本发明涉及生物医药技术领域，具体为一种体外分离、培养能蠕动的小鼠小肠类器官的方法。
背景技术：
采用细胞株进行平面培养(2d培养)的研究有着庞大的研究数据作为参考，然而其在组织、器官乃至生命体的机理研究方面以及药物研发、临床应用方面存在与体内机体环境巨大差别的局限性。在生理学环境下，多种细胞需要互相“交流”以及受到细胞基质(ecm)的影响，发生不同细胞的基因转录、受体表达、细胞转移、程序性死亡等复杂的生物学机能。
类器官是由多系细胞组成的体外三维培养物，是由干细胞驱动而以自组织的方式而构建形成，能够模拟天然器官结构和功能。与传统二维培养物相比，类器官更能模拟体内细胞运动及多细胞间信号交流，且能在扩增中维持基因稳定性。与动物实验相比，类器官能模拟动物实验易或不能准确代表的人体发育和疾病的发生发展过程，并可实现实时成像和更为符合实验伦理要求，这对病情的进展、药物研发、临床研究方面都会起到很大推动作用。
但是到目前为止，世界上还没有利用包括人在内的动物的小肠组织直接培养出类似体内能蠕动的器官(类器官)。这个能蠕动的组织是小肠平滑肌组织，自律蠕动，单独培养的平滑肌细胞不会形成蠕动现象，而需要在粘膜上皮细胞、神经细胞等支持下才能发生蠕动现象，这归因于小肠的分节运动以及蠕动主要受局部的肠神经系统调节，而对中枢神经系统具有相对独立性。
目前采用的小肠平滑肌体外实验，主要是利用小肠平滑肌组织(与周围组织)进行药敏试验等，缺点是不能长期观察或者药敏试验，其需要基质胶包被等特殊处理，培养难度大，操作复杂。
技术实现要素：
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种体外分离、培养能蠕动的小鼠小肠类器官的方法，包括如下步骤：
步骤1：取三只生后一周的c57bl小鼠，用颈椎脱臼法处死小鼠，在70％酒精中浸泡1min消毒；
步骤2：在超净工作台内解剖小鼠，取出所有大肠与小肠，放到装有pbs的100mm培养皿当中，去掉大肠部分；
步骤3：用眼科剪刀，顺着小肠纵向剪开小肠；
步骤4：用弯头眼科镊的弯曲的凸面一侧轻轻刮掉小肠内部残留物以及大部分小肠粘膜上皮；
步骤5：用1xpbs缓冲液清洗2-3次。去掉清洗上清液后，用眼科剪把小肠组织剪成小于1mm3的组织碎块，并转移到50ml的离心管中；
步骤6：用1xpbs清洗两次后，用300g的离心力进行离心，直至完全去除pbs；
步骤7：加入ⅱ型和ⅳ胶原酶进行消化；
步骤8：放入温度为4℃，避光消化16小时；
步骤9：取出后，在超净工作台或生物安全柜内操作：
1)用剪刀剪除1ml枪头前部的移液器来吹打消化的小肠组织。
2)用孔径为100um的过滤网进行过滤，然后用1xpbs缓冲液冲洗过滤网上部的残余细胞。
3)加入1xpbs缓冲液至40ml；
步骤10：再次进行离心操作，设置离心力为500g，时间为5min；
步骤11：在超净台或安全柜内，去掉上清液后，加入1xpbs缓冲液至40ml，重悬后进行离心操作，设置离心力为300g，时间为5min；
步骤12：去掉上清液后，加入含10％血清的dmem/f12完全培养基至40ml，重悬后进行离心操作，设置离心力为300g，时间为5min；
步骤13：加入含10％血清的dmem/f12完全培养重悬步骤12中离心后的沉淀细胞，用移液器转移到已经装有5ml含10％血清的dmem/f12完全培基的t25培养瓶中；
步骤14：把步骤13的t25培养瓶放入37℃、5％co2的培养箱中培养；
步骤15：40-48h后，细胞长满整个瓶底(覆盖度达到100％)；
步骤16：完全去掉t25瓶中的培养上清液，更换6ml成神经元完全培养基(专用基础培养基加b27、n2两种神经元生长因子，b27添加比例为2％，n2添加比例为1％)；
步骤17：每间隔两天全部去掉步骤16中的神经元完全培养基，更换6ml神经元完全培养基(以下更换培养基时的更换了都为6ml)；
步骤18：从分离细胞开始培养算起，第10-14天开始培养的组织(类器官)开始出现蠕动，从此时开始，每间隔4天开始更换一次神经元完全培养基。
优选的，步骤7中ⅱ型和ⅳ胶原酶的总体积是组织量3倍，ⅱ型和ⅳ胶原酶的终浓度均为0.1mg/ml。
优选的，培养的细胞为以平滑肌细胞和上皮细胞为主的混合细胞，完全为小肠组织内的各种细胞组成。
优选的，在培养箱外观察、拍照、以及换液的时间不超过6分钟；配制的完全培养基不超过两周；更换的新的培养基预热到20℃-37℃之间。
与现有技术相比，本发明涉及一种体外分离、培养能蠕动、且能长期存活的小鼠小肠类器官的方法，可以模仿动物的不同生长期进行观察或进行各种药物实验、毒性实验，从而进一步实现对机体的机理研究、病因学及发病机制等疾病基础研究、新药筛选、肠道疾病精准治疗的临床前评价、与肠道微生物的关系研究、疾病预测、预防研究等。本发明无需基质胶包被等特殊处理，仅需通过普通培养瓶和一般采用的培养基培养，操作方法简单。
附图说明
图1为本发明培养一个月的小肠蠕动平滑肌类器官示意图；
图2为本发明培养两个月的小肠蠕动平滑肌类器官示意图；
图3为本发明培养两个月的小肠蠕动平滑肌类器官(多种细胞集合)示意图；
图4为本发明培养两个月的小肠蠕动平滑肌类器官的蠕动状态示意图；
图5为本发明图4放大示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一、分离方法
步骤1：取三只生后一周的c57bl小鼠，用颈椎脱臼法处死小鼠，在70％酒精中浸泡1min消毒；
步骤2：在超净工作台内解剖小鼠，取出所有大肠与小肠，放到装有pbs的100mm培养皿当中，去掉大肠部分；
步骤3：用眼科剪刀，顺着小肠纵向剪开小肠；
步骤4：用弯头眼科镊的弯曲的凸面一侧轻轻刮掉小肠内部残留物以及大部分小肠粘膜上皮；
步骤5：用1xpbs缓冲液清洗2-3次。去掉清洗上清液后，用眼科剪把小肠组织剪成小于1mm3的组织碎块，并转移到50ml的离心管中；
步骤6：用1xpbs清洗两次后，用300g的离心力进行离心5min，直至完全去除pbs；
步骤7：加入ⅰ型和ⅳ胶原酶进行消化，ⅰ型和ⅳ胶原酶的总体积是组织量3倍，ⅰ型和ⅳ胶原酶的终浓度均为0.1mg/ml；
步骤8：放入温度为4℃，避光消化16小时；
步骤9：取出后，在超净工作台或生物安全柜内操作：
1)用剪刀剪除1ml枪头前部的移液器来吹打消化的小肠组织。
2)用孔径为100um的过滤网进行过滤，然后用1xpbs缓冲液冲洗过滤网上部的残余细胞。
3)加入1xpbs缓冲液至40ml；
步骤10：再次进行离心操作，设置离心力为500g，时间为5min；
步骤11：在超净台或安全柜内，去掉上清液后，加入1xpbs缓冲液至40ml，重悬后进行离心操作，设置离心力为300g，时间为5min；
步骤12：去掉上清液后，加入含10％血清的dmem/f12完全培养基至40ml，重悬后进行离心操作，设置离心力为300g，时间为5min；
步骤13：加入含10％血清的dmem/f12完全培养重悬步骤12中离心后的沉淀细胞，用移液器转移到已经装有5ml含10％血清的dmem/f12完全培基的t25培养瓶中。
二、细胞培养
步骤14：把步骤13的t25培养瓶放入37℃、5％co2的培养箱中培养；
步骤15：40-48h后，细胞长满整个瓶底(覆盖度达到100％)；
步骤16：完全去掉t25瓶中的培养上清液，更换6ml成神经元完全培养基(专用基础培养基加b27、n2两种神经元生长因子，b27添加比例为2％，n2添加比例为1％)；
步骤17：每间隔两天全部去掉步骤16中的神经元完全培养基，更换6ml神经元完全培养基(以下更换培养基时的更换了都为6ml)；
步骤18：从分离细胞开始培养算起，第10-14天开始培养的组织(类器官)开始出现蠕动，从此时开始，每间隔4天开始更换一次神经元完全培养基。
实施例2：
一、分离方法
步骤1：取三只生后一周的c57bl小鼠，用颈椎脱臼法处死小鼠，在70％酒精中浸泡1min消毒；
步骤2：在超净工作台内解剖小鼠，取出所有大肠与小肠，放到装有pbs的100mm培养皿当中，去掉大肠部分；
步骤3：用眼科剪刀，顺着小肠纵向剪开小肠；
步骤4：用弯头眼科镊的弯曲的凸面一侧轻轻刮掉小肠内部残留物以及大部分小肠粘膜上皮；
步骤5：用1xpbs缓冲液清洗2-3次。去掉清洗上清液后，用眼科剪把小肠组织剪成小于1mm3的组织碎块，并转移到50ml的离心管中；
步骤6：用1xpbs清洗两次后，用300g的离心力进行离心5min，直至完全去除pbs；
步骤7：加入ⅱ型和ⅳ胶原酶进行消化，ⅱ型和ⅳ胶原酶的总体积是组织量3倍，ⅱ型和ⅳ胶原酶的终浓度均为0.1mg/ml；
步骤8：放入温度为4℃，避光消化16小时；
步骤9：取出后，在超净工作台或生物安全柜内操作：
1)用剪刀剪除1ml枪头前部的移液器来吹打消化的小肠组织。
2)用孔径为100um的过滤网进行过滤，然后用1xpbs缓冲液冲洗过滤网上部的残余细胞。
3)加入1xpbs缓冲液至40ml；
步骤10：再次进行离心操作，设置离心力为500g，时间为5min；
步骤11：在超净台或安全柜内，去掉上清液后，加入1xpbs缓冲液至40ml，重悬后进行离心操作，设置离心力为300g，时间为5min；
步骤12：去掉上清液后，加入含10％血清的dmem/f12完全培养基至40ml，重悬后进行离心操作，设置离心力为300g，时间为5min；
步骤13：加入含10％血清的dmem/f12完全培养重悬步骤12中离心后的沉淀细胞，用移液器转移到已经装有5ml含10％血清的dmem/f12完全培基的t25培养瓶中。
二、细胞培养
步骤14：把步骤13的t25培养瓶放入37℃、5％co2的培养箱中培养；
步骤15：40-48h后，细胞长满整个瓶底(覆盖度达到100％)；
步骤16：完全去掉t25瓶中的培养上清液，更换6ml成神经元完全培养基(专用基础培养基加b27、n2两种神经元生长因子，b27添加比例为2％，n2添加比例为1％)；
步骤17：每间隔两天全部去掉步骤16中的神经元完全培养基，更换6ml神经元完全培养基(以下更换培养基时的更换了都为6ml)；
步骤18：从分离细胞开始培养算起，第10-14天开始培养的组织(类器官)开始出现蠕动，从此时开始，每间隔4天开始更换一次神经元完全培养基。
实施例3：
一、分离方法
步骤1：取三只生后一周的c57bl小鼠，用颈椎脱臼法处死小鼠，在70％酒精中浸泡1min消毒；
步骤2：在超净工作台内解剖小鼠，取出所有大肠与小肠，放到装有pbs的100mm培养皿当中，去掉大肠部分；
步骤3：用眼科剪刀，顺着小肠纵向剪开小肠；
步骤4：用弯头眼科镊的弯曲的凸面一侧轻轻刮掉小肠内部残留物以及大部分小肠粘膜上皮；
步骤5：用1xpbs缓冲液清洗2-3次。去掉清洗上清液后，用眼科剪把小肠组织剪成小于1mm3的组织碎块，并转移到50ml的离心管中；
步骤6：用1xpbs清洗两次后，用300g的离心力进行离心5min，直至完全去除pbs；
步骤7：加入ⅲ型和ⅳ胶原酶进行消化，ⅲ型和ⅳ胶原酶的总体积是组织量3倍，ⅲ型和ⅳ胶原酶的终浓度均为0.1mg/ml；
步骤8：放入温度为4℃，避光消化16小时；
步骤9：取出后，在超净工作台或生物安全柜内操作：
1)用剪刀剪除1ml枪头前部的移液器来吹打消化的小肠组织。
2)用孔径为100um的过滤网进行过滤，然后用1xpbs缓冲液冲洗过滤网上部的残余细胞。
3)加入1xpbs缓冲液至40ml；
步骤10：再次进行离心操作，设置离心力为500g，时间为5min；
步骤11：在超净台或安全柜内，去掉上清液后，加入1xpbs缓冲液至40ml，重悬后进行离心操作，设置离心力为300g，时间为5min；
步骤12：去掉上清液后，加入含10％血清的dmem/f12完全培养基至40ml，重悬后进行离心操作，设置离心力为300g，时间为5min；
步骤13：加入含10％血清的dmem/f12完全培养重悬步骤12中离心后的沉淀细胞，用移液器转移到已经装有5ml含10％血清的dmem/f12完全培基的t25培养瓶中。
二、细胞培养
步骤14：把步骤13的t25培养瓶放入37℃、5％co2的培养箱中培养；
步骤15：40-48h后，细胞长满整个瓶底(覆盖度达到100％)；
步骤16：完全去掉t25瓶中的培养上清液，更换6ml成神经元完全培养基(专用基础培养基加b27、n2两种神经元生长因子，b27添加比例为2％，n2添加比例为1％)；
步骤17：每间隔两天全部去掉步骤16中的神经元完全培养基，更换6ml神经元完全培养基(以下更换培养基时的更换了都为6ml)；
步骤18：从分离细胞开始培养算起，第10-14天开始培养的组织(类器官)开始出现蠕动，从此时开始，每间隔4天开始更换一次神经元完全培养基。
图1显示的是显微镜下观察到的培养了一个月的小肠蠕动平滑肌类器官。整个画面的组织、细胞呈现节律性地蠕动、整体移动或收缩、延伸的动态变化。这种动态变化与小鼠体内肠的动态变化相似。
图2显示的是显微镜下观察到的培养两个月的小肠蠕动平滑肌类器官的形态，由于长时间的蠕动，整体移动或收缩、延伸的动态变化，组织出现破碎，然而这对小肠蠕动平滑肌类器官整体活性无明显影响。
图3显示的是显微镜下观察到的培养两个月的小肠蠕动平滑肌类器官的形态，通过简单分辨形态可得，培养两个月的小肠蠕动平滑肌类器官含有肠道神经元细胞、肠粘膜上皮细胞，肠道肌细胞、巨噬细胞以及成纤维细胞。
图4显示的是显微镜下观察到的培养两个月的小肠蠕动平滑肌类器官的蠕动状态，左图显示的是类器官细胞收缩的状态，右图显示的是类器官细胞舒张的状态，以a线为水平基准线，可观察到收缩时组织细胞朝b方向收缩，舒张时组织细胞朝c方向舒张。d为收缩区域，e为舒张区域。
图5显示的是图4的局部放大图，进一步可得细胞收缩时细胞间隙紧密，细胞层厚，透光性差，反光性好，视野明亮(左图)，细胞舒张时细胞间隙变大，细胞层薄，透光性好，反光性差，视野暗淡(右图)。
综上所述，本发明通过取出生一周的c57bl小鼠的小肠，在通过ⅱ型和ⅳ胶原酶联合消化小肠组织后，分别采用dmem/f12加血清培养基、神经元培养基进行先后培养，可得到蠕动的小鼠小肠类器官。该类器官可长期存活，因此可以模仿动物的不同生长期进行观察或进行各种药物实验、毒性实验，从而进一步实现对机体的机理研究、病因学及发病机制等疾病基础研究、新药筛选、肠道疾病精准治疗的临床前评价、与肠道微生物的关系研究、疾病预测、预防研究等。本发明无需基质胶包被等特殊处理，仅需通过普通培养瓶和一般采用的培养基培养，操作方法简单。
最后应说明的是，专利保护的适用范围为小鼠、大鼠等动物以及人的小肠组织、并包含由小鼠、大鼠、人的小肠组织建立的pdx模型，且以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种体外分离、培养能蠕动的小鼠小肠类器官的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1：取三只生后一周的c57bl小鼠，用颈椎脱臼法处死小鼠，在70％酒精中浸泡1min消毒；
步骤2：在超净工作台内解剖小鼠，取出所有大肠与小肠，放到装有pbs的100mm培养皿当中，去掉大肠部分；
步骤3：用眼科剪刀，顺着小肠纵向剪开小肠；
步骤4：用弯头眼科镊的弯曲的凸面一侧轻轻刮掉小肠内部残留物以及大部分小肠粘膜上皮；
步骤5：用1xpbs缓冲液清洗2-3次。去掉清洗上清液后，用眼科剪把小肠组织剪成小于1mm3的组织碎块，并转移到50ml的离心管中；
步骤6：用1xpbs清洗两次后，用300g的离心力进行离心，直至完全去除pbs；
步骤7：加入ⅱ型和ⅳ胶原酶进行消化；
步骤8：放入温度为4℃，避光消化16小时；
步骤9：取出后，在超净工作台或生物安全柜内操作：
1)用剪刀剪除1ml枪头前部的移液器来吹打消化的小肠组织。
2)用孔径为100um的过滤网进行过滤，然后用1xpbs缓冲液冲洗过滤网上部的残余细胞。
3)加入1xpbs缓冲液至40ml；
步骤10：再次进行离心操作，设置离心力为500g，时间为5min；
步骤11：在超净台或安全柜内，去掉上清液后，加入1xpbs缓冲液至40ml，重悬后进行离心操作，设置离心力为300g，时间为5min；
步骤12：去掉上清液后，加入含10％血清的dmem/f12完全培养基至40ml，重悬后进行离心操作，设置离心力为300g，时间为5min；
步骤13：加入含10％血清的dmem/f12完全培养重悬步骤12中离心后的沉淀细胞，用移液器转移到已经装有5ml含10％血清的dmem/f12完全培基的t25培养瓶中；
步骤14：把步骤13的t25培养瓶放入37℃、5％co2的培养箱中培养；
步骤15：40-48h后，细胞长满整个瓶底(覆盖度达到100％)；
步骤16：完全去掉t25瓶中的培养上清液，更换6ml成神经元完全培养基(专用基础培养基加b27、n2两种神经元生长因子，b27添加比例为2％，n2添加比例为1％)；
步骤17：每间隔两天全部去掉步骤16中的神经元完全培养基，更换6ml神经元完全培养基(以下更换培养基时的更换了都为6ml)；
步骤18：从分离细胞开始培养算起，第10-14天开始培养的组织(类器官)开始出现蠕动，从此时开始，每间隔4天开始更换一次神经元完全培养基。
2.根据权利要求1所述的一种体外分离、培养能蠕动的小鼠小肠类器官的方法，其特征在于：所述步骤7中ⅱ型和ⅳ胶原酶的总体积是组织量3倍，ⅱ型和ⅳ胶原酶的终浓度均为0.1mg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种体外分离、培养能蠕动的小鼠小肠类器官的方法，其特征在于：培养的细胞为以平滑肌细胞和上皮细胞为主的混合细胞，完全为小肠组织内的各种细胞组成。
4.根据权利要求1所述的一种体外分离、培养能蠕动的小鼠小肠类器官的方法，其特征在于：在培养箱外观察、拍照、以及换液的时间不超过6分钟；配制的完全培养基不超过两周；更换的新的培养基预热到20℃-37℃之间。
技术总结