本发明涉及纳米材料及细胞工程
技术领域：
，具体为一种异质结协同静磁场调控细胞表型的非侵入型远程调控方法。
背景技术：
：控制细胞活动是细胞生物学和生物医学领域最具挑战的问题之一，开发新的调控方法对推动纳米材料的在细胞生物学和生物医学等领域具有重要意义。随着纳米材料发展，二维纳米材料已经成为在时间和空间尺度上选择性控制细胞信号通路的有力工具，并展现出极大的潜力。然而，在诸多性能优异的纳米材料被广泛研究和尝试应用的同时，仍旧面临多方面的严峻挑战。其一，纳米颗粒材料的侵入性使用不可避免地对细胞造成物理损伤，增加内化后的生化风险，比如纳米颗粒侵入导致细胞膜破损，侵入后导致胞内氧化应激效应，进而引发炎症；其二，机械刺激极度依赖纳米膜的表面特性，比如纳米阵列能诱导细胞定向伸展，但过渡依赖纳米阵列的表面结构特征；其三，难以实现远程控制，无论是侵入纳米颗粒，还是特定表面结构的纳米阵列，都很难对细胞生长过程进行干预，从而缺乏灵活性。其四：单一磁场远距离控制很难控制细胞内部变化，如蛋白或黏附行为等。因此，针对上述挑战，开发一种既能规避侵入导致的物理损伤又能实现远程操控细胞内部变化的非侵入型远程操控调控方法，是必要且紧迫的。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种思路新颖，操作简易的远程调控方法，旨在解决实际应用中对高精设备的依赖以及推动细胞生物学上无损调控技术的研发及应用。本发明的技术方案如下：异质结协同静磁场调控细胞表型的非侵入型远程调控方法，包括以下步骤：(1)将贴壁细胞接种到覆有二硫化钼/二硫化钨范德华异质结纳米膜的衬底上；(2)在所述步骤(1)的异质结纳米膜两侧施加磁场能，诱导异质结纳米膜产生逆向感应磁场；(3)将上述培养体系转移至细胞培养箱进行无菌培养。进一步，所述步骤(1)中贴壁细胞为乳腺上皮细胞(eph4-ev)或巨噬细胞(raw264.7)。进一步，所述步骤(2)中磁场能的磁强为650-900奥斯特。进一步，所述步骤(2)磁场能直接作用于异质结纳米膜。进一步，所述步骤(2)磁场能方向水平或垂直作用于异质结纳米膜。进一步，所述步骤(2)磁场能产生设备与异质结纳米膜水平放置，且置于纳米膜两侧对立放置。进一步，细胞培养箱的条件为37℃，5％二氧化碳。技术进步体现：1、相对磁性纳米颗粒的不可避免地侵入性物理损伤和生化风险，本发明具有非侵入性，具有极低的物理损伤和生化风险。2、对比纳米阵列和纳米薄膜调控中对表面纳米形貌和结构的过渡依赖，本发明不受限于表面形貌，能实现远距离的调控操作。3、与需要特定光源作为光驱诱导纳米粒子进行细胞调控相比，本发明不依赖于特定仪器设备，可操作性更强，更实用。附图说明图1本发明中异质结纳米膜在外磁场作用下的磁场反转示意图；图2本发明中异质结纳米膜磁逆转现象；图3本发明中同质和异质结纳米膜磁滞回线；图4本发明中同质和异质结纳米膜剩磁；图5本发明在实施例1和2中乳腺上皮细胞在玻璃和异质结纳米膜上形态差异图；图6本发明在实施例1和2中异质结协同外磁场调控细胞表型示意图；图7本发明在实施例3和4中巨噬细胞在玻璃和异质结纳米膜上形态差异图；图8本发明在实施例1和2中同质或异质结纳米膜上的细胞活力统计结果；图9本发明在实施例1和2中玻璃衬底和异质结纳米膜上的细胞表型参数统计结果；图10本发明在实施例5和6中异质结协同静磁场控制细胞迁移示意图；图11本发明在实施例5和6中细胞迁移实验结果；图12本发明在实施例5和6中细胞迁移统计结果；图13本发明细胞黏附相关蛋白水平差异:(a)实施例7和(b)实施例8。具体实施方式下面结合实施例及附图，对本发明具体实施方式进行详细说明。本发明的实施例选择二硫化钼/二硫化钨范德华异质结构纳米膜，厚度为10±3nm，贴壁细胞为乳腺上皮细胞(eph4-ev)和巨噬细胞(raw264.7)，磁场能产生设备选择磁强为650-900奥斯特钕磁铁，优选750奥斯特。图1本发明中异质结纳米膜在外磁场作用下的磁场反转示意图；图2本发明中异质结纳米膜磁逆转现象；图3本发明中同质和异质结纳米膜磁滞回线；图4本发明中同质和异质结纳米膜剩磁。实施例1：乳腺上皮细胞表型调控实验如下：取食人鱼溶液刻蚀后并用超纯水清洗干净的细胞爬片，作为衬底放置于直径为18mm的细胞培养小皿中。用pbs反复润洗后去除pbs，将1×104个状态良好的乳腺上皮细胞接种到小皿中，再加入2ml含有10％胎牛血清和90％dmem培养基的现配营养液。随后，将两块钕磁铁对立放置于小皿两侧，并确保细胞和纳米膜处于静磁场中心。最后将上述培养体系转移到细胞培养箱中，在37℃，5％二氧化碳的培养条件下培育。24小时后，用激光共聚焦观察细胞表型。实施例2：乳腺上皮细胞表型调控实验如下：取组装有二硫化钼/二硫化钨范德华异质结构纳米膜的细胞爬片，作为衬底放置于直径为18mm的细胞培养小皿中，有纳米膜面朝上。其他操作同实施例1。实施例3：巨噬细胞表型调控实验如下：取食人鱼溶液刻蚀后并用超纯水清洗干净的细胞爬片，作为衬底放置于直径为18mm的细胞培养小皿中。用pbs反复润洗后去除pbs，将1×104个状态良好的巨噬细胞接种到小皿中，再加入2ml含有10％胎牛血清和90％dmem培养基的现配营养液。其他操作同实施例1。实施例4：巨噬细胞表型调控实验如下：取组装有二硫化钼/二硫化钨范德华异质结构纳米膜的衬底，置于直径为18mm的细胞培养小皿中，有纳米膜面朝上。用pbs反复润洗后去除pbs，将1×104个状态良好的巨噬细胞接种到小皿中，再加入2ml含有10％胎牛血清和90％dmem培养基的现配营养液。其他操作同实施例1。实施例5：乳腺上皮细胞迁移调控实验如下：取食人鱼溶液刻蚀后并用超纯水清洗干净的细胞爬片，作为衬底放置于直径为18mm的细胞培养小皿中。用pbs反复润洗后去除pbs，将5×104个状态良好的乳腺上皮细胞接种到小皿中，再加入2ml含有10％胎牛血清和90％dmem培养基的现配营养液。随后，将两块钕磁铁对立放置于小皿两侧，并确保细胞和纳米膜处于静磁场中心。最后将上述培养体系转移到细胞培养箱中，在37℃，5％二氧化碳的培养条件下培育。待细胞完全覆盖衬底后，在显微镜下制造划痕。利用pbs反复清洗以确保划痕处清晰且没有残留细胞，对划痕进行标记及拍照。然后向小皿中加入2ml含有2％胎牛血清和98％dmem培养基的现配营养液，限制细胞增殖但允许细胞迁移。再次转移培养小皿于培养箱中培养，24小时后取出在显微镜下观察划痕情况，并拍照记录。最后用imagej软件对划痕的自愈率进行测定分析。实施例6：乳腺上皮细胞迁移调控实验如下：取组装有二硫化钼/二硫化钨范德华异质结构纳米膜的衬底，置于直径为18mm的细胞培养小皿中，有纳米膜面朝上。其他操作同实施例5。实施例7：蛋白水平响应调控实验如下：取食人鱼溶液刻蚀后并用超纯水清洗干净的细胞爬片，作为衬底放置于直径为18mm的细胞培养小皿中。用pbs反复润洗后去除pbs，将1×104个状态良好的乳腺上皮细胞接种到小皿中，再加入2ml含有10％胎牛血清和90％dmem培养基的现配营养液。随后，将两块钕磁铁对立放置于小皿两侧，并确保细胞和纳米膜处于静磁场中心。最后将上述培养体系转移到细胞培养箱中，在37℃，5％二氧化碳的培养条件下培育。24小时后，用0.25％的胰酶消化细胞促使其衬底脱落。收集悬液，在1000rpm/min下离心1min，去除上清液，再将获得的细胞用液氮冻存，并转移至-80℃下保存。冻存的细胞被送往诺禾致源生物科技有限公司做进一步的dna提取和蛋白组学分析。每组设置至少4个平行。实施例8：蛋白水平响应调控实验如下：取组装有二硫化钼/二硫化钨范德华异质结构纳米膜的衬底，置于直径为18mm的细胞培养小皿中，有纳米膜面朝上。其他操作同实施例7。实施例9至14，基本步骤上述实施例，关键参数采用表1，通过调整磁场能方向，研究细胞表型调控。表1实施例类型纳米膜磁场能方向9乳腺上皮细胞表型调控二硫化钼垂直作于用纳米膜，磁强750奥斯特10乳腺上皮细胞表型调控二硫化钼/二硫化钨垂直作于用纳米膜，磁强650奥斯特11乳腺上皮细胞表型调控二硫化钨垂直作于用纳米膜，磁强770奥斯特12巨噬细胞表型调控二硫化钨垂直作于用纳米膜，磁强800奥斯特13巨噬细胞表型调控二硫化钼垂直作于用纳米膜，磁强900奥斯特14巨噬细胞表型调控二硫化钼/二硫化钨垂直作于用纳米膜，磁强850奥斯特图5本发明在实施例1和2中乳腺上皮细胞在玻璃和异质结纳米膜上形态差异图；图6本发明在实施例1和2中异质结协同外磁场调控细胞表型示意图；图7本发明在实施例3和4中巨噬细胞在玻璃和异质结纳米膜上形态差异图；图8本发明在实施例1和2中同质或异质结纳米膜上的细胞活力统计结果；图9本发明在实施例1和2中玻璃衬底和异质结纳米膜上的细胞表型参数统计结果；图10本发明在实施例5和6中异质结协同静磁场控制细胞迁移示意图；图11本发明在实施例5和6中细胞迁移实验结果；图12本发明在实施例5和6中细胞迁移统计结果；图13本发明在实施例7和8中细胞黏附相关蛋白水平差异。本发明并不局限于实施例中所描述的技术，它的描述是说明性的，并非限制性的，基于本
技术领域：
人员依据本发明所能够变化、重组等方法得到的与本发明相关的技术，都在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3
技术特征：1.异质结协同静磁场调控细胞表型的非侵入型远程调控方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将贴壁细胞接种到覆有二硫化钼/二硫化钨范德华异质结纳米膜的衬底上；
(2)在所述步骤(1)的异质结纳米膜两侧施加磁场能，诱导异质结纳米膜产生逆向感应磁场；
(3)将上述培养体系转移至细胞培养箱进行无菌培养。
2.根据权利要求1所述的异质结协同静磁场调控细胞表型的非侵入型远程调控方法，其特征在于，所述步骤(1)中贴壁细胞为乳腺上皮细胞(eph4-ev)或巨噬细胞(raw264.7)。
3.根据权利要求1所述的异质结协同静磁场调控细胞表型的非侵入型远程调控方法，其特征在于，所述步骤(2)中磁场能的磁强为650-900奥斯特。
4.根据权利要求1所述的异质结协同静磁场调控细胞表型的非侵入型远程调控方法，其特征在于，所述步骤(2)磁场能直接作用于异质结纳米膜。
5.根据权利要求4所述的异质结协同静磁场调控细胞表型的非侵入型远程调控方法，其特征在于，所述步骤(2)磁场能方向水平或垂直作用于异质结纳米膜。
6.根据权利要求4所述的异质结协同静磁场调控细胞表型的非侵入型远程调控方法，其特征在于，所述步骤(2)磁场能产生设备与异质结纳米膜水平放置，且置于纳米膜两侧对立放置。
7.根据权利要求1所述的异质结协同静磁场调控细胞表型的非侵入型远程调控方法，其特征在于，细胞培养箱的条件为37℃，5％二氧化碳。
技术总结本发明公开一种异质结协同静磁场调控细胞表型的非侵入型远程调控方法，其步骤主要包括：将贴壁细胞接种在二硫化钼/二硫化钨范德华异质结纳米膜上，再将两块特定磁强的钕磁铁对立放置在纳米膜两侧，随后整体转移到细胞培养箱进行培养。利用异质结在外磁场条件下产生的逆向感应磁场实现对细胞形态，迁移能力和蛋白水平的调控。相较其他机械刺激，纳米阵列刺激或纳米颗粒诱导等方法，本发明具有无物理破坏，低生化风险，可远程操控的优点，是一种新型非侵入型远程调控方法。
技术研发人员：罗吉伟;周启星;曾辉;欧阳少虎;侯萱
受保护的技术使用者：南开大学
技术研发日：2021.06.01
技术公布日：2021.08.03
