本申请涉及组织工程技术领域，尤其是涉及皮肤微球及其制备方法和应用。
背景技术：
皮肤是人体最大的器官，主要由表皮、真皮、皮下组织和皮肤附属器构成，具有物理屏障、感知外界、维持体温和水分等功能。皮肤的健康与表皮和真皮中的细胞成分和基质成分的状态有着密切的联系。若其中某一成分出现功能障碍，将会导致皮肤疾病的发生，例如过度激活的成纤维细胞会导致疤痕形成。目前，市场上的皮肤药物和护肤品往往能作用于皮肤内的不同成分，来达到治疗疾病和改善皮肤状态的目的。而其中有效成分的发现在很大程度上依赖于体外模型和筛选技术，体外模型相对于人体和动物测试具有成本低、伦理风险低等众多优点。因此，可靠、先进的皮肤体外模型对于皮肤药物筛选具有重要的意义。
药物筛选平台之前使用的体外模型往往是单一的细胞系，如永生化的表皮细胞hacat，通过检测化合物对此细胞系增殖、凋亡等等细胞行为的影响来判断其有效性。但由于其细胞成分单一，与正常皮肤结构与功能相差甚远，难以发现对皮肤健康真正有效的成分，并且很不适用于高通量药物筛选的要求。目前，在多种细胞的组织工程皮肤上的尝试已经用于化妆品的细胞毒性检测，并部分替代动物实验。这类使用了多种细胞的组织工程皮肤产品由上层的角质细胞和下层的仿真皮结构构成，上层的角质细胞角质化后能用于测试表皮的屏障功能。但对于如何在表皮层和真皮层中确认药物的实际作用从而达到相应的筛药目的则难以实现。
技术实现要素：
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种能够实现对药物在表皮或真皮层中的作用进行检测的皮肤微球及其制备方法和应用。
本申请的第一方面，提供皮肤微球，该皮肤微球包括：
真皮细胞微球，真皮细胞微球包含真皮细胞，真皮细胞具有第一信号通路活性报告系统；
表皮层，表皮层包覆于所述真皮细胞微球的表面，表皮层包含表皮细胞，表皮细胞具有第二信号通路活性报告系统。
根据本申请实施例的皮肤微球，至少具有如下有益效果：
该皮肤微球采用真皮细胞形成的内核和外层表皮细胞包裹的复合双层结构，更好地模拟人体本身的皮肤结构。同时，在内核和外壳上分别携带信号通路活性报告系统，使其能够及时地对待测品的作用效果产生响应，从而实现对待测品在表皮层和/或真皮层的作用的检测。
其中，信号通路活性报告系统是指能够对特定的信号通路的活性进行检测并根据检测结果做出定性或定量响应的系统，其实现的非限制性方式包括能够检测特定信号通路的报告基因。需要说明的是，第一信号通路活性报告系统和第二信号通路活性报告系统仅用于区分信号通路活性报告系统被真皮细胞微球中的真皮细胞或表皮层中的表皮细胞所携带，而不用于具体限定信号通路活性报告系统的种类和数量。
在本申请的一些实施方式中，第一信号通路活性报告系统包括shh信号通路活性报告系统、mapk/erk信号通路活性报告系统中的至少一种。shh在调控涉及细胞结构、增殖和存活的多种组织器官的发育中起重要作用，特别是能够促进毛乳头细胞的增殖导致毛囊再生和毛发增长，而与其具有类似调控作用的信号通路还包括mapk/erk等。因此，可以通过真皮细胞携带上述的信号通路报告系统来对药物与细胞的相互作用进行检测，判断其是否能够在穿透表皮屏障后激活真皮细胞中的上述细胞通路，进一步还可以判断上述信号通路激活后的活性如何。
在本申请的一些实施方式中，真皮细胞转染有sre报告基因。mapk/erk信号通路是细胞生长和分化调控的主要参与者，激活过程中，转录因子底物与血清反应因子(srf)形成复合物并与血清响应元件(sre)结合实现基因的表达调控。因此，选择sre作为信号通路活性报告系统中的报告基因能够有效检测mapk/erk信号通路的活性。
在本申请的一些实施方式中，第二信号通路活性报告系统包括经典wnt信号通路活性报告系统、akt信号通路活性报告系统中的至少一种。wnt信号通路是一个复杂的调控网络，包括经典wnt信号通路在内的三个分支。经典wnt信号通路主要参与调控干细胞的多能分化、器官的发育和再生，特别是促进细胞增殖和再生。而与经典wnt信号通路具有类似调控作用的还包括akt信号通路。因此，可以通过表皮细胞携带上述这些信号通路活性报告系统来对药物与细胞的相互作用进行检测，判断其对细胞增殖和再生的作用如何。
在本申请的一些实施方式中，表皮细胞转染有tcf/lef1报告基因。tcf/lef是一类hmg(highmobilitygroup)转录因子，作为wnt信号的靶基因，参与wnt信号通路的反馈调控，结合该转录因子的稳定β-catenin复合物将引起经典wnt信号通路的激活。因此，选择tcf/lef1作为信号通路活性报告系统中的报告基因可以较为灵敏地检测经典wnt信号通路的活性。
因而，通过上述特定的信号通路活性报告系统的设置，表皮细胞的报告系统包括促进细胞增殖和再生的关键通路，如经典wnt信号通路、akt通路等。真皮细胞的报告系统选择促进毛囊毛乳头形成和毛囊再生的信号通路，如shh信号通路、mapk/erk信号通路等，从而可以用来观察待测品对细胞信号通路是否能够激活以及激活程度如何来发现促进皮肤和毛囊再生的药物有效成分。
在本申请的一些实施方式中，皮肤微球的直径为0.02～10mm。皮肤微球的实际大小可以根据研究需要而定，但考虑到产品冻存和复苏的需要，微球直径宜在0.02～10毫米，优选在1毫米以内。
在本申请的一些实施方式中，表皮细胞为源自皮肤或粘膜的角质细胞，这些角质细胞可以是原代细胞，或者是经过培养扩增后的角质细胞，或者是永生化的角质细胞例如hacat。根据皮肤微球不同的应用需要，表皮层中的角质细胞进一步可以是单层或多层，例如在检测药物对角质细胞增殖的影响时，皮肤微球可采用含有单层角质细胞的表皮层；而在需要检测表皮层的屏障功能和药物的透皮的能力时，可以进一步使角质细胞分化成熟形成角质层。另外，表皮层中除了角质细胞外，还可以根据不同的应用需要掺入其它细胞或物质，例如可以掺入一定比例的黑素细胞来测试药物对皮肤表皮层中黑素细胞的影响；也可以渗入一定比例的免疫细胞(如langerhans细胞)来研究药物对皮肤防御功能的影响。
在本申请的一些实施方式中，真皮细胞为分离自皮肤真皮的成纤维细胞，这些真皮细胞可以是原代细胞，或者是经过培养扩增后的成纤维细胞，或者是永生化的成纤维细胞；另外，成纤维细胞也可以是胚胎干细胞或ips细胞经过诱导分化形成。含有成纤维细胞的真皮细胞微球除了对其上包裹的表皮层有功能支持外，也可用于针对真皮细胞的药物或化妆品的检测筛选。根据皮肤微球不同的应用需要，除了成纤维细胞外，真皮细胞微球内还可以进一步加入一定比例的内皮细胞以检测成血管药物，或加入一定比例的免疫细胞以进行免疫相关检测或研究。
在本申请的一些实施方式中，真皮细胞微球中除了真皮细胞外，还可以含有胞外基质大分子，其非限制性实例如胶原蛋白，进一步还可以含有其它一些胞外基质分子如粘多糖，可以是透明质酸。另外，这些胞外基质分子也可部分或全部用合成材料替代。
本申请的第二方面，提供上述皮肤微球的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
取真皮细胞与水凝胶混匀，得到真皮细胞混合液；
将真皮细胞混合液滴加到油相中，孵育，形成真皮细胞微球；
将真皮细胞微球与表皮细胞混合，3d培养，得到所述皮肤微球。
根据本申请实施例的皮肤微球的制备方法，至少具有如下有益效果：
采用上述方法，先在油相中形成真皮细胞的微球，随后与表皮细胞混合3d培养得到的皮肤微球相比于现有的产品，外侧形成的表皮壳层能够与孔壁形成紧密连接，从而更加完整地覆盖在真皮细胞微球的表面，在采用该皮肤微球对药物进行检测筛选时，药物无法直接由孔壁进入内部的真皮细胞微球，从而能够更转其地反映表皮壳层的屏障作用和药物的透皮能力。另外，最终得到的皮肤微球的形态也使其更容易取样分析，更方便储存运输。
在本申请的一些实施方式中，真皮细胞微球在与表皮细胞混合前，先采用培养基重悬并培养12～36h，在此期间随着真皮细胞的铺展，真皮细胞微球的尺寸会略有减小，从而获得更稳定的结构，便于后续表皮细胞在其表面的粘附。
本申请的第三方面，提供上述的皮肤微球在检测药物和/或化妆品中的应用。上述皮肤微球在内核和外壳上分别携带对应的信号通路活性报告系统，能够及时地对待测的药物和/或化妆品的作用效果产生响应，从而作为更好的检测模型实现对药物和/或化妆品在表皮层以及真皮层的作用的检测。
本申请的第四方面，提供待测品的检测方法，该检测方法包括以下步骤：
将上述的皮肤微球与待测品接触，对接触前后皮肤微球的变化进行检测。
该检测方法中所使用的皮肤微球在内核和外壳上分别携带对应的信号通路活性报告系统，在将待测品与该皮肤微球接触时，这种皮肤微球能够作为更准确直观好的检测模型反映药物和/或化妆品在表皮层以及真皮层的作用。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
附图说明
图1是本申请的实施例1中制备得到的皮肤微球的图片。
图2是本申请的实施例2中皮肤微球对药物的反应结果。
图3是本申请的实施例3中加载信号通路活性报告系统的质粒示意图和携带有信号通路活性报告系统的皮肤微球的图片。
具体实施方式
以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。
下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
实施例1
本实施例提供一种皮肤微球和该皮肤微球的制备方法。
该制备方法中所使用到的部分实验材料如下：
鼠尾i型胶原(美国corning公司，产品编号354236)；f3100油相(美国3m公司)；顺铂(麦克林公司)；dmem(美国corning公司)；fbs(美国bi公司)。
该制备方法的具体制备步骤如下：
(1)取鼠尾i型胶原配制浓度为2mg/ml的水凝胶，混匀后放入冰盒中，不调ph。
(2)消化人源皮肤成纤维细胞，计数后取一定数量的成纤维细胞悬液后离心。
(3)用0.1m的naoh调节水凝胶的ph至7.0并充分混匀，成纤维细胞悬液去上清后与ph为7.0的水凝胶混匀得到成纤维细胞混合液，平均分配到八连管中，放入冰盒中。
(4)将f3100油相过滤灭菌，分别加到teflon-96孔板中，每孔200ul。接着用10μl量程的排枪在八连管中吸取4μl的成纤维细胞混合液，滴加到teflon-96孔板的油相中，然后用teflon-lad盖住teflon-96孔板，放入培养箱孵育15-20min，形成真皮细胞微球。
(5)待真皮细胞微球成型之后，从培养箱中取出孔板，每孔加200μldmem后静置5min，并将teflon-lad盖紧后，翻转收集微球，将teflon-lad中的上层液体倒入50ml烧杯中，避免将油相倒入，用pbs清洗3遍后，用全培养基(dmem 10％fbs)重悬所有的微球，将所有液体转入普通型培养皿(non-treated)中，并放入培养箱中培养24h。
(6)将真皮细胞微球以及培养基倒入cellspinner转瓶中进行3d培养，并同时消化永生化表皮细胞hacat，取一定数量的表皮细胞悬液加入正在运行的转瓶中，使得真皮细胞微球与表皮细胞充分混合，共培养7天后形成完整的皮肤微球。
该皮肤微球的照片见图1，a为1000μm尺度下的皮肤微球的图片，b为200μm尺度下明场、不同颜色通道(gfp和mcherry)和合并(merge)后的图片。从图1中可以看出，经过7天共培养后的皮肤微球能够完全成型，形状规则、大小均一，具备双层皮肤结构，包括成纤维细胞与细胞外基质(胶原)组成的真皮细胞微球(mcherry标记)，以及在真皮细胞微球外层由表皮细胞包裹的表皮层(绿色荧光蛋白gfp标记)形成的复合结构，这种结构与人体的皮肤结构十分类似，能够很好地作为检测模型模拟人体皮肤。
实施例2
皮肤微球对药物的反应实验
利用药物处理实施例1中制备得到的皮肤微球，测试皮肤微球在加药前后的增殖和凋亡变化。
实验材料：bfgf(美国sigma公司)；小鼠抗e钙粘蛋白抗体(thermofisher，产品编号13-1700)；兔抗ki67抗体(cst，产品编号9662)；羊抗兔555抗体(cst，产品编号3452)；羊抗鼠647抗体(cst，产品编号4410)。
实验步骤如下：
(1)将实施例1制备得到的皮肤微球放入不贴壁的24孔板中培养，每孔加入2ml培养基(含2％血清)，然后加入药物，放入37度培养箱继续培养48h。
(2)用粗口的移液管将皮肤微球收集到离心管中，自然沉降法将微球沉淀后，去除上层液体。依照同样的方法，使用pbs清洗2遍后，加入4％多聚甲醛4度固定过夜。
(3)接着用pbs清洗2遍后，再依次用10％、20％、30％的蔗糖溶液梯度脱水，每个步骤脱水2h。
(4)随后将皮肤微球转移至组织包埋盒中，利用毛细虹吸作用，用滤纸吸除多余水分，尽量不要接触细胞。往包埋盒中加oct包埋剂浸没皮肤微球，然后迅速放入-80℃冰箱冻成块状。将冻实的样品包埋块放入leica的恒温冰冻切片机中进行冰冻切片，切片厚度为8-10微米。冰冻切片机机箱温度设置为-20℃，机头温度设置为-18℃，切好的样品放于-20℃保存备用。
(5)将冰冻切片从-20℃冰箱取出，室温放置15min，用pbs清洗2遍，每次10min。将玻片擦干后用免疫组化笔沿着样本边缘描一圈，用0.25％tritonx-100通透处理样本30min。吸去tritonx-100，pbs清洗2次后，加入含有3％牛血清白蛋白(bsa)或10％山羊血清的pbs溶液室温封闭30min。加入一抗4℃孵育过夜后，吸去一抗，用pbs清洗2遍，加合适稀释倍数的带有荧光标记的二抗，室温孵育一小时。吸去二抗，pbs洗2遍，加dapi染液，室温染色20min后，用pbs清洗2遍，用封片剂封片，晾干后用倒置荧光显微镜或共聚焦显微镜观察拍照。其中，一抗为小鼠抗e钙粘蛋白抗体和兔抗ki67抗体，二抗为羊抗鼠647抗体和羊抗兔555抗体。
结果如图2所示，从图中可以看出，利用成纤维细胞生长因子bfgf处理皮肤微球48小时后，实验组中的皮肤微球相比于对照组出现了更多表达ki67的细胞，即增殖的细胞数量明显增加。
实施例3
参考图3的a，构建萤光素酶报告质粒1和2，其中报告质粒1上具有tcf/lef报告基因，该tcf/lef报告基因包括tcf/lef结合序列和对应的荧光素酶eluc序列；而在报告质粒2上具有sre报告基因，该sre报告基因包括sre结合序列和荧光素酶fluc序列。另外，报告质粒1和2上还进一步分别设有绿色海肾荧光素酶报告基因(grrenilla)和海肾荧光素酶报告基因(renilla)作为内参。报告质粒1和报告质粒2经慢病毒包装后分别感染表皮细胞和真皮细胞，通过流式分选出高表达的细胞株。然后，按照实施例1中的制备方法，构建得到一种具备双荧光素酶报告系统的皮肤微球。构建得到的皮肤微球如图3中的b所示，表皮层包括带有wnt信号通路活性报告系统的表皮细胞，真皮微球包括带有mapk/erk信号通路活性报告系统的真皮细胞。
这种皮肤微球在经药物处理后，可通过检测荧光素酶活性来确定药物的具体作用。具体检测过程如下：
加入底物d-荧光素反应30s，使用对应波长区间的滤片(2s)测量对应波长区间内的荧光光谱，获得荧光素酶fluc和eluc活性的强度，再加入淬灭剂和底物腔肠素反应7s，使用滤片(1s)测量荧光素酶grrenilla和renilla的活性强度，最终计算出经典wnt信号通路和mapk/erk信号通路的激活程度。其中，经典wnt信号通路是涉及促进细胞增殖和再生的关键通路，而mapk/erk信号通路是涉及促进毛囊毛乳头形成和毛囊再生的信号通路，观察药物对这两种细胞信号通路的激活来可以用来发现能够促进皮肤和毛囊再生的药物的有效成分，从而实现对待测品的检测或筛选目的。
上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
1.皮肤微球，其特征在于，包括：
真皮细胞微球，所述真皮细胞微球包含真皮细胞，所述真皮细胞具有第一信号通路活性报告系统；
表皮层，所述表皮层包覆于所述真皮细胞微球的表面，所述表皮层包含表皮细胞，所述表皮细胞具有第二信号通路活性报告系统。
2.根据权利要求1所述的皮肤微球，其特征在于，所述第一信号通路活性报告系统包括shh信号通路活性报告系统、mapk/erk信号通路活性报告系统中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的皮肤微球，其特征在于，所述真皮细胞转染有sre报告基因。
4.根据权利要求1所述的皮肤微球，其特征在于，所述第二信号通路活性报告系统包括经典wnt信号通路活性报告系统、akt信号通路活性报告系统中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的皮肤微球，其特征在于，所述表皮细胞转染有tcf/lef1报告基因。
6.根据权利要求1至5任一项所述的皮肤微球，其特征在于，所述皮肤微球的直径为0.02～10mm。
7.权利要求1至6任一项所述的皮肤微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取真皮细胞与水凝胶混匀，得到真皮细胞混合液；
将所述真皮细胞混合液滴加到油相中，孵育，形成真皮细胞微球；
将所述真皮细胞微球与表皮细胞混合，3d培养，得到所述皮肤微球。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述真皮细胞微球在与表皮细胞混合前，先采用培养基重悬并培养12～36h。
9.权利要求1至6任一项所述的皮肤微球在检测药物和/或化妆品中的应用。
10.待测品的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1至6任一项所述的皮肤微球与待测品接触，对接触前后所述皮肤微球的变化进行检测。
技术总结