本发明属于微生物
技术领域：
，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌tbwr1、其应用及所得防治剂。
背景技术：
：烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌(ralstoniasolanacearum)引起的细菌性病害，是典型的维管束病害，根、茎、叶都可发病。烟草青枯病是限制我国烟草生产的主要病害之一。青枯菌通过根部伤口、根尖或次生根进入烟草根部，最终定殖于木质部，继而产生大量的胞外多糖堵塞维管束组织，造成叶片萎蔫、发黄坏死，直接影响着我国烟叶的品质和产量，并最终导致烟株死亡；青枯病还经常与烟草黑胫病、根结线虫病等混合发生，严重时导致全田烟株枯死，给烟叶生产造成巨大的经济损失。目前，烟草青枯病的防治以化学药剂为主，但化学药剂的大量持续性施用易造成病原菌抗药、环境污染等难以克服的问题，不利于生态环境的保护和农业的可持续发展。随着农作物病害防治技术的进步，烟草青枯病的生物防治日益引起科研工作者的重视。目前已报道的青枯病生防菌如多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)、荧光假单胞杆菌(pseudomonasfluorescens)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、薰衣草链霉菌(streptomyceslavendμlae)和壮观链霉菌(streptomycesspectabilis)等在实验室条件下均对青枯菌有抑制作用，但应用在大田试验时其防治效果不佳，主要原因是生防菌在植株体内以及根系土壤的定殖能力差，或者所得生防菌本身的拮抗能力较弱所致。因此，筛选出效果更好、更易培养的拮抗菌是当前烟草青枯病生物防治的重要基础性工作，对烟草病害绿色防控和烟草农业的可持续发展具有重要意义。技术实现要素：本发明提供了一种枯草芽孢杆菌tbwr1、其应用及所得防治剂，该枯草芽孢杆菌属于枯草芽孢杆菌strainsxau-b，经试验证明，将该拮抗菌加入育苗基质可有助于培育烟苗壮苗，同时可显著提高烟草对青枯病的抗性。为了达到上述目的，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌tbwr1，保藏编号为cgmccno.21882，于2021年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所菌保中心，分类命名为枯草芽孢杆菌bacillussubtilis。作为优选，所述枯草芽孢杆菌tbwr1具有如seqidno.1所示核苷酸序列。本发明还提供了一种根据上述技术方案所述的枯草芽孢杆菌tbwr1的pcr扩增方法，包括以下步骤：1)提取分离自土壤悬浊液中细菌菌株的基因组dna；2)以细菌菌株的基因组dna为模板，使用上游引物和下游引物，采用taqmix聚合酶进行pcr扩增；其中：pcr反应体系为：模板dna1.0μl、taqmix12.5μl、上游引物和下游引物各1.0μl，加ddh2o至终体积25.0μl。作为优选，扩增条件为：94℃3min；94℃3min、57℃3min、72℃1min，30个循环；72℃10min。作为优选，所述引物对为：正向引物：5’-agagtttgatcmtggctcag-3’；反向引物：5’-ggytaccttgttacgactt-3’。本发明还提供了一种根据上述技术方案所述的枯草芽孢杆菌tbwr1在拮抗烟草青枯菌中的应用。作为优选，所述枯草芽孢杆菌tbwr1在接种浓度为1×108cfu/ml、接种量为50ml/株时，烟草青枯病的病情指数降至15％。本发明还提供了一种根据上述技术方案所述的枯草芽孢杆菌tbwr1在促进烟苗壮苗培育中的应用。作为优选，所述枯草芽孢杆菌tbwr1在接种浓度为1×108cfu/ml、接种量为50ml/株时，烟苗的茎粗比增加22.5％、叶片面积增加20.1％、整棵植株鲜重增加14.1％。本发明还提供了一种烟草青枯病防治剂，以上述技术方案所述的枯草芽孢杆菌tbwr1为主要有效成分。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：本发明基于提取分离自土壤悬浊液中细菌菌株的抑菌圈筛选并鉴定得到一个烟草青枯病拮抗菌tbwr1，该菌属于枯草芽孢杆菌strainsxau-b；经试验证明，将该拮抗菌加入育苗基质可有助于培育烟苗壮苗，同时可显著提高烟草对青枯病的抗性。附图说明图1为本发明实施例提供的tbwr1对青枯菌的抑制作用；图2为本发明实施例提供的16srdna的pcr扩增产物；图3为本发明实施例提供的tbwr1的系统进化分析；图4为本发明实施例提供的tbwr1处理有利于培育烟草壮苗示意图；图5为本发明实施例提供的tbwr1处理提高烟草对青枯病侵染抗性示意图；图6为本发明实施例提供的tbwr1处理降低烟草青枯病病情指数示意图。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1土壤样品采集土壤样品采集字四川泸州烟区青枯病病圃示范基地。在基地内选取5个点，每个点按照s型曲线收集5株抗病烟株根围土壤样品，混合后作为1个样品。样品取毕、编号(sl-1k～sl-5k)后，将样品放入无菌密封袋中，做好标记并放置4℃保存备用。实施例2烟草青枯菌拮抗菌的筛选2.1试剂：牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌)：牛肉膏3g、蛋白胨10g、nacl5g、琼脂15g，定容至1l。na培养基：将灭菌的na固体培养基加热溶化完全，冷却至55℃左右，加入ttc溶液，倒入培养皿内凝固后备用。nb培养基：蛋白胨10g、牛肉浸粉3g、nacl5g定容至1l，ph7.2。其它生化试剂及普通化学试剂均为进口或国产分析纯。2.2仪器：28℃恒温培养箱、超净工作台、28℃恒温振荡器等。2.3土壤细菌的分离及纯化：实验采用梯度稀释法并涂布于培养基中分离土壤中的拮抗菌。准确称量1g土样于10ml无菌水中制备成浓度为10-1土壤悬液，振荡培养30-60min，然后静置30-60min。用无菌水稀释至10-3土壤稀释液，吸取100μl均匀涂布于细菌培养基上，倒置于28℃培养箱中培养24h后，观察细菌生长情况并挑取形状、大小、颜色不同的单菌落于nb液体培养基中28℃振荡培养24h。将培养后的菌液在细菌培养基平板上划线培养，放置28℃培养箱，待长出单菌落后经过多次划线培养，得到细菌的纯培养，并保存菌种。2.4青枯菌拮抗菌的筛选：采用抑菌圈法筛选烟草青枯病菌拮抗的细菌。在na培养基平板中央放置直径为5mm的无菌滤纸片，用微量移液器在滤纸片上滴加浓度为10μl待测菌液，培养基充分吸收后，倒置于28℃恒温培养箱培养24h。超净工作台中在na平板上均匀喷晒烟草青枯病菌菌悬液，平板充分吸收风干后封口。放置28℃培养箱中培养24-48h，观察抑菌效果测量抑菌圈的直径，重复3次。通过初筛，从5份土壤样品中共挑选单菌落细菌1130株(表1)，利用抑菌圈法从sy-5k中筛选到1株对烟草青枯病菌有良好抑制作用的拮抗菌株，命名为tbwr1，其抑菌圈直径为21mm，抑菌圈透明(表1，图1)。烟草青枯病拮抗菌tbwr1的保藏编号为cgmccno.21882，于2021年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。表1.土壤微生物分离纯化及拮抗菌筛选情况统计表实施例3拮抗菌的分子鉴定采用细菌基因组dna提取试剂盒(货号dp302，北京天根生化科技有限公司)提取细菌tbwr1基因组，利用16srdna序列作为细菌分类的标尺。16srdna扩增引物序列：上游引物5’-agagtttgatcmtggctcag-3’，下游引物5’-ggytaccttgttacgactt-3’，该引物为细菌特异性引物。pcr扩增体系为：模板dna1.0μl，taqdna聚合酶mix12.5μl，上游和下游引物各1.0μl，最终加ddh2o至终体积25.0μl。以ddh2o替代模板的体系作为阴性对照。pcr扩增程序为：94℃3min；94℃3min、57℃3min、72℃1min，30个循环；72℃10min。将16srdna引物扩增tbwr1的pcr产物(图2)纯化后送青岛擎科生物科技有限公司进行测序。得到dna序列后，在ncbi上进行blast，选取同源性比较高的典型菌株的16srdna序列作为参比对象，利用clustalw软件进行多序列比对并构建系统进化树，确定其分类地位。进化树的构建采用neighbor-joining法并根据kimura-2法计算各类群间的核苷酸差异值，运行1000次bootstrap检测。将菌株tbwr1的16srdna测序获得的序列通过ncbi进行同源性比对，结果显示tbwr1与枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)菌株sxau-b的相似性达99％。用标准菌株构建系统发育树。如图3所示，菌株tbwr1与枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)菌株sxau-b亲缘关系最近，因此鉴定tbwr1为枯草芽孢杆菌sxau-b菌株。目前，尚没有研究报道枯草芽孢杆菌sxau-b菌株具有拮抗烟草青枯菌的功能，本发明为首次发现和报道。实施例4青枯病菌株和tbwr1拮抗菌株的发酵条件挑取青枯病菌和菌株tbwr1分别在装有液体lb培养基(ph7.0)的500ml无菌三角瓶中进行培养，放置于28℃振荡培养箱中培养(220rpm/min)16-24h，直到od600＝0.5-0.8，用于后续试验。实施例5拮抗菌对烟苗具有促生作用将烟草种子播种于装有育苗基质土(基质﹕土＝1﹕1)的花盆中。待烟草叶片为4片真叶时(四叶一心期)选择长势相近的烟草苗进行接菌处理，采用菌液灌根的接种法，拮抗菌的接种浓度为1×108cfu/ml，接种量为50ml/株，并以灌根lb液体培养基作为对照。设置8盆烟苗为一个处理，3个生物学重复。每隔7天重复灌根一次，共计处理3次。将处理的烟苗放置于25℃人工气候室中，在12h光照/12黑暗交替处理条件下培养，观察烟草的生长情况，处理结束后15天观察烟株的发育情况，发现与对照组相比，tbwr1处理能显著促进烟草壮苗培育，烟苗叶片增大、茎秆增粗、根系更发达(图4)。进一步取处理组和对照组植株，用清水洗浄根表土壤，并用吸水纸吸干根表水分，对株高，茎粗、叶片面积和整棵植株鲜重等进行了统计，结果表明tbwr1处理后烟苗的株高无明显变化，但是茎粗比对照增加了22.5％、叶片面积增加了20.1％、整棵植株鲜重增加了14.1％(表2)。说明，tbwr1具有促进烟草壮苗的作用。表2tbwr1促进培育烟苗壮苗的统计分析处理株高cm茎粗(直径)mm叶面积cm2整株鲜重glb处理28.5±3.75a5.11±1.12a36.8±6.75a8.5±3.25atbwr1处理31.5±5.2a6.25±5.2b44.2±4.29b9.7±3.12b增长率％10.522.520.114.1实施例6拮抗菌显著增强烟草对青枯病的抗性将烟草种子播种于装有育苗基质土(基质﹕土＝1﹕1)的花盆中中。待烟草叶片为4片真叶时(四叶一心期)选择长势相近的烟草苗进行接菌处理，采用菌液灌根的接种法，拮抗菌和青枯菌的接种浓度为1×108cfu/ml，接种量为50ml/株。在加入拮抗菌之前保持盆栽苗(翠碧一号)充足的水分，量取50ml菌液灌溉盆栽苗根部，对照(ck)接入50ml的无菌水。间隔2-3d，再一次浇灌拮抗菌菌液。两次浇灌之后间隔2-3d接入青枯菌液50ml/盆(od600＝1.0)，对照也同样加入50ml青枯菌液。每个处理8盆，重复2次。然后盖上保温盖放置在30℃高温高湿的条件下培养14天，观察盆栽苗的发病情况，并统计病情指数。病情指数＝100×σ(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)。结果表明，对照组烟苗发病严重，病情指数高达90％，而利用tbwr1预处理的烟草对青枯菌侵染的抗性显著提高，病情指数仅15％(图5、图6)。说明，tbwr1能有效抑制青枯菌的致病性，提高烟苗成活率。序列表<110>中国农业科学院烟草研究所中国烟草总公司四川省公司<120>枯草芽孢杆菌tbwr1、其应用及所得防治剂<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>971<212>dna<213>枯草芽孢杆菌tbwr1<400>1catcgcagctataatgcagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggc60ggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccg120gggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggcttcggct180accacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaatggctcaccaagg240caacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggccca300gactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagca360acgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaag420taccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacg480tgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaag540ggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtca600ttggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaa660atgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacg720ctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaa780acgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaag840cactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgc900acaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttga960catcctctgac971当前第1页1 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技术特征：1.枯草芽孢杆菌tbwr1，其特征在于，保藏编号为cgmccno.21882，于2021年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌tbwr1，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌tbwr1具有如seqidno.1所示核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌tbwr1的pcr扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取分离自土壤悬浊液中细菌菌株的基因组dna；
2)以细菌菌株的基因组dna为模板，使用上游引物和下游引物，采用taqmix聚合酶进行pcr扩增；
其中：pcr反应体系为：模板dna1.0μl、taqmix12.5μl、上游引物和下游引物各1.0μl，加ddh2o至终体积25.0μl。
4.根据权利要求3所述的pcr扩增方法，其特征在于，扩增条件为：94℃3min；94℃3min、57℃3min、72℃1min，30个循环；72℃10min。
5.根据权利要求3所述的pcr扩增方法，其特征在于，所述引物对为：
正向引物：5’-agagtttgatcmtggctcag-3’；
反向引物：5’-ggytaccttgttacgactt-3’。
6.如权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌tbwr1在拮抗烟草青枯菌中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌tbwr1在接种浓度为1×108cfu/ml、接种量为50ml/株时，烟草青枯病的病情指数降至15％。
8.如权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌tbwr1在促进烟苗壮苗培育中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌tbwr1在接种浓度为1×108cfu/ml、接种量为50ml/株时，烟苗的茎粗比增加22.5％、叶片面积增加20.1％、整棵植株鲜重增加14.1％。
10.烟草青枯病防治剂，其特征在于，以权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌tbwr1为主要有效成分。
技术总结本发明提出一种枯草芽孢杆菌TBWR1、其应用及所得防治剂，属于微生物技术领域。该枯草芽孢杆菌TBWR1，保藏编号为CGMCC No.21882，于2021年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明提供的枯草芽孢杆菌属于枯草芽孢杆菌Strain SXAU‑B，经试验证明，将该拮抗菌加入育苗基质可有助于培育烟苗壮苗，同时可显著提高烟草对青枯病的抗性。
技术研发人员：丁安明;陈志华;杨兴有;余祥文;王卫锋;孙玉合
受保护的技术使用者：中国农业科学院烟草研究所;中国烟草总公司四川省公司
技术研发日：2021.04.26
技术公布日：2021.08.03
