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本申请要求于2020年1月30日提交的申请序列号为62/967,672的美国专利申请的权益，其全部内容(包括任何表格、图片或附图)通过引用并入本文。
发明背景
体外受精(ivf)是辅助生殖技术中用于提高生育力的一项技术。从供体中收集成熟的卵母细胞和精子，然后在实验室中使卵母细胞受精。然后将受精卵植入回到供体的子宫。对人类卵母细胞的收集需要控制卵巢过度刺激和经阴道卵母细胞提取。受控的卵巢过度刺激主要涉及注射促性腺激素(诸如促卵泡激素)，然后在提取卵母细胞前36小时注射人类绒毛膜促性腺激素(hcg)。取决于各种方案，通常用促性腺激素激动剂或拮抗剂补充注射。在经阴道卵母细胞提取中，在超声引导下将针头插入通过阴道壁进入卵巢卵泡中。附着在针头上的抽吸装置收集卵泡液和卵母细胞。然后将收集的成熟卵母细胞用于ivf治疗和受精。需要这些程序才能获得更多数量的用于ivf和植入的受精卵。由于ivf的妊娠率低，通常在单次植入中转移多于两个的胚胎。ivf中多余的胚胎也可以冷冻保存以用于第二次植入尝试。
在当前的实践中，体内成熟卵母细胞仅用于ivf实践，而大多数医疗机构由于未成熟卵母细胞的受精潜力低而将其丢弃。这种实践对接受ivf治疗的年轻女性意义不大，因为在单轮受控卵巢过度刺激中可以提取到较多数量的成熟卵母细胞。但是，当高龄产妇(定义为35岁或以上)接受ivf治疗时，收集到的成熟卵母细胞的数量会大大减少，降低了ivf治疗后成功妊娠的机会。某些ivf程序利用体外成熟(ivm)作为替代疗法，但成功率低抑制了它成为常规程序。体外成熟是一种临床程序，用于处理未成熟胚泡(gv)期卵母细胞和减数分裂i(mi)期卵母细胞以发育为成熟的mii期卵母细胞。尽管ivm最近取得了进展，但ivm成熟卵母细胞的受精潜力仍然很低。因此，期望开发一种改进的体外成熟方法以利用gv和mi卵母细胞。
补充衰老细胞中细胞质物质的丢失可以逆转衰老的影响。实际上，已经报告了在衰老的卵母细胞中某些生物分子(诸如rna和蛋白质)的表达减少。除生物分子外，细胞组分数量和功能的减少也导致了衰老的卵母细胞产生不利的生殖结果。例如，线粒体是细胞的“动力源”，并且是卵母细胞成功受精的关键决定因素。它以atp的形式生成90％的细胞能量。线粒体在其他功能(诸如维持离子体内平衡和细胞凋亡)中也很重要。线粒体的能量生成能力在卵母细胞成熟和成功受精中至关重要，因为包括染色体分离和合子基因组激活在内的一些主要事件有赖于能量。因此，高质量的卵母细胞包含最佳的线粒体数量和足够水平的atp。由于线粒体功能下降，衰老是不孕的危险因素。一些研究将氧化应激增加与产妇年龄联系起来，并且氧化应激导致线粒体功能障碍。氧化应激通常与线粒体基因组内的突变相关联，其由于缺乏组蛋白而更容易受到损害。因此，线粒体功能通常会在高龄产妇的卵母细胞中受损。卵母细胞中的线粒体功能降低可导致减数分裂停滞和非整倍性，这将导致无法成功妊娠。
因此，线粒体是在辅助生殖技术中提高卵母细胞质量的主要目标。最新的方法包括原核转移和母纺锤体转移。两种方法都需要供体卵母细胞，并且可能引致线粒体基因组异质性。还描述了分离卵原干细胞(osc)源组合物(诸如无核细胞质或分离的线粒体)，随后将这样的材料手动注射到卵母细胞中。但是，osc的存在仍然是一个争论的话题。因此，迫切需要一种以无卵母细胞的非侵入性性质和使用经验证的细胞来源为特征的自体补充方法来提高卵母细胞的质量。本发明提供了一种非侵入性方法，该方法通过隧道纳米管将线粒体从成体干细胞转移至卵母细胞。
技术实现要素：
本发明描述了一种用于体外提高卵母细胞质量的新技术，该新技术极大地改善了多种妊娠结果，诸如成熟率、受精率和妊娠率。这项新技术包括通过隧道纳米管将生物分子和细胞组分从隧道纳米管形成细胞非侵入性转移到未成熟的或成熟的卵母细胞。
本发明涉及一种使卵母细胞在体外成熟的方法，包括：使用独特的培养方法，在卵母细胞成熟培养基中将未成熟卵母细胞与隧道纳米管形成细胞一起孵育。
在一些实施方式中，所述培养方法包括：使用包括细胞外基质的培养基。
在一些实施方式中，本发明的方法使得能够通过两个细胞之间的隧道纳米管将生物分子和细胞组分从细胞来源转移至卵母细胞，从而增加卵母细胞中生物分子和线粒体含量。
在特定的实施方式中，本发明的方法包括：在隧道纳米管形成细胞中过表达由kinesin-1重链基因(kif5b)编码的生物分子，以增加在细胞来源和卵母细胞之间形成的隧道纳米管的数量和质量，从而有效地转移生物分子和细胞组分。
在一些实施方式中，本发明的培养方法包括：在具有一定浓度的隧道纳米管形成细胞的悬滴中培养卵母细胞。
在另外的实施方式中，本发明提供了能够实现替代培养方法的微流体装置，该方法使得能够在供体细胞和卵母细胞之间转移最大的生物分子和细胞组分。
在一些实施方式中，本发明提供了一种由聚二甲基硅氧烷(pdms)制成的微流体装置，在该装置中，将卵母细胞与隧道纳米管形成细胞一起培养。在特定的实施方式中，本发明的微流体装置通过使隧道纳米管形成细胞与卵母细胞紧密接近来最大化细胞之间的隧道纳米管的形成。有利地，本发明的装置使得能够通过控制输入流速使卵母细胞和隧道纳米管形成细胞准确定位，从而最大程度地转移生物分子和细胞组分。
本发明还提供了一种用于按照大小和细胞特性分别从隧道纳米管形成细胞中分选卵母细胞的方法和装置。此外，本发明提供了用于体外成熟的方法，其允许在一个装置中培养多个卵母细胞并使所述多个卵母细胞暴露于隧道纳米管形成细胞，并且本发明提供了用于通过在微流体装置中使用隧道纳米管形成细胞来提高卵母细胞质量的方法。
附图说明
图1示出了包括在培养皿上倒置的悬滴的悬滴设置的示意图，以及包括具有卵母细胞(6)和隧道纳米管形成细胞(3)的约20μl培养基的悬滴培养物的截面图。
图2(a)示出了本发明的微流体装置的俯视图，其具有优选的通道和微通道，用于最大化隧道纳米管的形成。
图2(b)示出了具有通道和微通道的替代性微流体通道的俯视图，所述通道和微通道用于最大化用于多个隧道纳米管形成反应的隧道纳米管的形成。
图3示出了本发明的另一替代性微流体装置的俯视图，其具有优选的通道和微通道，用于最大化隧道纳米管的形成。
图4示出了本发明的装置的替代性微流体通道布局，其示出了用于卵母细胞捕获和细胞间相互作用的设计。
图5(a)示出了一系列z堆叠的激光共聚焦显微镜图像，其示出了生物分子和细胞组分通过隧道纳米管(tnt)从小鼠成体干细胞(mmsc)转移至小鼠胚泡(gv)卵母细胞。成体干细胞中的线粒体用线粒体示踪剂(mitotracker，线粒体跟踪器)标记。箭头显示线粒体正通过隧道纳米管被转移到小鼠卵母细胞中。
图5(b)示出了从小鼠成体干细胞(mmsc)转移生物分子和细胞组分后，小鼠卵母细胞的两个共聚焦显微镜图像。lc3自噬体蛋白用mcherry荧光蛋白标记。箭头显示lc3已通过隧道纳米管被转移到小鼠卵母细胞中。
图6以高放大倍数示出了小鼠成体干细胞(mmsc)、减数分裂ii小鼠卵母细胞和隧道纳米管(tnt)结构的两个扫描电子显微镜图像。
图7示出了不具有(gv)和具有生物分子和细胞组分转移(gv mmsc)以及用鱼藤酮(r)处理的细胞的卵母细胞的atp水平的示意图。
图8示出了概述不具有(gv)和具有生物分子和细胞组分转移(gv mmsc)以及用鱼藤酮(r)处理的细胞的卵母细胞的成熟率的示意图。
图9(a)示出了在注射小鼠gv卵母细胞和成体干细胞后立即拍摄的本发明的微流体隧道纳米管形成装置的显微图像。
图9(b)示出了显微图像，其示出了在本发明的微流体隧道纳米管形成装置中，生物分子和细胞组分从小鼠成体干细胞(mmsc)通过隧道纳米管(tnt)转移后，小鼠mii卵母细胞成功成熟。
图10示出了使用本发明的微流体装置通过补充有细胞外基质(gv(r) msc)的成体干细胞在生物分子和细胞组分转移之前和之后成熟率的提高的示意图。
图11以高放大倍数示出了小鼠月经血源细胞(mbdc)、小鼠卵母细胞和隧道纳米管(tnt)结构的两个扫描电子显微镜图像。
图12示出了利用隧道纳米管形成月经血源细胞(mbdc)或成体干细胞(ipsc-msc)提高经鱼藤酮处理的gv的成熟率的示意图。
具体实施方式
定义
卵母细胞
卵母细胞是指参与生殖的雌性生殖细胞。初级卵母细胞在胎期减数分裂前期i的双线期停滞。青春期后，大量的促黄体激素刺激减数分裂的恢复。在每个月经周期中，卵母细胞都会成熟。第一极体的挤出象征着卵母细胞的成熟而准备好受精。
在本发明的实施方式中使用的未成熟卵母细胞是处于发育期的卵母细胞，包括但不限于胚泡(gv)期卵母细胞、减数分裂i(mi)期卵母细胞和卵泡。在临床体外受精(ivf)治疗中，在受控卵巢过度刺激(cos)和经阴道卵母细胞提取期间，未成熟卵母细胞可能会与成熟卵母细胞一起被提取。卵母细胞也可以从尚未接受受控卵巢过度刺激的女性身上提取。
对于人类，cos的方案根据患者、医疗提供者和医疗机构而有所不同，但是通常包括但不限于：外源促性腺激素的给药和/或利用促性腺激素释放激素(gnrh)激动剂或拮抗剂的共同治疗。促性腺激素、gnrh激动剂和gnrh拮抗剂的方法、持续时间和剂量不是本发明的决定因素，并且在现有技术中有充分的文献记载。cos中使用的促性腺激素包括但不限于：人类绝经期促性腺激素(hmg)；具有促卵泡激素(fsh)或促黄体激素(lh)活性的泌尿系统产物；纯化的fsh(p-fsh)或高度纯化的fsh(hp-fsh)；或各种重组fsh(rfsh)和lh(rfsh/rlh)制剂。在ivf周期结束时，可以在提取卵母细胞之前的一定时间间隔内给药人类绒毛膜促性腺激素(hcg)或gnrh激动剂或其他替代物。在cos中收集的卵母细胞可以用于本发明的实施方式中。
生物分子和细胞组分
生物分子和细胞组分是指存在于细胞和活生物体中的分子和离子。生物分子和细胞组分包括由多于一种类型的生物分子组成的核酸、蛋白质、磷脂、碳水化合物、离子、流体或细胞组分。例如，线粒体包含生物分子，其包括但不限于：线粒体dna、rna、磷脂膜、线粒体蛋白和碳水化合物。生物分子和细胞组分可以由细胞内源性地合成，也可以从外部来源外源性地引入；因此，其可以天然存在或被修改。外部来源包括但不限于：培养基补充、转染和胞吞作用。
在一些实施方式中，生物分子和细胞器从一个细胞被转移到另一个细胞。这些生物分子和细胞器包括但不限于：核酸、蛋白质和线粒体。它们可以通过各种机制被转移，包括但不限于隧道纳米管。生物分子和细胞器可以改变或可以不改变受体细胞。
隧道纳米管形成细胞
隧道纳米管形成细胞是指能够将线粒体、生物分子和细胞组分(包括但不限于肽和激素)转移到另一个细胞的细胞类型。隧道纳米管是由微管和微丝组成的结构，其从一个细胞突出到另一个细胞。通过隧道纳米管连接的细胞可以不是同一类型。隧道纳米管形成细胞包括但不限于：哺乳动物成体干细胞、诱导的多能干细胞和月经血源细胞。
成体干细胞
成体干细胞是指哺乳动物中存在的未分化细胞，其具有分化成不同细胞类型的潜力，同时能够自我更新。实例包括：造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、上皮干细胞、脂肪干细胞和皮肤干细胞。在正常生理条件下，成体干细胞大多处于休眠状态。糖酵解代谢是成体干细胞中关键的能量产生途径，从而保护细胞免受活性氧簇(ros)和线粒体损害。
诱导的多能干细胞
诱导的多能干细胞是指通过诱导基因或因子从体细胞重新编程的多能干细胞的类型。实例包括一种或多种山中因子的基因组整合，包括但不限于：oct4、sox2、klf4和c-myc。
月经血源细胞
月经血源细胞是指从人类月经血中分离的细胞群。这些细胞可以通过附着在培养板上而被提取，并通过荧光激活细胞分选被进一步选择。可以在收集月经血后溶解红细胞。密度梯度离心可以用于收集能够形成隧道纳米管的细胞群。
培养前的卵母细胞处理
未成熟卵母细胞在培养前要经过处理。一些未成熟卵母细胞被卵丘包围，卵丘也称为卵丘-卵母细胞复合体。例如，可以通过在磷酸盐缓冲盐水或培养基中使用透明质酸酶剥露卵母细胞或与其他细胞组分分离。机械剥离也可以用于促进剥露。
悬滴培养
悬滴培养是指3d悬滴培养，其包括从倒置表面悬挂的具有细胞或组织的培养基液滴。
小型培养系统
小型培养系统是指内部总体积和培养基少于20μl的微型体积培养系统。
微流体装置
微流体装置是指亚毫米级的装置，其为细胞培养和生长提供精确的流体操纵和受控的环境。微流体装置内的细胞受外部环境的影响较小，并且批次之间的差异较小。此外，由于其亚毫米级，微流体装置使在细胞间接触设置中所使用的细胞数量最小化。本发明的微流体装置是一种特定的亚毫米级装置，其特征在于微通道的特定布置，所述微通道的特定布置适于使隧道纳米管形成细胞与卵母细胞之间的细胞间接触最大化。
本发明提供了用于使用非侵入性技术从未成熟的和成熟的卵母细胞生成具有受精能力的卵母细胞的方法和装置。
本发明还提供了用于使未成熟卵母细胞体外成熟的方法和装置。有利地，本发明的方法和装置允许将生物分子和细胞组分(包括但不限于整个线粒体)非侵入性地转移至未成熟的和成熟的卵母细胞，并通过抑制通常与常规显微注射和电融合方法相关联的卵母细胞死亡来保持卵母细胞的质量和功能。
在一些实施方式中，本发明的方法包括：使用非创伤性生物分子转移方式将生物分子(包括但不限于核酸、蛋白质、磷脂、碳水化合物、离子和流体)转移至卵母细胞。可用于本发明的生物分子可以由细胞内源性地合成或从外部来源外源性地引入。
在一些实施方式中，本发明的方法包括转移细胞组分，包括但不限于：细胞核、核糖体、内质网、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、分泌性囊泡、微丝和微管。
在本发明的方法和装置中所使用的卵母细胞可以是任何哺乳动物生物的卵母细胞，包括但不限于：人类、小鼠、大鼠、猿、黑猩猩、猩猩、猴子、狗、猫、豚鼠、仓鼠、兔子、雪貂、牛、马、山羊和绵羊。在优选的实施方式中，卵母细胞来源于人类。在另外的优选实施方式中，卵母细胞以及生物分子和细胞组分来自相同物种。在另外的优选实施方式中，生物分子和细胞组分来自同一个体。
在本发明的方法中所使用的成体干细胞包括但不限于：造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、上皮干细胞、脂肪干细胞和皮肤干细胞。在一些实施方式中，月经血源细胞在本发明的方法中用作生物分子和细胞组分以及隧道纳米管形成细胞的供体细胞。
在本发明的方法和装置中所使用的成体干细胞可以是任何哺乳动物生物的成体干细胞，包括但不限于：人类、小鼠、大鼠、猿、黑猩猩、猩猩、猴子、狗、猫、豚鼠、仓鼠、兔子、雪貂、牛、马、山羊和绵羊。在优选的实施方式中，成体干细胞来源于人类。在另外的优选实施方式中，成体干细胞和卵母细胞来自相同物种。在另外的优选实施方式中，成体干细胞、卵母细胞以及生物分子和细胞组分来自相同物种。在另外的优选实施方式中，成体干细胞、卵母细胞以及生物分子和细胞组分来自同一个体。
在本发明的方法和装置中所使用的月经血源细胞可以是任何哺乳动物生物的月经血源细胞，包括但不限于：人类、小鼠、大鼠、猿、黑猩猩、猩猩、猴子、狗、猫、豚鼠、仓鼠、兔子、雪貂、牛、马、山羊和绵羊。在优选的实施方式中，月经血源细胞来源于人类。在另外的优选实施方式中，月经血源细胞和卵母细胞来自相同物种。在另外的优选实施方式中，月经血源细胞、卵母细胞以及生物分子和细胞组分来自相同物种。在另外的优选实施方式中，月经血源细胞、卵母细胞以及生物分子和细胞组分来自同一个体。
在一些实施方式中，本发明的方法中所使用的卵母细胞是在受控卵巢刺激后从哺乳动物获得的。在一些实施方式中，不需要受控卵巢刺激，因为可以使用本发明的方法和装置采集未成熟卵母细胞并使其成熟。在这种情况下，无需给药促性腺激素、gnrh激动剂或拮抗剂即可完成从哺乳动物提取卵母细胞。在一些实施方式中，可以在提取卵母细胞之前仅给药hcg。
在一些实施方式中，本发明的方法中所使用的卵母细胞是在ivf程序期间从哺乳动物提取的未成熟卵母细胞，并且由于其不成熟而被指定丢弃。
在一些实施方式中，使用本发明的方法和装置，将成体干细胞和/或月经血源细胞用作被转移至卵母细胞的生物分子和细胞组分的来源。
在优选的实施方式中，成体干细胞用于自体生物分子和细胞组分转移并提高了卵母细胞质量。可用于本发明方法的成体干细胞可以从各种来源(包括但不限于：外周血、骨髓、脂肪组织、牙髓、脐带血、月经血和胎盘)被分离。成体干细胞也可以来源于外周血单核细胞。
在优选的实施方式中，使用包含抗凝剂的试管(包括但不限于肝素和涂覆有edta的试管)从具有自体卵母细胞的雌体收集外周血。用红细胞溶解缓冲液处理外周血，并使用密度梯度(包括但不限于：ficoll-paque和hitopaque梯度)将全血分为不同的部分。离心后将单核细胞层转移至培养皿中，并且在包含各种组分(包括但不限于：10-20％的胎牛血清、自体血清、人类血清白蛋白、合成血清替代物和/或合并的人类血小板裂解液)的培养基中培养单核细胞。每2-3天更新一次培养基，直到达到细胞融合为止。
在替代性实施方式中，从具有自体卵母细胞的雌体的左髂嵴中抽出骨髓。在包含各种组分(包括但不限于：10-20％的胎牛血清、自体血清、人类血清白蛋白、合成血清替代物和/或合并的人类血小板裂解液)的培养基中的培养皿上培养从骨髓收集的细胞。每2-3天更新一次培养基，直到达到融合为止。
在另外的替代性实施方式中，人类皮下脂肪组织是通过抽脂术从具有自体卵母细胞的雌体获得的。通过附着至培养板，从脂肪基质血管部分分离出脂肪组织干细胞。每2-3天更新一次包含各种组分(包括但不限于：10-20％的自体血清、人类血清白蛋白、合成血清替代物、胎牛血清和/或合并的人类血小板裂解液)的培养基，直到达到细胞融合为止。
有利地，可以在将自体和/或异体生物分子和细胞组分转移至卵母细胞之前将使用本发明的方法分离的成体干细胞冷冻保存在液氮中。将冷冻保存的干细胞解冻，并在标准的培养基和条件下重新培养。
在优选的实施方式中，将隧道纳米管形成细胞以球体注射。球体是经由细胞外基质形成的多细胞细胞聚集体，所述细胞外基质通过整联蛋白结合将单个细胞连接在一起。与相同类型的单细胞悬液相比，细胞球体通常具有较大的表面积。较大的表面积促进了隧道纳米管形成细胞与卵母细胞之间的接触。另外，可以在球体的细胞之间形成隧道纳米管，因此，增加了在隧道纳米管形成细胞和卵母细胞之间形成隧道纳米管的成功率，从而提高了卵母细胞质量。
在一些实施方式中，使用本发明的方法，在添加一个或多个卵母细胞以提高卵母细胞质量之前，将细胞外基质(包括但不限于胶原蛋白iv)添加至隧道纳米管形成细胞培养物中。培养方法根据特定的细胞类型而在不同类型的隧道纳米管形成细胞之间变化。在一些实施方式中，使用在成体干细胞和/或月经血源细胞的细胞培养中有用的细胞外基质。技术人员可以选择适合于相应的成体干细胞和/或月经血源细胞的细胞外基质。在一些实施方式中，在注入本发明的装置中之前，将细胞用胰蛋白酶消化并在包含细胞外基质的培养基中培养。培养的持续时间各不相同，并且会引致不同的球体形状和大小。在一些实施方式中，在包括1mg/ml胶原蛋白iv的培养基中培养隧道纳米管形成细胞20分钟。通常，细胞外基质的浓度与培养时间可以成反比。例如，胶原蛋白iv的浓度可以为约1μg/ml的低量到约100mg/ml的高量。在一些实施方式中，细胞外基质的浓度可以为约2μg/ml、约5μg/ml、约10μg/ml、约20μg/ml、约50μg/ml、约100μg/ml、约200μg/ml、约500μg/ml、约1mg/ml、约2mg/ml、约5mg/ml、约10mg/ml、约20mg/ml、约50mg/ml、至约100mg/ml。
隧道纳米管形成细胞在细胞外基质中的培养时间可以为低至5分钟到高至约1周。在一些实施方式中，培养时间可以为约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约5小时、约8小时、约10小时、约12小时、约18小时、约1天、约1.5天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天至约1周。
在一些实施方式中，本发明的成体干细胞和/或月经血源细胞用携带kif5b基因的载体转染。kif5b基因转移到这些细胞会引致kif5b蛋白的过表达，其参与生物分子和细胞组分的分布和运输。有利地，在成体干细胞和月经血细胞中kif5b蛋白的过表达会引致在成体干细胞和月经血源细胞中形成隧道纳米管。同样，在成体干细胞和月经血细胞中kif5b蛋白的过表达增加了由成体干细胞和月经血源细胞形成的隧道纳米管的数量。
在替代性实施方式中，通过增加成体干细胞和月经血源细胞中kif5b蛋白的表达，增加了生物分子和细胞组分(包括但不限于转移至卵母细胞的线粒体)的数量。有利地，在kif5b过表达后增强的生物分子和细胞组分转移之后的卵母细胞质量显著提高。在一些实施方式中，通过转染包含表达载体的质粒来过表达kif5b蛋白，所述表达载体包括kif5b基因的序列。编码kif5b蛋白的基因可以来自任何哺乳动物和非哺乳动物生物。在优选的实施方式中，kif5b基因是哺乳动物基因。在另外的优选实施方式中，kif5b基因是人类基因。本领域中记载的基因的克隆和转染方法和蛋白质的过表达方法可以在本发明的方法中使用，并且本文中不再详细描述这些方法。在一些实施方式中，使用显微注射或其他蛋白质注射技术将kif5b蛋白补充至成体干细胞。
在一些实施方式中，提供了用于生成隧道纳米管形成细胞的方法和装置。在特定的实施方式中，提供了诱导成体干细胞和/或月经血源细胞成为隧道纳米管形成细胞的培养条件和培养装置。在优选的实施方式中，生成的隧道纳米管形成细胞有效地将生物分子和细胞组分转移至卵母细胞。
在特定的实施方式中，将未成熟卵母细胞与包围每个卵母细胞的卵丘细胞一起培养，也称为卵丘-卵母细胞复合体。在一些实施方式中，通过在磷酸盐缓冲盐水或培养基中使用透明质酸酶将卵母细胞剥露或与其他细胞组分分离。在一些实施方式中，使用机械剥离来促进剥露。
在一些实施方式中，将卵母细胞与包围卵母细胞的透明带一起培养。在其他实施方式中，使用各种方法去除卵母细胞的透明带，包括但不限于：机械剥离、酸性台式液、激光处理或在培养基中用链霉蛋白酶处理。有利地，透明带的去除可以增加通过较紧密的细胞间接触从隧道纳米管形成细胞转移至卵母细胞的生物分子和细胞组分的数量。
用于卵母细胞和隧道纳米管形成细胞的培养条件包括但不限于：在大气为95％co2为5％的潮湿条件中于37℃下进行培养，并且包括但不限于：在培养物周围添加磷酸盐缓冲盐水，以及可选地可以用矿物油覆盖培养物。
用于卵母细胞和隧道纳米管形成细胞的培养基根据细胞的供体和细胞条件而变化。单个培养基系统或顺序培养基系统可以用于卵母细胞培养以提高卵母细胞质量。本发明的卵母细胞培养基包含的组分包括但不限于：盐、必需氨基酸和非必需氨基酸、以及能量源(诸如葡萄糖)。通常用于卵母细胞培养的培养基和培养条件也可以在本发明的方法中被采用。
在一些实施方式中，本发明的培养基包含一种或多种激素。在优选的实施方式中，本发明方法中所使用的激素促进哺乳动物卵母细胞的成熟并增加其发育能力，并且包括但不限于：促性腺激素，诸如促卵泡激素(fsh)、促黄体激素(lh)、人类绝经期促性腺激素(hmg)和人类绒毛膜促性腺激素(hcg)。在一些实施方式中，hmg和hcg可以分别代替fsh和lh。在优选的实施方式中，根据细胞质量、培养时间、增殖状态和来源物种来调节激素的浓度。本发明的培养基还包含血清补充物，包括但不限于：血清白蛋白、对培养细胞的生长必不可少的各种生长因子。在一些实施方式中，使用胎牛血清(fbs)和来自相同物种的其他个体的血清或来自其他物种的血清。在优选的实施方式中，在本发明的方法中使用非动物替代物，包括但不限于：重组人血清白蛋白或人类患者自身的血清。在另外的优选实施方式中，在本发明的方法中所使用的培养基中补充了人类患者的10％热灭活血清。
在一些实施方式中，本发明方法的培养基包含细胞外基质。细胞外基质(ecm)是一种非细胞组分，其包含多糖、生长因子和蛋白质。ecm充当细胞和组织之间的结构支撑，并且在细胞间相互作用和生化支撑中是很重要的。在本发明的特定实施方式中，向细胞培养物中添加ecm会形成类似于体内环境的环境并促进细胞生长。在一些实施方式中，将细胞外基质蛋白(包括但不限于：胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白)添加至培养基。在一些实施方式中，将两种或更多种类型的细胞外基质蛋白添加至培养基。在优选的实施方式中，将低浓度的细胞外基质蛋白添加到培养基中，同时将培养基保持为液体形式而不是凝胶形式以促进提取。在另外的优选实施方式中，在本发明的培养基中添加约1.5mg/ml的i型胶原蛋白。在另外的实施方式中，将胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白和/或层粘连蛋白添加至细胞培养基，其低至0.1mg/ml到高至20mg/ml，或者为约0.2mg/ml至约18mg/ml；约0.4mg/ml至约16mg/ml；约0.6mg/ml至约14mg/ml；约0.8mg/ml至约12mg/ml；约1.0mg/ml至约10mg/ml；约1.2mg/ml至约8mg/ml；约1.4mg/ml至约6mg/ml；约1.6mg/ml至约4mg/ml；约1.8mg/ml至约4mg/ml；或约2mg/ml至约3mg/ml。
参考图1，其示出了本发明，本发明提供了一种悬滴培养方法以提高卵母细胞质量。例如，通过使用隧道纳米管形成细胞将生物分子和细胞组分有效转移至卵母细胞，在悬滴培养中提高了卵母细胞质量。本发明的三维悬滴培养物包括从倒置表面悬挂的包括细胞和/或组织的培养基液滴。在一些实施方式中，在小液滴2中培养卵母细胞(6)和隧道纳米管形成细胞(3)，使得悬滴使培养基的表面积与体积之比最小，从而减少了培养基的蒸发，并且提供了卵母细胞和隧道纳米管形成细胞的紧密接近，以有效形成隧道纳米管。有利地，悬滴允许卵母细胞和隧道纳米管形成细胞由于重力而聚集在液滴的中间，从而使细胞之间的接触最大化，并且使生物分子和细胞组分通过隧道纳米管形成成体干细胞和月经血源细胞的纳米管的转移最大化。
在优选的实施方式中，培养基的液滴具有限定的体积，包括补充的ecm蛋白、血清和/或激素，并在塑料培养板上倒置。例如，液滴的体积可以为低至约0.1μl/滴到高至约200μl/滴。液滴体积还可以为约0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl、0.6μl、0.7μl、0.8μl、0.9μl和1μl至约150μl、160μl、170μl、180μl和190μl，以及约1.2μl至约145μl、约1.5μl至约140μl、约1.7μl至约135μl、约2μl至约130μl、约2.5μl至约125μl、约3μl至约120μl、约3.5μl至约115μl、约4μl至约110μl、约4.5μl至约105μl、约5μl至约100μl、约6μl至约95μl、约9μl至约90μl、约10μl至约85μl、约11μl至约70μl、约12μl至约65μl、约13μl至约60μl、约14μl至约55μl、约15μl至约50μl、约16μl至约45μl、约17μl至约40μl、约18μl至约35μl、约19μl至约30μl、约20μl至约25μl。在优选的实施方式中，液滴体积为约10μl至约60μl、约15μl至约50μl、或约20μl至约45μl。在另外的优选实施方式中，液滴体积为约10μl至约40μl。在最优选的实施方式中，液滴体积为20μl。
在另外的优选实施方式中，液滴包括一个或多个卵母细胞和约1至50000个隧道纳米管形成细胞(tnfc)。在更优选的实施方式中，液滴包括1000至10000个隧道纳米管形成细胞；在甚至更优选的实施方式中，液滴包括4000至6000个隧道纳米管形成细胞。
在一些实施方式中，液滴包括一个或多个卵母细胞，并且为约1个tnfc、2个tnfc、4个tnfc、6个tnfc、8个tnfc、10个tnfc、15个tnfc、20个tnfc、25个tnfc、30个tnfc、40个tnfc、50个tnfc至约10000个tnfc、15000个tnfc、20000个tnfc、25000个tnfc、30000个tnfc、35000个tnfc、40000个tnfc和50000个tnfc。在一些实施方式中，液滴包括一个或多个卵母细胞以及约500至约45000个tnfc、约1000至约40000个tnfc、约1500至约35000个tnfc、约2000至约30000个tnfc、约2500至约25000个tnfc、约3000至约20000个tnfc、约3500至约15000个tnfc、约4000至约10000个tnfc、约4500至约8000个tnfc、约5000至约6000个tnfc、或者所述范围涵盖的以及在所述范围之间的任何数量的tnfc。
在一些实施方式中，悬滴在培养皿1上倒置。在替代性实施方式中，培养皿涂覆有材料以促进卵母细胞和tnfc附着，所述材料包括但不限于：细胞外基质、细胞附着分子、琼脂。在优选的实施方式中，培养皿1的底部包括限定体积的培养液以抑制培养基液滴的蒸发，包括但不限于：磷酸盐缓冲盐水、0.9％nacl、或其他细胞相容性液体。
在一些实施方式中，本发明的方法和装置提供了小型培养系统。在一些实施方式中，小型培养系统包括微型体积培养系统，在一些实施方式中，所述微型体积培养系统包括小于20μl的内部总体积和培养基。例如，小型细胞培养系统的体积可以为低至约0.1μl到高至约100μl。体积还可以为约0.2μl、0.4μl、0.6μl、0.8μl、1μl、1.2μl、1.5μl、2μl和2.5μl至约95μl、90μl、85μl、80μl和75μl，以及约0.2μl至约50μl、约0.4μl至约45μl、约0.6μl至约40μl、约0.8μl至约35μl、约1μl至约30μl、约1.2μl至约25μl、约1.4μl至约20μl、约1.4μl至约18μl、约1.6μl至约16μl、约1.8μl至约14μl、约2μl至约12μl、约2.2μl至约10μl、约2.4μl至约8μl、约2.5μl至约6μl、以及约0.1μl至约5μl、约0.2μl至约4.5μl、约0.4μl至约4.5μl、约0.6μl至约4μl、约0.8μl至约3.5μl、约1μl至约3μl、约0.5μl至约1.5μl、约0.75μl至约1.25μl、或约1μl。
在优选的实施方式中，小型培养体积为约0.1μl至约5μl。在另外的优选实施方式中，小型培养体积为约1μl。
有利地，本发明的小型培养系统允许卵母细胞与一个或多个隧道纳米管形成细胞之间紧密接触并且使培养基的浪费最小化。本发明的小型培养系统包括但不限于：开放系统，包括但不限于基于悬滴和基于液滴的细胞培养系统；以及封闭系统，包括但不限于微流体。
在一些实施方式中，提供微流体装置以通过从隧道纳米管形成细胞转移自体生物分子和细胞组分来提高卵母细胞质量。微流体装置通常是指提供精确的流体操纵的亚毫米级装置。其可以用于生物学和医学应用，并为细胞培养和生长提供受控环境。有利地，本发明的微流体装置内的细胞受外部环境的影响较小，并且批次间的差异较小。由于微流体装置通常是微升级的，因此微流体装置可使在本发明中所使用的隧道纳米管形成细胞和培养基的数量最小化。
在特定的实施方式中，本发明的微流体系统由各种材料制成，包括但不限于聚二甲基硅氧烷(pdms)和聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)。可以想到将适合于制造微流体装置的任何材料用来制造本发明的微流体装置。
在优选的实施方式中，使用清洁且透明的材料以允许实时监测卵母细胞在该实施方式中的时期和状况。可以使用标准的光刻技术，然后通过浇铸和固化聚合物来制造本发明的微流体装置。在优选的实施方式中，使用软光刻技术，然后通过浇铸和固化pdms预聚物来制造微流体装置。su-83025可以用作pdms聚合物，方法是将10:1的碱与固化剂混合，然后在60-70℃下固化以制造微流体芯片。可以使用2:1的碱与固化剂的pdms聚合物将本发明的微流体芯片附着到盖玻片上，并且优选地在170℃下在加热板上加热。固化温度和碱与固化剂的比例可以根据使用者的需要而改变。
在优选的实施方式中，本发明的微流体装置包括至少两个连接到封闭空间的开口。在另外的优选实施方式中，微流体装置中的封闭空间的体积使得其优选地为卵母细胞成熟保持足够的培养基，同时又足够小以促进卵母细胞和一个或多个隧道纳米管形成细胞之间的紧密的细胞间接触。有利地，本发明的微流体装置允许精确的流体操纵和对环境的精确控制，以实现最佳的细胞培养和生长。此外，与在常规培养条件下的情况相比，微流体装置内的细胞受外部环境的影响较小，并且所培养的细胞的批次间差异较小。在一些实施方式中，本发明的微流体装置具有直径为约100μm至约2mm且高度为约10μm至200μm的封闭空间。在一些实施方式中，本发明的微流体装置的封闭空间的直径为约120μm、约140μm、约160μm、约180μm、约200μm至约1.6mm、1.8mm、2mm，并且高度为约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约35μm、约40μm至约100μm、约120μm、约140μm、160μm、约180μm或约200μm。在优选的实施方式中，微流体装置的封闭空间的直径为约100μm至约1.5mm、或约150μm至约1.2mm，并且高度为约20μm至约180μm、或30μm至约160μm。在另外的优选实施方式中，微流体装置的封闭空间的直径为约200μm至约1mm，并且高度为约40μm至约150μm。
在优选的实施方式中，选择本发明的微流体装置的尺寸以适应所使用的隧道纳米管形成细胞和卵母细胞的条件和体积。封闭空间的形状各不相同。在一些实施方式中，封闭空间为立方体、长方体、圆柱体、圆锥体、四面体、三棱柱、四棱锥、八面体、十二面体、二十面体、六角棱柱、六角棱锥、五角棱柱、五角棱锥、八角棱柱或椭球体。在优选的实施方式中，本发明的微流体装置的封闭空间是圆柱体。
在一些实施方式中，培养系统的表面可以用胶原蛋白涂覆。胶原蛋白可以涂覆在板、膜或适合于细胞培养的任何表面上。胶原蛋白的浓度或数量可以根据细胞状态、培养系统表面或其他因素而变化。胶原蛋白涂层可以为细胞提供更好的附着和生长，从而可以提高卵母细胞的质量和成熟度。
参考图2(a)，其示出了本发明的微流体隧道纳米管形成装置的优选实施方式的俯视图，该装置用于在一个或多个卵母细胞与隧道纳米管形成细胞之间转移自体生物分子和细胞组分。微流体隧道纳米管形成装置包括：一个或多个通道(11)；包括多个微通道的微通道系统(13)；以及至少一个反应室(12)。在通道(11)中，可以放置至少一个卵母细胞并使其流向保留或安置所述至少一个卵母细胞的反应室(2)。
期望地，活细胞(包括但不限于卵母细胞和隧道纳米管形成细胞)不附着至微流体装置的通道(11)、反应室(12)和/或微通道系统(13)，制成所述微流体装置的材料包括但不限于聚二甲基硅氧烷。相反，活细胞在通道和微通道系统内的流体或培养基中安置或自由流动。这样的微环境更好地模仿了体内环境。例如，胚胎在体内从输卵管迁移到子宫，而不会附着至输卵管的侧面。在本发明的一些实施方式中，较大的细胞(诸如卵母细胞)沉入装置的通道和/或腔室的底部而不附着至所述通道和/或腔室。因此，装置内的较大细胞的运动可能需要流体动力学控制，使得流体流使通道和/或腔室内的较大细胞运动。尽管本发明的微流体装置可以由通常用于制造细胞培养装置的任何材料制成，但是用于制造本发明的微流体装置的优选材料是不允许细胞附着于其表面的材料。然而，如果隧道纳米管形成细胞附着至微流体装置的材料，则可以使用胰蛋白酶或本领域已知的其他细胞解离方法从所述表面去除细胞。
在图2(a)的实施方式中，至少一个入口位于通道(11)的前端。在优选的实施方式中，入口的大小通常大于流体操纵装置的直径，诸如，例如，微量移液管的尖端或调节手柄的直径。入口的大小取决于用于注射和操纵细胞和培养基的材料和试管，并被配置为与流体操纵装置紧密配合，以允许流体和细胞进入通道(11)并避免所述流体和细胞由于阻力较低而从入口流出。通道的入口可以与通道的方向相同，也可以朝顶部倾斜以便于操作。在优选的实施方式中，为了更容易使用冲孔生产，使用了进入通道的具有90度弯角的垂直入口，因此，入口的形状通常是圆柱形的。在其他实施方式中，诸如当从侧面产生入口时，使用具有远离通道(11)的较宽端部的“v”形，以促进处理具有或不具有细胞的培养基和将其添加到系统中。
在一些实施方式中，通道(11)从入口连接(可选地通过泵0)到反应室(12)和微通道系统(13)。通道的高度和宽度根据系统中所使用的细胞的大小而变化。通道的尺寸可以根据使用者的要求而改变，例如，一个细胞宽的狭窄通道可以允许细胞在单个文件中穿过，使得可以容易地看到隧道纳米管。在优选的实施方式中，通道(11)是直的，具有光滑的圆角，以允许层流。在另外的实施方式中，通道(11)具有不同的形状，只要能维持层流即可。较长且弯曲的通道可以用于允许细胞和卵母细胞平滑进入，并提供培养基贮存。也可以将收缩物和阀门添加到通道(11)中，以控制装置的流。在优选的实施方式中，维持活动流用于培养基更新。在一些实施方式中，可以使流停止以允许细胞相互作用并形成隧道纳米管。
在一些实施方式中，反应室(12)允许细胞(包括但不限于隧道纳米管形成细胞和卵母细胞)相互作用并形成隧道纳米管。在一些实施方式中，可以将一个或多个反应室设计为允许在细胞之间同时形成隧道纳米管。
在优选的实施方式中，反应室是圆形的，以最大化用于隧道纳米管形成的使用面积，因为许多细胞在悬浮时呈圆形。在另外的优选实施方式中，反应室的大小不窄于通道(11)，使得没有阻力或只有最小的阻力来阻止细胞进入和穿过。在更优选的实施方式中，反应室被设计为通道(11)的延续部而没有任何分离。
在一些实施方式中，反应室比通道(11)的直径大两倍以上，以阻止卵母细胞逃逸。在另外的实施方式中，在通道(11)和反应室(12)之间添加阀门以将卵母细胞和隧道纳米管形成细胞捕获在反应室内，使得该小面积最大化隧道纳米管的形成。该阀门还可以用作通道(11)和反应室(12)的边界。
在一些实施方式中，微通道系统(13)位于反应室(12)的下游和出口的上游。有利地，当将隧道纳米管形成细胞和卵母细胞插入微流体装置中时，微通道系统可以基于它们的性质(诸如大小)来分离细胞。在优选的实施方式中，当样本包括至少一个卵母细胞和隧道纳米管形成细胞时，由于msc/隧道纳米管形成细胞的直径为约10-40μm并且卵母细胞的直径为约80-100μm，因此可以将微通道调节至隧道纳米管形成细胞和卵母细胞之间的直径，使得隧道纳米管形成细胞可以穿过微通道并从出口被提取，同时将所述至少一个卵母细胞捕获在反应室中。
在一些实施方式中，本发明的微流体装置包括单个微通道(13)。在其他实施方式中，本发明的微流体装置包括微通道系统(13)，所述微通道系统包括多个用于有效过滤的微通道。有利地，即使在存在细胞簇形成的情况下——所述细胞簇会在狭窄的微通道中被捕获并完全阻塞单个微通道系统——多微通道系统也允许过滤。在该实施方式中，较多的微通道是优选的，使得即使当细胞堵塞了一个微通道时，其他微通道仍然可以用于去除细胞。一个重要因素是所有微通道(13)的总宽度。微通道(13)的宽度之和不应小于通道(11)的宽度，因为如果微通道(13)的宽度之和远小于通道(11)的宽度，则会在微流体的上游部分产生较高的压力。在该情况下，所述实施方式中的细胞将尤其暴露于机械应力条件并且将施加细胞应力反应。在最坏的情况下，细胞可能会破裂。
此外，如果所有微通道(13)的宽度之和比通道(11)的宽度小得多，则较大的细胞可能会挤压通过微通道(13)并从出口被去除，而不是由于在反应室(12)和各个微通道(13)处压力增加、流速加快而在反应室(12)中被捕获。
在优选的实施方式中，本发明的微流体系统中的流速较缓慢，诸如，例如<10μl/分钟，更期望地<5μl/分钟，以阻止较大的细胞通过微通道(13)被冲出反应室(12)。
如果实施方式中所使用的细胞具有相似的大小，则可以使用除细胞大小以外的细胞特性来分离细胞。例如，在一些实施方式中，使用微珠和针对不同表面蛋白的抗体来分离不同类型的细胞。在一些实施方式中，通过出口将磁珠添加到通道中。由于将包含磁珠的流体连续泵送到实施方式中，因此可以通过放置在微通道系统(13)外部的磁体捕获磁珠，以将磁珠保持在适当的位置。在该实施方式中，珠的磁性侧面向存在于通道外部的磁体，而抗原结合区域面向微通道的内侧。在优选的实施方式中，当注射了细胞时，目标类型的细胞被细胞特异性珠捕获，从而允许其他类型的细胞穿过。最终，可以通过去除磁体并用流体冲洗微通道来收集捕获的细胞。
在一些实施方式中，活动流可以在微流体装置中用于更新营养物和细胞。泵0用于在微流体装置中生成活动流。在如图2(a)所示的一些实施方式中，注射泵连接在微流体装置的外部，并且泵的出口连接到微流体装置的入口。在其他实施方式中，使用在微流体装置中适配的较小的泵以便于处理。在如图2(a)所示实施方式中，期望较缓慢的流速，因为隧道纳米管的形成和转移是耗费数分钟至数小时的过程，因此低流速可确保至少一个卵母细胞在形成隧道纳米管之前被推动远离隧道纳米管形成细胞。在其他实施方式中，在添加培养基和细胞期间，将流速改变为不同的流速。有利地，活动流的益处在于，由于微流体装置中的通道和微通道的微米宽度，可以相对地限制培养基和营养物的量。然而，由于有限的培养基和空间体积，微流体装置中由细胞释放的废物和有毒物质的浓度可能会比其他具有较大体积的系统中的浓度更快地增加。因此，在优选的实施方式中，在本发明的微流体装置中不断地更新培养基以提高细胞活力。在另外的实施方式中，使培养基经受活动流，使得该流允许细胞在微流体装置中运动。有利地，由这种培养基流引起的卵母细胞在微流体系统中的线性和旋转运动提高了卵母细胞质量。
在一些实施方式中，诸如图2(a)所示的实施方式，可选的过滤器(14)用于将细胞保留在微流体装置循环中，同时从微流体装置中去除用过的培养基。在一些实施方式中，过滤器位于微流体装置中的出口15的上游，使得在微流体装置内部被捕获的细胞可以循环回到通道(11)。在替代性实施方式中，过滤器安装在微流体装置的外部，以用于较大的表面积和较高的过滤效率。在优选的实施方式中，过滤器的孔小于在微流体装置中使用的任何细胞的直径。例如，当在系统中使用细胞直径为20-50μm的隧道纳米管形成细胞时，将使用孔径小于15μm的过滤器。在一些实施方式中，可以通过在通道内设置大小小于15μm的聚二甲基硅氧烷壁垒来阻塞通道。在另外的实施方式中，使用基于细胞性质而不是大小的替代性方法来分离和保留细胞。例如，在一些实施方式中，利用细胞形状、细胞密度或细胞的磁特性来分离和保留细胞。
参考图2(b)，其示出了本发明的微流体隧道纳米管形成装置的另外的实施方式的俯视图。在优选的实施方式中，通道(21)从入口连接到反应室(22)。通道21的宽度至少是卵母细胞6的直径加上隧道纳米管形成细胞的直径的两倍。因此，在优选的实施方式中，通道(21)的宽度为至少100μm。在一些实施方式中，通道11的宽度为低至50μm到高至500μm、约55μm至约450μm、约60μm至约400μm、约65μm至约350μm、约70μm至约300μm、约75μm至约250μm、约80μm至约200μm、约85μm至约150μm、约90μm至约125μm。有利地，由于通道(21)的宽度，对细胞和培养基注射的阻力较低，使得不会发生由于在注射细胞和培养基期间施加的任何力引起的细胞损伤。
在优选的实施方式中，通道(21)包括弯角，使得大卵母细胞6在反应室(22)中被捕获，这阻止了卵母细胞6回流回到出口。在优选的实施方式中，提供具有平滑边缘的直角弯角以维持流动，同时抑制弯角处的细胞捕获。
在一些实施方式中，反应室(22)连接到至少一个微通道(23)。在优选的实施方式中，所述至少一个微通道(23)比通道(21)窄，其直径在系统中所使用的较大细胞(例如卵母细胞)和较小细胞(例如隧道形成纳米管细胞)的大小之间，使得可以在反应室(22)中捕获卵母细胞(6)，同时较小的隧道纳米管形成细胞可以穿过。有利地，本发明的微流体装置允许按大小分选两种类型的细胞。在其他实施方式中，利用其他的细胞特性和方法来分选和分离细胞，包括但不限于：在细胞表面上存在通过特异性抗体和磁珠结合的特异性膜蛋白。
在一些实施方式中，多个微通道(23)从不同的角度和方向连接到反应室(22)。在优选的实施方式中，至少三个微通道连接至反应室(22)。
在另外的实施方式中，微通道(23)连接到中央通道(24)，该中央通道连接到用于去除细胞和培养基的出口。在一些实施方式中，微通道从不同方向连接到中央通道(24)，使得本发明的微流体装置包括弯角并且合并微通道(23)以使其连接到中央通道(24)。在优选的实施方式中，弯角是平滑的弯角，以阻止细胞在弯角处成簇。在另外的优选实施方式中，中央通道(24)是从至少一个微通道(23)连接到至少一个出口的宽通道。
参考图3，其示出了在微流体细胞共培养系统中所使用的微流体隧道纳米管形成装置的替代性实施方式。
在所描绘的实施方式中，多个入口和通道(31a-b)被设计成从两侧连接反应室(12)。在优选的实施方式中，入口和通道均匀分布或者是等同的。在其他实施方式中，其他布置允许在通道(31a)、(31b)和出口(35)之间具有不同距离的情况下更容易操作。在优选的实施方式中，卵母细胞和隧道纳米管形成细胞与两个通道(31a)和(31b)上游的入口分开注射。这两个入口是可互换的，这意味着无需特别选择必须通过哪个入口注射哪种细胞类型。通道(31a)和(31b)可以在连接到反应室(32)之前合并成一个通道(31c)，或者可以不一起合并成一个通道而直接连接到反应室(32)。合并通道(31c)的宽度优选地大于或等于通道(31a)或(31b)的宽度。弯曲的通道(31a)和(31b)允许平滑地注射细胞和卵母细胞。
在该实施方式中，使用自动泵将隧道纳米管形成细胞和卵母细胞注入微流体隧道纳米管形成装置中。在优选的实施方式中，将卵母细胞和隧道纳米管形成细胞同时注入装置中。有利地，多通道注射泵通过同时泵送所述细胞类型来进行辅助。在将卵母细胞和隧道纳米管形成细胞转移到两个不同的注射器中之后，将所述注射器放置在多通道注射器泵上，并将细胞注射到微流体隧道纳米管形成装置中。卵母细胞和隧道纳米管形成细胞将经由通道31a、31b和31c进入反应室32。在替代性实施方式中，分开地注射卵母细胞和隧道纳米管形成细胞。当分开地注射细胞时，可以使用手动注射装置或自动泵。优选的是，在注射隧道纳米管形成细胞之前先注射卵母细胞，因而在注射隧道纳米管形成细胞期间，卵母细胞将在反应室32中被捕获，其可以穿过微通道33。当谨慎处理时，反向顺序也可以类似地起作用。
参考图4，在一些实施方式中，提供了本发明的在微流体细胞共培养系统中使用的微流体隧道纳米管形成装置的另外的设计。在一些实施方式中，一个或多个细胞在至少一个反应室(42)中被捕获，同时其他细胞穿过至少一个通道(41)。在一些实施方式中，微通道(43)将反应室(42)连接至下游通道。
在一些实施方式中，至少一个反应室(42)直接位于通道的弯角处，在该处，可以通过控制流速而将来自同一患者的一个或多个卵母细胞(6)加载到反应室中。在一些实施方式中，然后将包括隧道纳米管形成细胞的另一批细胞注入装置的通道中。有利地，位于反应室(42)附近的细胞与第一批隧道纳米管形成细胞相互作用并形成隧道纳米管。在一些实施方式中，为了去除反应室(42)中捕获的卵母细胞(6)，从出口注射培养基或流体，使得流体通过微通道(43)流入反应室(42)并且卵母细胞(6)被推出并在入口处被收集。有利地，这种设计允许同时将大量的(理论上是成百上千个)反应室(14)连接在一起以进行隧道纳米管形成研究。
通过参考以下非限制性实施例进一步例示本发明。
本文所参考或引用的所有专利、专利申请、临时申请和公开文件的全部内容(包括所有图片和表格)通过引用并入本文，只要它们与本说明书的明确教导不矛盾。
以下是例示用于实践本发明的程序的实施例。这些实施例不应被解释为具有限制性。除非另有说明，否则所有百分比均以重量计，并且所有溶剂混合物比例均以体积计。
实例1
在使用悬滴培养系统的情况下隧道纳米管形成细胞对小鼠卵母细胞的影响
测定了在体外成熟中使用悬滴法将自体生物分子和细胞组分转移至小鼠卵母细胞的影响。用pmsg(5iu/雌性)灌注6周龄或12月龄的c57/bl6小鼠。48小时后通过颈脱位法处死雌性小鼠。将酒精喷射到小鼠的腹部，并切开切口以暴露腹腔。用针解剖卵巢并切成小块。选择胚泡(gv)卵母细胞，并进行对照(仅中等)或与成体干细胞共培养。在共培养之前，在m2培养基(sigma-aldrich，美国)中使用1mg/μl透明质酸酶去除卵母细胞周围的卵丘细胞。
为了模拟不良的卵母细胞质量(诸如通过抑制线粒体呼吸功能)，将卵母细胞用0.05μm浓度的鱼藤酮处理2小时。共培养24小时后收集卵母细胞。
在体外成熟之前，从脂肪组织中收集成体干细胞。通过颈脱位法处死c57/bl6小鼠。从小鼠中解剖出5mg的皮下脂肪。切成小块后，将皮下脂肪在37℃的温度下进行i型胶原酶(pbs中2mg/ml，thermofisherscientific，美国)消化。然后将样本以400g离心15分钟，并且收集基质血管部分，并在补充有20％胎牛血清(thermofisherscientific，美国)和1％青霉素/链霉素(thermofisherscientific，美国)的dmem低葡萄糖培养基中的培养皿(thermofisherscientific，美国)上培养，直到达到细胞融合。每2-3天更换一次培养基。在共培养之前，将成体干细胞的线粒体用绿色线粒体示踪剂标记。在成体干细胞的另一种制备中，将成体干细胞用包含经mcherry标记的lc3自噬体基因的质粒转染。通过流式细胞术证实了lc3-mcherry在成体干细胞中的表达。
使用不含氨基酸(谷氨酰胺除外)、维生素和核苷的alphamem制备ivm培养基。新制备了包含10％fbs和0.2iu/mlfsh的简化alphamem。将选定的卵母细胞在m2培养基中洗涤3次，并且在含5％co2的潮湿空气中于37℃在由20μlivm培养基(对于处理组和对照组，分别为具有和不具有5000个悬浮成体干细胞)组成的悬滴中培养。共培养24h后，使用0.25％胰蛋白酶(lifetechnologies，美国)分离卵母细胞上的msc。具有极体的卵母细胞被记录为成熟卵母细胞。
结果
为了证实线粒体从成体干细胞成功转移到至少一个卵母细胞，在共培养之前用绿色线粒体示踪剂标记成体干细胞的线粒体。卵母细胞中存在绿色线粒体示踪剂信号证实了成体干细胞已通过隧道纳米管将来自成体干细胞的线粒体赋予了卵母细胞(图5(a))。为了证实蛋白质从成体干细胞转移至至少一个卵母细胞，在共培养之前将包含经荧光蛋白标记的自噬体的质粒转染至成体干细胞。卵母细胞中存在红色mcherry信号证实了成体干细胞已经通过隧道纳米管将蛋白质从成体干细胞转移到卵母细胞(图5(b))。在培养的2小时内，在成体干细胞和卵母细胞之间形成了隧道纳米管。隧道纳米管穿透卵母细胞透明带，并与卵母细胞的细胞质紧密接触。扫描电子显微镜还证实了隧道纳米管从成体干细胞连接到卵母细胞(图6)。
为了证明线粒体、生物分子和细胞组分转移对提高具有线粒体功能障碍的卵母细胞质量的影响，对胚泡破裂(gvbd)后线粒体转移和非线粒体转移的卵母细胞的内部atp含量进行了研究。结果显示，小鼠msc(mmsc)使经鱼藤酮处理的卵母细胞(gv(r))的atp含量增加了13.3％(图7)。此外，当用鱼藤酮处理mmsc时，具有线粒体功能障碍的gv的atp含量显著降低至低于0.1pmol/卵母细胞。
为了研究线粒体从成体干细胞向卵母细胞的转移如何支持具有线粒体功能障碍的卵母细胞成熟，对进行了或没有进行线粒体转移的卵母细胞的成熟率做比较。经鱼藤酮处理后的卵母细胞的成熟率急剧降低，但在mmsc线粒体转移后显著增加了80.4％(图8)。这些结果表明，mmsc可以通过线粒体转移和atp含量增加来支持胚泡破裂和gv(r)的成熟。然而，具有线粒体功能障碍的msc不支持gv(r)成熟，并且使比率显著降低了56.7％。
为了研究线粒体转移如何提高老年小鼠的卵母细胞质量，使用了12月龄小鼠的卵母细胞。老年成体干细胞的线粒体转移引致成熟率和受精率分别增加59.3％和50.0％(表1)。线粒体转移后，≥6细胞的胚胎的数量也增加了50％。同时，在自体线粒体转移后，极体断裂率(其是卵母细胞质量不良的标志)降低了58.6％。
表1
实例2
在使用悬滴培养系统的情况下在成体干细胞中过表达kif5b对小鼠卵母细胞的影响
测定了使用悬滴法将过表达kif5b基因的成体干细胞中的生物分子和细胞组分自体转移至小鼠卵母细胞的影响。将kif5b基因克隆到表达载体质粒中，并将该质粒转染到人类成体干细胞中。
用pmsg(5iu/雌性)灌注c57/bl6小鼠。48小时后通过颈脱位法处死雌性小鼠。将酒精喷射到小鼠的腹部，并切开切口以暴露腹腔。用针解剖卵巢并切成小块。选择胚泡(gv)卵母细胞，并进行对照(仅中等)或与成体干细胞共培养。在共培养之前，在m2培养基(sigma-aldrich，美国)中使用1mg/μl透明质酸酶去除卵母细胞周围的卵丘细胞。为了模拟不良的卵母细胞质量(诸如抑制线粒体呼吸功能的影响)，将卵母细胞用0.05μm浓度的鱼藤酮处理2小时。共培养24小时后收集卵母细胞。
使用不含氨基酸(谷氨酰胺除外)、维生素和核苷的alphamem制备ivm培养基。新制备了包含10％fbs和0.2iu/mlfsh的简化alphamem。将选定的卵母细胞在m2培养基中洗涤3次，并且在含5％co2的潮湿空气中于37℃在由20μlivm培养基(对于处理组和对照组，分别为具有和不具有5000个悬浮成体干细胞)组成的悬滴中培养。共培养24h后，使用0.25％的胰蛋白酶(lifetechnologies，美国)分离卵母细胞上的msc。具有极体的卵母细胞被记录为成熟卵母细胞。
结果
成体干细胞中kif5b过表达使经鱼藤酮处理的具有线粒体功能障碍卵母细胞的成熟率和线粒体功能分别提高了26.9％和13.3％(表2)。此外，过表达kif5b的成体干细胞可以通过使卵母细胞存活率增加18.2％来挽救卵母细胞。这些发现表明，kif5b过表达后的成体干细胞对具有线粒体功能障碍的卵母细胞有较好的改进作用。
表2
实例3
在使用本发明的微流体装置的情况下成体干细胞对小鼠卵母细胞的影响
在体外测定了使用本发明的微流体装置将自体生物分子和细胞组分从成体干细胞转移至小鼠卵母细胞的影响。用pmsg(5iu/雌性)灌注6周龄的c57/bl6小鼠。48小时后通过颈脱位法处死雌性小鼠。将酒精喷射到小鼠的腹部，并切开切口以暴露腹腔。用针解剖卵巢并切成小块。选择胚泡(gv)卵母细胞，并进行对照(仅中等)或与成体干细胞共培养。在共培养之前，在m2培养基(sigma-aldrich，美国)中使用85iu/ml透明质酸酶去除卵母细胞周围的卵丘细胞。为了模拟不良的卵母细胞质量(诸如通过抑制线粒体呼吸功能)，用0.05μm浓度的鱼藤酮处理卵母细胞2小时。
在体外成熟前从脂肪组织中收集成体干细胞。通过颈脱位法处死c57/bl6小鼠。从小鼠中解剖出5mg的皮下脂肪。切成小块后，使皮下脂肪于37℃经受i型胶原酶(pbs中2mg/ml，thermofisherscientific，美国)消化1小时。然后将样本以400g离心15分钟，并且收集基质血管部分，并在补充有20％胎牛血清(thermofisherscientific，美国)和1％青霉素/链霉素(thermofisherscientific，美国)的dmem低葡萄糖培养基中的培养皿(thermofisherscientific，美国)上培养，直至融合。每2-3天更换一次培养基。
使用su-83025pdms聚合物制造包括入口、反应室和出口的本发明微流体装置。将pdms聚合物与10:1的碱与固化剂混合，然后于60-70℃固化。使用2:1的碱与固化剂的pdms聚合物将所述微流体芯片附着至盖玻片，并且优选地于170℃在加热板上加热。
使用包含i型胶原(1.5mg/ml)的m2培养基新制备ivm培养基。使用前，将所选择的卵母细胞随机化并在m2培养基中洗涤3次。将成体干细胞从培养皿中解离并计数。制备浓度为250msc/μl的20μl的ivm培养基，并以稳定的速度注入具有卵母细胞的微流体装置中。在立体显微镜下观察该过程。一旦卵母细胞进入反应室，则放慢注射速度。当卵母细胞被成体干细胞包围时，停止注射。对照组由在微流体装置中单独在ivm培养基中培养的卵母细胞组成。
在微流体装置中培养24小时或卵母细胞成熟至m2期后，从入口注射ivm培养基以从微流体装置中去除msc。一旦从微流体装置中去除msc，就从出口注射ivm培养基，以便从入口提取卵母细胞。如果msc附着至卵母细胞并且无法被去除，则使用0.25％的胰蛋白酶(lifetechnologies，目录号25200-056)分离msc。
结果
显微图像显示，卵母细胞和成体干细胞之间非常接近，并且卵母细胞成功地从gv成熟至mii期(图9(a)和图9(b))。条形图显示，通过在本发明的微流体装置中使用自成体干细胞的自体线粒体转移，与在微流体装置中单独使用ivm培养基相比，经鱼藤酮处理的卵母细胞的成熟率增加了20％(图10)。
实例4
在使用本发明的微流体装置的情况下月经血源细胞对卵母细胞的影响
使用月经杯从一名25岁的健康女性供者收集月经血。将5ml月经血与等量的包含青霉素-链霉素和2mm乙二胺四乙酸(edta)的磷酸盐缓冲盐水(pbs)混合。使用ficoll-hypaque(ge-healthcare，美国)密度梯度离心法分离月经血单核细胞。离心后，将悬浮在血沉棕黄层中的有核细胞和落叶子宫内膜转移到新的试管中，并用pbs洗涤两次。将细胞悬浮在补充有20％fbs(thermofisherscientific，美国)的dmem-f12培养基(thermofisherscientific，美国)中。使用悬滴培养系统将5,000个细胞用于提高卵母细胞质量。
用pmsg(5iu/雌性)灌注c57/bl6小鼠。48小时后通过颈脱位法处死雌性小鼠。将酒精喷射到小鼠的腹部，并切开切口以暴露腹腔。用针解剖卵巢并切成小块。选择胚泡(gv)卵母细胞，并进行对照(仅中等)或与成体干细胞共培养。在共培养之前，在m2培养基(sigma-aldrich，美国)中使用85iu/ml透明质酸酶去除卵母细胞周围的卵丘细胞。为了模拟不良的卵母细胞质量(诸如通过抑制线粒体呼吸功能)，用0.05μm浓度的鱼藤酮处理卵母细胞2小时。共培养24小时后收集卵母细胞。
结果
扫描电子显微镜证实了在月经血源细胞与卵母细胞之间形成了隧道纳米管(图11)。数据还表明，通过从人类月经血源细胞(mbdc)转移自体生物分子和细胞组分，成熟率的提高与成体干细胞(hasc)相当(图12)。
本文描述的实施例和实施方式应当理解为仅用于例示性目的，并且根据这些实施例和实施方式进行的各种修改或改变对于本领域技术人员是不言自明的，并且这些修改或改变应被包括在本申请的精神和范围内。另外，本文公开的任何发明或其实施方式的任何要素或限制可以与本文公开的任何和/或所有其他要素或限制(单独地或以任何组合的方式)或任何其他发明或其实施方式组合，并且认为所有这些组合均处于本发明的范围内但不对本发明的范围构成限制。
参考文献
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1.一种用于从未成熟卵母细胞生成成熟卵母细胞的方法，所述方法包括：
在ivm培养基中培养一个或多个未成熟卵母细胞，
在标准培养条件下培养一个或多个隧道纳米管形成细胞；以及
将所述一个或多个未成熟卵母细胞与所述一个或多个隧道纳米管形成细胞共培养至少一小时的时间，使得至少一个隧道纳米管形成细胞形成到至少一个未成熟卵母细胞的至少一个隧道纳米管并通过所述隧道纳米管将生物分子、细胞组分和/或细胞器转移到所述至少一个卵母细胞，所述隧道纳米管从所述至少一个隧道纳米管形成细胞突出到所述至少一个卵母细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个隧道纳米管形成细胞是成体干细胞或月经血源细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述至少一个隧道纳米管形成细胞分离自：患者的外周血、骨髓、脂肪组织、牙髓、脐带血、月经血或胎盘，或者分化自：来源于外周血单核细胞或成纤维细胞的至少一个诱导的多能干细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个隧道纳米管形成细胞是接受辅助生殖技术治疗的患者的自体细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物分子和细胞组分包括一种或多种核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、或包括线粒体的细胞器、或其组合。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一个或多个未成熟卵母细胞在超排卵期间被提取。
7.根据权利要求2所述的方法，还包括：在所述一个或多个隧道纳米管形成细胞中对微管马达蛋白驱动蛋白家族成员5b(kif5b)的过表达。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述ivm培养基还包括fsh和血清补充物。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述ivm培养基还包括细胞外基质。
10.一种用于从未成熟卵母细胞生成成熟卵母细胞的方法，所述方法包括：
在ivm培养基中培养一个或多个未成熟卵母细胞，
培养一个或多个包括：在标准培养条件下隧道纳米管形成细胞；
在培养基的液滴中将所述一个或多个未成熟卵母细胞和所述一个或多个隧道纳米管形成细胞结合在一起，以及
从倒置表面悬挂所述培养基的液滴至少一小时的时间，使得所述一个或多个卵母细胞和所述一个或多个隧道纳米管形成细胞在悬滴中非常接近，并且至少一个隧道纳米管形成细胞形成到至少一个卵母细胞的至少一个隧道纳米管并通过所述至少一个隧道纳米管将生物分子、细胞组分和/或细胞器转移到所述至少一个卵母细胞，所述隧道纳米管从所述至少一个隧道纳米管形成细胞突出。
11.一种用于从未成熟卵母细胞生成成熟卵母细胞的方法，所述方法包括：
在ivm培养基中培养一个或多个未成熟卵母细胞，
培养一个或多个包括：在标准培养条件下隧道纳米管形成细胞；
在培养基的液滴中将所述一个或多个未成熟卵母细胞和所述一个或多个隧道纳米管形成细胞结合在一起，以及
从微流体装置所述培养基的液滴至少一小时的时间，使得所述一个或多个卵母细胞和所述一个或多个隧道纳米管形成细胞在悬滴中非常接近，并且至少一个隧道纳米管形成细胞形成到至少一个卵母细胞的至少一个隧道纳米管并通过所述至少一个隧道纳米管将生物分子、细胞组分和/或细胞器转移到所述至少一个卵母细胞，所述隧道纳米管从所述至少一个隧道纳米管形成细胞突出。
12.一种微流体装置，包括：
a)至少一个隧道纳米管形成室；
b)通道的细胞运输网络，其连接到至少一个入口和至少一个出口以及所述至少一个隧道纳米管形成室，其中，所述通道的细胞运输网络是细胞和细胞培养基的贮存器并通过所述装置控制所述细胞和所述培养基的流速，和
c)收缩物，所述收缩物包括一个或多个微通道，所述微通道的直径不同于所述细胞运输网络的所述通道的直径。
13.根据权利要求11所述的微流体装置，按照以下顺序包括：
a)入口；
b)细胞运输网络；
c)隧道纳米管形成室；
d)收缩物；
e)细胞运输网络；和
f)出口。
14.根据权利要求12所述的微流体装置，其中，所述纳米管形成室和所述细胞运输网络由半透明的生物相容性材料制成。
15.根据权利要求12所述的微流体装置，包括多个隧道纳米管形成室。
16.根据权利要求12所述的微流体装置，其中，所述收缩物的所述微通道的直径小于所述细胞运输网络的所述通道的直径。
17.根据权利要求16所述的微流体装置，其中，所述微通道的直径小于所述一个或多个卵母细胞的直径并且大于或等于所述一个或多个隧道纳米管形成细胞的直径，使得所述一个或多个卵母细胞不能进入所述微通道并被保留在所述隧道纳米管形成室和/或所述通道的所述细胞运输网络中，而所述一个或多个隧道纳米管形成细胞能够穿过所述微通道。
18.根据权利要求12所述的微流体装置，还包括泵，所述泵用于控制细胞和细胞培养基的流速。
19.根据权利要求18所述的微流体装置，其中，所述泵单向地控制细胞和细胞培养基的流动。
20.根据权利要求18所述的微流体装置，其中，所述泵双向地控制细胞和细胞培养基的流动。
技术总结