本发明涉及细胞培养增殖技术领域，尤其涉及一种间充质干细胞大规模培养方法。
背景技术：
间充质干细胞是来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我更新、多向分化、多方向分化潜能、造血支持以及免疫调控等特性的细胞，产生并释放营养性物质，通过旁分泌途径促进细胞修复及血管生成，在再生医学领域有重要作用。目前，主要从脂肪、骨髓、脐带、胎盘组织中提取间充质干细胞。间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，在一定条件下，间充质干细胞可以分化成多种功能细胞或组织器官，适用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复的种子细胞，为临床治疗各种疾病，如神经系统疾病、肾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等的治疗提供了新的途径。因此，对间充质干细胞进行体外培养，可以提供重要的医学材料。
现有技术中，间充质干细胞临床使用量较大，使用传统培养瓶培养，耗材消耗量太大，且所需人工成本也较大，难以控制细胞均一性。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服传统技术中存在的上述问题，提供一种间充质干细胞大规模培养方法。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：
一种间充质干细胞大规模培养方法，包括如下步骤：
1)将复苏的间充质干细胞接种于合适规格的t-flask中，待细胞生长至80％-90％时，pbs清洗1-2遍，使用重组胰酶将细胞消化为单细胞悬液，使用胰酶抑制剂终止消化，在800-1200rpm下离心3-7min，使用培养基重悬，然后按照1×105/ml的接种量接种于生物反应器罐体中载有预处理微载体的玻璃罐体；
2)间充质干细胞接种之后，通过生物反应器控制搅拌，搅拌3-7min，停止20-40min为一个循环，循环4-8次，然后正常搅拌；
3)根据每日罐体内葡萄糖消耗情况，调整灌流速率，保证罐内细胞一直处于最佳生长状态；
4)5-6天后，根据对细胞数量的要求，直接使用重组胰酶消化获取细胞，进行冻存或者直接应用；或者使用球传球工艺，转移到更大规模生物反应器中，进一步扩大细胞规模。
进一步地，如上所述间充质干细胞大规模培养方法，步骤1)中，终止消化后，在1000rpm下离心5min。
进一步地，如上所述间充质干细胞大规模培养方法，步骤1)中，玻璃罐体中预处理微载体的投放量为10-40g/l。
进一步地，如上所述间充质干细胞大规模培养方法，步骤1)中，玻璃罐体中投放的预处理微载体为solohill微载体。
进一步地，如上所述间充质干细胞大规模培养方法，步骤1)中，消化间充质干细胞所用胰酶为不含动物源的重组胰酶。
进一步地，如上所述间充质干细胞大规模培养方法，步骤1)中，终止间充质干细胞消化过程所用的为胰酶抑制剂。
进一步地，如上所述间充质干细胞大规模培养方法，步骤1)中，所述生物反应器为eppendorf-320生物反应器，生物反应器培养间充质干细胞期间的参数设置为：温度：37℃，ph：7.0-7.3，do：30％-60％，agit：40-80rpm。
进一步地，如上所述间充质干细胞大规模培养方法，步骤2)中，通过生物反应器控制搅拌，搅拌5min，停止30min为一个循环，循环6次，然后正常搅拌。
本发明的有益效果是：
本发明将干细胞制成单细胞悬液，接种于装有微载体的生物反应器中扩增。根据所需的细胞数量可以扩大细胞扩增规模，通过如500ml、5l、10l体积的生物反应器级联放大，最终获取所需数量细胞，扩增后的细胞可以进行冻存或者直接进行应用。本发明可在较短时间内获取大量高质量的干细胞，可用于实验研究、生产应用或其他作用。本发明操作简便，人力需求少，扩增效率高，干细胞生长状态好，对干细胞的大规模培养及应用具有重要意义。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上的所有优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为间充质干细胞的生长曲线图；
图2为流式细胞仪的检测结果图；
图3为正常msc细胞的示意图；
图4为成骨诱导后进行茜素红染色的示意图；
图5为成骨诱导后进行阿利新蓝染色的示意图；
图6为成脂诱导后进行油红染色的示意图；
图7为间充质干细胞在微载体上的生长示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、将复苏的间充质干细胞接种于合适规格的t-flask中，待细胞生长至80％-90％时，pbs清洗2遍，使用重组胰酶将细胞消化为单细胞悬液，使用胰酶抑制剂终止消化，1000rpm离心5分钟，使用培养基重悬，然后按照1×105/ml的接种量接种于生物反应器罐体中载有预处理微载体的玻璃罐体；
2、间充质干细胞接种之后，通过生物反应器控制搅拌，搅拌5分钟，停止30分钟为一个循环，循环6次，然后正常搅拌；
3、根据每日罐体内葡萄糖消耗情况，调整灌流速率，保证罐内细胞一直处于最佳生长状态；
4、6-7天后，根据对细胞数量的要求，可直接使用重组胰酶消化获取细胞，进行冻存或者直接应用，也可使用球传球工艺，转移到更大规模生物反应器中，进一步扩大细胞规模。
本实施例间充质干细胞的细胞生长情况如图1所示，由细胞生长曲线可知，本发明培养间充质干细胞过程中，细胞生长状态类似于标准“s”型曲线，细胞生长速率较快，扩增效率较高。
实施例2
免疫表型检测
收集使用实施例1中生物反应器扩增培养出的间充质干细胞，调整细胞浓度为1×106个/ml，加入抗体，室温避光孵育30min。孵育完成后，以1000rpm离心5min，弃去上清。每管加入2ml含1％胎牛血清的pbs，涡旋混匀，以1000rpm离心5min，弃去上清，每管加入0.5mlpbs涡旋混匀，1h内流式细胞仪上机检测。
流式细胞仪的检测结果如图2所示，流式细胞仪检测结果表示，使用生物反应器扩增培养出的间充质干细胞高表达cd90、cd105、cd73，不表达cd34、cd11b、cd19、cd45和hla-dr，符合间充质干细胞的表型特征，表面抗原表达无统计学差异(p>0.05)。
成骨分化性能实验
将使用生物反应器扩增培养出的间充质干细胞消化后，按1×103cells/cm2的接种量接种于六孔板中，加入改进培养基24h后，加入成骨/成软骨诱导培养基继续培养2-4周，每2-3天换液，培养结束后用茜素红染色法判断成骨细胞形成，阿利新蓝染色法鉴定软骨形成。
培养1周，细胞由纺锤形变为多角形，细胞周边出现丝状突出，并可向周围延伸，形态发生明显变化。培养2周以上，钙化斑，矿化物逐渐出现在细胞基质中，并且开始形成多层小结结构。图3为正常msc细胞，成骨诱导后，经茜素红染色，出现红染的钙结节，如图4所示；成软骨诱导后经阿利新蓝染色，出现蓝染的软骨细胞合成的蛋白多糖，如图5所示。表明使用生物反应器扩增培养出的间充质干细胞仍能保持良好的成骨分化潜能。
成脂肪分化性能实验
将使用生物反应器扩增培养出的间充质干细胞消化后，按1×103cells/cm2的接种量接种于六孔板中，加入改进的间充质干细胞大规模培养方法24h后，再加入成脂肪诱导培养基继续培养2-4周，每2-3天换液，培养结束后用油红染色鉴定脂肪滴形成。
培养3天，细细胞由纺锤形逐渐收缩变短，90％以上细胞成为立方形或多角形，形态发生明显变化；连续培养1周，微小脂肪滴出现于细胞中，并且脂肪滴随着培养时间的延长逐渐扩大、融合；培养2周，整个细胞被融合成团的脂肪滴充满。油红染色可见细胞内产生的脂肪被特异性染成红色，如图6所示。表明使用生物反应器扩增培养出的间充质干细胞仍能保持良好的成脂肪分化潜能。
本实施例培养的间充质干细胞在微载体上的生长情况如图7所示。本发明使用solohill微载体作为间充质干细胞贴壁吸附载体，为间充质干细胞提供大量的生长表面积，同时使用eppendorf-320生物反应器对细胞的整体生长过程进行控制，保证细胞时刻处于最佳生长状态；在较短时间内利用eppendorf-320生物反应器对间充质干细胞进行大规模扩增，从而获得大量具有临床使用价值的间充质干细胞，较大程度上保持间充质干细胞的干性；本发明实验过程操作简单，扩增效率高，人工成本大大降低。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
1.一种间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将复苏的间充质干细胞接种于合适规格的t-flask中，待细胞生长至80％-90％时，pbs清洗1-2遍，使用重组胰酶将细胞消化为单细胞悬液，使用胰酶抑制剂终止消化，在800-1200rpm下离心3-7min，使用培养基重悬，然后按照1×105/ml的接种量接种于生物反应器罐体中载有预处理微载体的玻璃罐体；
2)间充质干细胞接种之后，通过生物反应器控制搅拌，搅拌3-7min，停止20-40min为一个循环，循环4-8次，然后正常搅拌；
3)根据每日罐体内葡萄糖消耗情况，调整灌流速率，保证罐内细胞一直处于最佳生长状态；
4)5-6天后，根据对细胞数量的要求，直接使用重组胰酶消化获取细胞，进行冻存或者直接应用；或者使用球传球工艺，转移到更大规模生物反应器中，进一步扩大细胞规模。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于：步骤1)中，终止消化后，在1000rpm下离心5min。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于：步骤1)中，玻璃罐体中预处理微载体的投放量为10-40g/l。
4.根据权利要求1所述的间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于：步骤1)中，玻璃罐体中投放的预处理微载体为solohill微载体。
5.根据权利要求1所述的间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于：步骤1)中，消化间充质干细胞所用胰酶为不含动物源的重组胰酶。
6.根据权利要求1所述的间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于：步骤1)中，终止间充质干细胞消化过程所用的为胰酶抑制剂。
7.根据权利要求1所述的间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于：步骤1)中，所述生物反应器为eppendorf-320生物反应器，生物反应器培养间充质干细胞期间的参数设置为：温度：37℃，ph：7.0-7.3，do：30％-60％，agit：40-80rpm。
8.根据权利要求1所述的间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于：步骤2)中，通过生物反应器控制搅拌，搅拌5min，停止30min为一个循环，循环6次，然后正常搅拌。
技术总结