技术领域：
本发明属于微生物领域，具体涉及香茅醇在制备促进铜绿假单胞菌毒力基因toxa表达的制剂中的应用。
背景技术：
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铜绿假单胞菌，又名绿脓杆菌，常引起囊性纤维化(cysticfibrosis，简称cf)、脑膜炎、脓肿、软组织感染、尿路感染、角膜感染以及呼吸机相关性肺炎和导管相关性感染，极易感染免疫力低下的恢复期患者，导致术后伤口感染。铜绿假单胞菌急性感染可以用抗生素治疗，但当铜绿假单胞菌成功定植到宿主之后，容易转换成慢性感染，表现出一种永久的生物被膜状态，引起宿主器官感染恶化，传统抗菌疗法很难将其彻底根除。
铜绿假单胞菌的致病性取决于其毒力因子对宿主的损害程度。铜绿假单胞菌的外毒素a的蛋白结构主要有三个区域，在毒素进入细胞，抑制蛋白质合成上各有不同的功能。自从对铜绿假单胞菌外毒素a的结构与功能有了清楚的了解后，就有科学家开始利用基因工程的方式改造并利用外毒素a，使其具有医疗的用途，并且能应用到临床医疗上。
目前铜绿假单胞菌外毒素a在医疗上的用途有：将抗体与其结合成为免疫毒素，藉由抗体作为引导媒介，使这个免疫毒素进入某些特定细胞中，抑制这些细胞的蛋白质合成，达到破坏这些特定细胞生长的目的，特别是在抗癌药物的研究上；运用外毒素a开发绿脓杆菌疫苗，它是一种很好的疫苗蛋白，不论制成无毒的外毒素a片段或与其它抗原融合，都可以运用到疫苗研发上；针对肝癌细胞的治疗方面，利用外毒素a能够携带蛋白质或dna进入细胞中的特殊功能，可以开发出极佳的基因治疗工具或蛋白质治疗药物。
香茅醇为一种单萜，分子式为c10h20o，是一种无色液体，具有甜玫瑰香。天然植物精油中含有右或左旋香茅醇及其消旋体。右旋香茅醇主要存在于芸香油、香茅油和柠檬桉油中；左旋香茅醇主要存在于玫瑰油和天竺葵属植物的精油中。
技术实现要素：
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本发明的目的是提供香茅醇在制备促进铜绿假单胞菌毒力基因toxa表达的制剂中的应用。
本发明通过实验表明，香茅醇轻微抑制铜绿假单胞菌pao1菌株的生长，但能促进铜绿假单胞菌toxa的转录，从而能提高toxa的编码产物-外毒素a的产量。
因此，本发明的目的是提供香茅醇在制备促进铜绿假单胞菌毒力基因toxa表达的制剂中的应用。
所述的铜绿假单胞菌优选为铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)pao1。
优选，是香茅醇在制备促进铜绿假单胞菌产外毒素a的制剂中的应用。
优选，所述的香茅醇是β-香茅醇。
优选，所述的香茅醇，其在铜绿假单胞菌培养液中的浓度为0.313-2.5μl/ml。进一步优选为1.25μl/ml。
本发明发现香茅醇在浓度为0.313-2.5μl/ml下轻微抑制铜绿假单胞菌pao1菌株的生长，但能促进铜绿假单胞菌toxa的转录，从而能提高toxa的编码产物-外毒素a的产量。因此可以将香茅醇用于促进铜绿假单胞菌toxa的转录，进而提高外毒素a的产量。
附图说明：
图1是香茅醇作用下铜绿假单胞菌pao1的生长曲线；
图2是香茅醇对铜绿假单胞菌群体感应系统关键基因及其调控的毒力基因表达的影响。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
pao1菌[铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)pao1]悬液的制备：将指数生长期的铜绿假单胞菌pao1培养液取样，离心，用pbs缓冲液洗涤一次，重悬于pbs中，并将菌浓度稀释至108cfu/ml，得到pao1菌悬液。
1.香茅醇对铜绿假单胞菌pao1生长的影响实验
分别向试管中加入lb培养基、香茅醇(β-香茅醇)，并接入指数生长期的pao1菌悬液，总体积均为10ml，使pao1的菌浓度均为106cfu/ml，香茅醇的浓度分别为0(对照)、0.313μl/ml、0.625μl/ml、1.25μl/ml和2.5μl/ml。将几个实验组分别取样加入到自动生长曲线测定仪(bioscreenc)专用的蜂窝培养板中，每孔加入350μl的培养液，每个实验组三个平行。将蜂窝培养板置于自动生长曲线测定仪中，37℃振荡培养3天，每小时测定一次od600。以od600为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制香茅醇作用下pao1的生长曲线，以此研究香茅醇对pao1生长的影响。结果如图1所示。
2.香茅醇对铜绿假单胞菌群体感应系统关键基因及其调控的毒力基因表达的影响实验
向50ml无菌lb液体培养基中加入处于对数生长期的pao1菌悬液，使菌液终浓度为106cfu/ml。加入香茅醇(β-香茅醇)，使得终浓度为0(对照组三个生物学重复分别命名为a1、a2、a3)和1.25μl/ml(实验组三个生物学重复分别命名为b1、b2、b3)；将各组置于37℃、180rpm条件下培养5h；离心并收集菌体，-80℃速冻后备用。
使用trizol(thermo公司)的试剂盒提菌体总rna。提取后用超微量分光光度计(implen,munich,德国)检测rna的纯度。每份rna样品的a260/a280值应该在1.8～2.0之间。使用primescriptrtmastermix试剂盒(takara，大连，中国)及etc811pcr仪(北京东胜创新生物科技有限公司进行反转录及实时荧光定量pcr扩增。q-pcr反应体系采用takara的sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(codeno.rr820a)，pcr程序为95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环；根据genbank网站上已发布10个基因序列，利用primerpremier5.0软件设计出进行q-pcr的引物，同时将16srrna基因作为内参基因，引物序列参数见表1。
表1实时荧光定量pcr使用的基因及其引物序列
实验结果：
不同浓度香茅醇作用下铜绿假单胞菌pao1的生长曲线结果如图1所示。实验结果显示，香茅醇处理pao1细胞之后，菌株的生长受到轻微抑制。不同浓度香茅醇处理组对pao1生长曲线的延滞期和对数生长期无明显差异，但是对其稳定期和衰亡期有一定影响。从图中可以看出，不同浓度处理组培养液吸光值达到最大的时间点相差也比较大：0.313μl/ml处理组为26h，0.625μl/ml处理组为37h，1.25μl/ml处理组为39h，2.5μl/ml处理组为48h。香茅醇浓度越高，培养液吸光值达到最大值的时间越长，稳定期越长。0.313、0.625、1.25和2.5μl/ml的香茅醇对pao1的生长均有一定抑制作用，但是抑制作用不强，因此，香茅醇轻微抑制pao1的生长。
pao1细胞经1.25μl/ml香茅醇处理5h后，其群体感应系统关键基因和相关毒力基因的表达水平变化情况如图2所示。las系统的信号分子合成酶基因lasi和信号分子受体蛋白基因lasr的表达均显著上调。rhl系统的信号分子受体蛋白基因rhlr的转录水平也显著上调，但信号分子合成酶基因rhli的转录水平变化不大。pqs系统的信号分子合成酶基因pqsa和信号分子受体蛋白基因pqsr的表达均显著下调。毒力基因lasb、phzm、chic和pslb的转录都被香茅醇抑制；toxa的转录水平显著上调；lasa的转录水平也上调，但变化不显著。因此，香茅醇促进了铜绿假单胞菌toxa的转录。
综上的实验结果表明，香茅醇轻微抑制铜绿假单胞菌pao1菌株的生长(图1)，但能够促进铜绿假单胞菌toxa的转录(图2)，从而提高toxa的编码产物-外毒素a的产量。
1.香茅醇在制备促进铜绿假单胞菌毒力基因toxa表达的制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)pao1。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，香茅醇在制备促进铜绿假单胞菌产外毒素a的制剂中的应用。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的香茅醇是β-香茅醇。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的香茅醇，其在铜绿假单胞菌培养液中的浓度为0.313-2.5μl/ml。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的香茅醇，其在铜绿假单胞菌培养液中的浓度为1.25μl/ml。
技术总结