以上，则进行消化传代培养。
(4)脂肪间充质干细胞传代培养：待细胞融合度达到80％时，则表明完成了一次传代，当完成p3传代后，取细胞原液进行细胞计数。
(5)脂肪间充质干细胞冻存：以冻存细胞浓度为1×107个/ml，计算预计冻存的细胞总体积，按冻存总体积向收获的脂肪间充质干细胞补足冻存保护液，混匀得到细胞悬液，将细胞悬液用移液管分装至冻存管中，每管3ml。将冻存标签贴在冻存管上，冻存标签包括细胞批号、细胞名称；先以1℃/min的速率降至-45℃下预冻3h，然后以0.5℃/min的速率降至-80℃保温5h，完成后转移至液氮环境中进行保存。
所述冻存保护液包括：dmso15v/v％、无血清培养基43v/v％、人血清白蛋白42v/v％，所述无血清培养基包括无血清无酚红基础培养基，按以下各成分的浓度加入对应的比例，重组胰岛素5μg/ml、vegf16527μg/l、人血白蛋白4g/l、转铁蛋白5.5μg/ml。
(6)脂肪间充质干细胞质量检验：冻存操作时，取p3代脂肪间充质干细胞上清、细胞悬液由质检部门检测，检测项目包括：细胞形态、细胞数量、细胞活率、微生物检测、支原体、内毒素、病毒检测、端粒酶活性、细胞表型、str图谱、染色体核型、三系分化能力、免疫学反应。
对p3代脂肪间充质干细胞进行病毒检测，包括abo/rh血型分型、hla分型、hiv、hbv、hcv、tp检测。
脂肪间充质干细胞的质量检验标准参照表1。
脂肪间充质干细胞入库：由于微生物检测及病毒检测的结果会有滞后，在干细胞入库前将冻存的p3代脂肪间充质干细胞入暂存库，待得到所有检测结果并确认符合标准后，方可将细胞置于液氮罐中进行长期保存。
实施例3
本实施例提供了一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，包括以下步骤：
(1)无菌采集人体脂肪：在无菌环境下负压抽吸采集人体腹部皮下的脂肪组织，取15ml脂肪组织，将其置于50ml的离心管中，加入质量分数为0.9％的氯化钠注射液，400g/min离心5min，收集上层脂肪组织并用质量分数为0.9％的氯化钠注射液反复洗涤4次。
(2)胶原酶消化：向得到的脂肪组织加入1.5wt.％的i型胶原酶进行消化，在37℃下水浴25min，加入等体积的无血清培养基终止消化，然后400g/min离心7min，收集下层部分。
(3)脂肪间充质干细胞分离与原代培养：向消化得到的下层部分加入质量分数为0.9％的氯化钠注射液重悬经100μm滤网过滤，400g/min离心5min，得到细胞沉淀；用无血清培养体系重悬细胞，以细胞密度为1×105个/cm2接种至75cm2培养瓶中，将培养瓶放入37℃、湿度95％、5％co2的培养箱中培养；48h后，观察细胞贴壁情况，发现有30％以上的梭状细胞贴壁，则进行半量换液；后续根据细胞生长情况进行换液，培养至6天，用显微镜下观察细胞生长情况，发现贴壁细胞融合度达到80％以上，则进行消化传代培养。
(4)脂肪间充质干细胞传代培养：待细胞融合度达到80％时，则表明完成了一次传代，当完成p3传代后，取细胞原液进行细胞计数。
(5)脂肪间充质干细胞冻存：以冻存细胞浓度为1×107个/ml，计算预计冻存的细胞总体积，按冻存总体积向收获的脂肪间充质干细胞补足冻存保护液，混匀得到细胞悬液，将细胞悬液用移液管分装至冻存管中，每管3ml。将冻存标签贴在冻存管上，冻存标签包括细胞批号、细胞名称；先以1℃/min的速率降至-45℃下预冻3h，然后以0.5℃/min的速率降至-80℃保温5h，完成后转移至液氮环境中进行保存。
所述冻存保护液包括：dmso20v/v％、无血清培养基40v/v％、人血清白蛋白40v/v％，所述无血清培养基包括无血清无酚红基础培养基，按以下各成分的浓度加入对应的比例，重组胰岛素8μg/ml、vegf16529μg/l、人血白蛋白4g/l、转铁蛋白7.2μg/ml。
(6)脂肪间充质干细胞质量检验：冻存操作时，取p3代脂肪间充质干细胞上清、细胞悬液由质检部门检测，检测项目包括：细胞形态、细胞数量、细胞活率、微生物检测、支原体、内毒素、病毒检测、端粒酶活性、细胞表型、str图谱、染色体核型、三系分化能力、免疫学反应。
对p3代脂肪间充质干细胞进行病毒检测，包括abo/rh血型分型、hla分型、hiv、hbv、hcv、tp检测。
脂肪间充质干细胞的质量检验标准参照表1。
脂肪间充质干细胞入库：由于微生物检测及病毒检测的结果会有滞后，在干细胞入库前将冻存的p3代脂肪间充质干细胞入暂存库，待得到所有检测结果并确认符合标准后，方可将细胞置于液氮罐中进行长期保存。
对比例1
本对比例提供了一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，与实施例1的区别在于所述冻存液的成分为：dmso25v/v％、无血清培养基45v/v％、人血清白蛋白30v/v％。
对比例2
本对比例提供了一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，与实施例1的区别在于所述无血清培养基中不含有重组生长因子vegf165。
细胞活性检测
将保存于液氮罐的细胞取出，转移至37℃水浴锅中进行迅速解冻，用移液管将细胞转入之前预温好的10ml完全培养基中，轻轻吹打混匀后，取1ml细胞悬液进行细胞计数和活性检测，检测结果见表2。
表2检测结果
由表2可知由本发明制备方法得到的脂肪间充质干细胞库，其中的脂肪间充质干细胞在复苏后的干细胞数量更接近冻存之前的干细胞的数量，可以很好地保持复苏后细胞的活性及存储稳定性，能够保证细胞的正常生长和增殖。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对本领域的技术人员来说，可根据上述说明加以改进和变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
1.一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)无菌采集人体脂肪；
(2)胶原酶消化；
(3)脂肪间充质干细胞分离与原代培养；
(4)脂肪间充质干细胞传代培养；
(5)脂肪间充质干细胞冻存；
(6)脂肪间充质干细胞质量检验；
(7)脂肪间充质干细胞入库。
2.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述无菌采集脂肪之后需要进行油脂去除处理，包括：首先将脂肪组织转入离心管中，加入质量分数为0.9％的氯化钠注射液，离心后分层，收集上层脂肪组织并用质量分数为0.9％的氯化钠注射液反复洗涤4-6次。
3.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述脂肪间充质干细胞分离与原代培养包括以下步骤：(1)用无血清培养体系重悬细胞，接种培养至恒温恒湿co2培养箱中；(2)24-48h后，观察细胞贴壁情况，若看到30％及以上的梭状细胞贴壁可进行半量换液；(3)后续每隔2-3天全量换液；(4)培养至5-7天可观察到贴壁细胞融合度达到80％及以上，则可进行收获传代至工作库细胞冻存。
4.根据权利要求3所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述培养箱的条件为温度37℃、5％co2，湿度94～96％。
5.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述传代培养的传代完成的标志为细胞融合度达到80％。
6.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述干细胞冻存用的冻存保护液包括：dmso10v/v％-20v/v％、培养基40v/v％-50v/v％、人血清白蛋白40v/v％-50v/v％。
7.根据权利要求6所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述培养基无血清，包括基础培养基、重组胰岛素、重组生长因子、人血白蛋白、转铁蛋白。
8.根据权利要求7所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述基础培养基为低糖型dmem培养基、高糖型dmem培养基、mem培养基中的一种。
9.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述干细胞质量检验项目包括：细胞形态、细胞数量、细胞活率、微生物检测、支原体、内毒素、病毒检测、端粒酶活性、细胞表型、str图谱、染色体核型、三系分化能力、免疫学反应。
10.根据权利要求9所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述病毒检测包括abo/rh血型分型、hla分型、hiv、hbv、hcv、tp检测。
技术总结