本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及酿酒酵母工程菌及其在制备香草醛中的应用。
背景技术：
香兰素(vanillin)又称香草醛、香兰醛，化学名为4-羟基-3-甲氧基苯甲醛，存在于兰花香草豆中，是最广泛使用的芳香化合物之一。广泛用于食品饮料、香水、化妆品的香料成分，在食品、药品、化妆品、农业以及化工和制药工业的中间体等领域被广泛应用。天然香草醛主要从香子兰花荚中提取，由于香荚兰种植中需要人工授粉，劳动强度大，工周期长，使得天然提取法获得的香兰素远远不能满足市场需求。另外，化学合成是香草醛生产的主要方式，主要通过转化丁香酚，愈创木酚合成香草醛等。然而由于不环保的工艺过程，该法生产的香兰素在全球范围内受到食品和制药行业的限制。生物转化法生产天然香草醛已被公认为一种有效的技术，可以替代传统的化学方法。例如，已发现使用许多不同的微生物可将许多底物(例如阿魏酸、木质素、香草酸、丁香酚和异丁香酚)转化为香草醛。针对恶臭假单胞菌，芽孢杆菌，分枝杆菌菌株进行基因的敲除，减少香草醛的代谢，实现了阿魏酸合成了香草醛。
另外，在大肠杆菌中异源表达fcs,ech,实现了大肠杆菌合成香草醛。另外在酿酒酵母中表达香草来源的vpvan，以阿魏酸糖苷为底物进行转化，利用质谱检测到了香草醛糖苷产生。当前生物转化由于香草醛在微生物中不稳定，导致了其转化率较低。对微生物内源基因的敲除减少其对香草醛的代谢是合成香草醛的关键。当前在恶臭假单胞菌中敲除香草醛氧化酶vdh，实现了香草醛的积累。另外，在大肠杆菌中敲除6个基因及表达arboxylicacidreductase
同样实现了香草醛的积累。先前在酿酒酵母中敲除adh6,减少了香草醛的代谢，另外敲除adh6的酿酒酵母中构建了利用葡萄糖合成香草醛生物转化路线，但是发酵培养基中含有大量的香草酸及香草醇。说明仅仅敲除adh6并不能阻止醛的代谢。这说明酿酒酵母醛代谢是香草醛合成的瓶颈之一。需要对其内源基因进行精准敲除实现香草醛的工业化生产。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了酿酒酵母工程菌株及其在制备香草醛中的应用。本发明通过对酿酒酵母进行基因改造，获得的酿酒酵母工程菌可以充分利用木质素及其衍生的芳香族化合物生产香草醛，明显提高了香草醛的含量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供的酿酒酵母工程菌株，以酿酒酵母菌株为底盘菌株，并进行如下改造：
a)整合外源基因4cl、ech中的至少一种；和/或
b)敲除内源基因ari1、gre2、hfd1中的至少一种。
本发明中，所述底盘菌株以酿酒酵母菌株为出发菌，在其基础上敲除了adh6、adh7、bdh1、bdh2基因。所述出发菌可以是任意一株酿酒酵母菌。
一些具体实施例中，所述底盘菌株的出发菌株为酿酒酵母菌株by4742，即，所述底盘菌株为敲除了adh6、adh7、bdh1、bdh2基因的酿酒酵母菌株by4742，本文将该底盘菌株命名为菌株zr01。
对基因的敲除方法，本发明没有特殊限定，可以利用crispr技术，也可以利用酵母的同源重组机制。
本发明具体实施例中，利用crispr技术对adh6、adh7、bdh1、bdh2基因进行敲除，获得底盘菌株zr01。具体敲除方法为：
以酿酒酵母by4742为模板，pcr获取酿酒酵母adh6基因(genbank号为：nm_001182831.3)的左右各400bp序列，命名为adh6l、adh6r，进行overlap，获取adh6-lr作为donordna。根据adh6序列构建grna质粒，将grna，cas9，donordna导入酿酒酵母by4742中，按照以上相同的方法依次敲除adh7、bdh1、bdh2基因。其中adh7的donordna为adh7基因(genbank号为：nm_001178812.1)左右各400bp；、bdh1的donordna为bdh1基因(genbank号为nm_001178202.2)左右各400bp；、bdh2的donordna为bdh2基因(genbanknm_001178203.1号为)左右各400bp。
本发明中，所述外源基因4cl来源于欧芹(petroselinumcrispum)。所述外源基因ech来源于恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)。本发明根据酿酒酵母的密码子偏好性对欧芹来源的4cl基因和恶臭假单胞菌来源的ech基因进行优化。优化后，欧芹来源的4cl基因的序列如seqidno：1所示；恶臭假单胞菌来源的ech基因(登录号aan68962.1)的序列以seqidno：2～3所示的引物扩增得到。
其中，所述ech基因的扩增引物为：
ech-f:5’-atgagcaaatacgaaggccg-3’(seqidno：2)；
ech-r:5’-tcagcgcttgtaggcctgc-3’(seqidno：3)。
一些具体实施例中，本发明在所述底盘菌株zr01的基础上敲除内源基因ari1，获得酿酒酵母工程菌株zr02。在所述底盘菌株zr01的基础上敲除内源基因gre2，获得酿酒酵母工程菌株zr03。在所述底盘菌株zr01的基础上敲除内源基因hfd1，获得酿酒酵母工程菌株zr04。在所述底盘菌株zr01的基础上敲除内源基因ari1(转录本号为nm_001181022.3)、gre2(转录本号nm_001183405.1)和hfd1(转录本号nm_001182610.1)，获得酿酒酵母工程菌株zr05。敲除方法与adh6、adh7、bdh1、bdh2的敲除方法相同。
本发明在所述底盘菌株zr05的基础上整合ech基因和seqidno：1所示的4cl，获得酿酒酵母工程菌株van01。。
本发明提供所述酿酒酵母工程菌的构建方法，以酿酒酵母菌株为底盘菌株，并进行如下改造：
以酿酒酵母菌株为底盘菌株，敲除内源基因ari1、gre2、hfd1中的至少一种；或
以酿酒酵母菌株为底盘菌株，敲除内源基因ari1、gre2、hfd1中的至少一种，获得突变菌株；构建启动子-外源基因-终止子的表达模块，将所述表达模块转化所述突变菌株。
所述外源基因为4cl、ech中的至少一种；
所述底盘菌株的adh6、adh7、bdh1、bdh2基因被敲除。
本发明中，所述转化方法为醋酸锂转化法。
本发明中，所述内源基因、外源基因中每个基因的5’端连接启动子，3’端连接终止子。
其中，所述启动子为酿酒酵母内源启动子。一些具体实施例中，所述酿酒酵母内源启动子为ptpi1p或pfba1。
本发明对终止子的来源没有特殊限定，本领域常用的终止子均可。本发明中，所述终止子为酿酒酵母内源终止子，具体为tpgi1或tgpm1，终止子的具体种类包括但不仅限于此。
本发明还提供了所述的酿酒酵母工程菌株在制备原香草醛中的应用。
本发明还提供一种香草醛的制备方法，利用本发明所述的酵母工程菌株进行发酵。
本发明所述发酵的培养基包含阿魏酸或木质素水解液。
本发明在zr01的基础上，整合外源基因4cl、ech中的至少一种；和/或敲除内源基因ari1、gre2、hfd1中的至少一种。本发明通过精准控制以上关键基因的转入和敲除，在酵母体内构建了一种全新的利用木质素合成香草醛生物转化路径，使代谢路径减少了香草醛合成香草、香草醇和香草酸，实现了香草醛的积累。实验表明，本发明基因工程菌可以充分利用木质素及其衍生的芳香族化合物大量生产香草醛，不仅可以解决木质素的利用问题，而且可以实现香草醛的工业化生产。
附图说明
图1示不同菌株积累香草醛的结果；
图2示以阿魏酸为底物转化合成香草醛的结果；
图3示以木质素水解液为底物转化合成香草醛的结果。
具体实施方式
本发明提供了酿酒酵母工程菌及其在制备香草醛的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
2、构建菌株zr01～zr05
pcr扩增酿酒酵母adh6基因的左右各400bp序列，命名为adh6l,adh6r,进行overlap，获取adh6lr作为donordna。根据adh6序列构建grna质粒，将grna，cas9，donordna导入酿酒酵母by4742中，涂布sc筛选平板，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行pcr验证及测序。根据上述方式，依次敲除adh7、bdh1、bdh2，命名为zr01。
zr01的基础上进一步敲除ari1，命名为zr02。在zr01基础上敲除gre2，命名为zr03,在zr01基础上敲除hfd1，命名为zr04；zr01基础上依次敲除ari1、gre2和hfd1，命名为zr05。所用引物序列和gdna序列见表1。
表1
2、酵母工程菌株van01的构建：
通过pcr扩增酵母启动子ptpi1p终止子tgpm1，与4cl基因进行overlap，获得模块ptpi1p-4cl-tgpm1。通过pcr扩增酵母启动子pfba1,终止子tpgi1与基因ppech，进行overlap，获得模块,pfba1-ech-tpgi1。根据ho序列构建grna质粒，将grna，cas9，donordna，模块ptpi1p-4cl-tgpm1，pfba1-ppech-tpgi1利用醋酸锂转化法，通过donordna的左、右同源序列与酵母基因组上ho位点发生重组而整合到基因组上，获得稳定遗传的酵母菌株van01。
实施例2
将实施例1构建的菌株zr01、zr02、zr03、zr04、zr05,在初始添加200mg/l香草醛的sd培养基(合成酵母氮源ynb6.7g/l，葡萄糖20g/l，完全混合氨基酸粉末2g/l)培养基下菌株培养在sc培养基中，培养48h，液相分析其香草醛，香草酸，香草醇的含量(图1)。
将实施例1构建的菌株van01，在初始含有4mmol/l阿魏酸的ypd培养基中30℃摇瓶发酵96h，分析其在不同时间段的阿魏酸、香草醛的含量(图2)。
以木质素水解液为底物，van001菌株在初始含有40％木质素水解液的ypd中96h，分析其在不同时间段的阿魏酸、香草醛的含量(图3)。
由图1可知，酵母菌株zr01，本发明在zr01的基础上分别敲除ari1、gre2、hfd1以及同时敲除三个基因后，减少了香草醛合成香草醇和香草酸，实现了香草醛不同程度的积累，其中，同时敲除ari1、gre2、hfd1三个基因的工程菌zr05，香草醛含量得到显著提高。
由图2可知，菌株van001转化4mmol/l阿魏酸合成了2.9mmol/l的香草醛。
由图3可知，菌株van001以木质素水解液为底物，合成了大约0.5mmo/l的香草醛。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>天津大学
<120>酿酒酵母工程菌及其在制备香草醛中的应用
<130>mp21005896
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1635
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
atgggtgactgtgttgctccaaaggaagacttaatttttagatctaagttgcctgatatc60
tatatcccaaagcatttgcctttacacacatactgtttcgaaaacatctctaaggttggt120
gacaagtcatgcttaattaacggtgccaccggtgaaacttttacttactctcaagtagaa180
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gtttccaagcaagttgtcttttataagagaatattcagagtctttttcgtagatgctata1560
ccaaagtctccttcaggtaaaatcttgagaaaggatttgagagcaagaattgcctctggt1620
gacttgccaaaatag1635
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
atgagcaaatacgaaggccg20
<210>3
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
tcagcgcttgtaggcctgc19
1.酿酒酵母工程菌株，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌株以酿酒酵母菌株为底盘菌株，并进行如下改造：
a)整合外源基因4cl、ech中的至少一种；和/或
b)敲除内源基因ari1、gre2、hfd1中的至少一种；
所述底盘菌株的adh6、adh7、bdh1、bdh2基因被敲除。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌株，其特征在于，所述底盘菌株的出发菌株为酿酒酵母菌株by4742。
3.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌株，其特征在于，所述酵母工程菌株在所述底盘菌株的基础上敲除内源基因ari1、gre2、hfd1中的一种或三种。
4.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌株，其特征在于，所述酵母工程菌株在所述底盘菌株的基础上敲除内源基因ari1、gre2和hfd1，并整合外源基因4cl和ech。
5.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌株，其特征在于，所述外源基因中，4cl基因来源于欧芹；ech来源于恶臭假单胞菌。
6.根据权利要求1～5任一项所述的酿酒酵母工程菌株，其特征在于，所述内源基因、外源基因中每个基因的5’端连接启动子，3’端连接终止子。
7.根据权利要求6所述的酿酒酵母工程菌株，其特征在于，所述启动子为酿酒酵母内源启动子ptpi1p或pfba1。
8.权利要求1～7任一项所述的酿酒酵母工程菌株在制备原儿茶酸中的应用。
9.权利要求1～7任一项所述的酿酒酵母工程菌株的构建方法，包括：
以酿酒酵母菌株为底盘菌株，敲除内源基因ari1、gre2、hfd1中的至少一种；或
以酿酒酵母菌株为底盘菌株，敲除内源基因ari1、gre2、hfd1中的至少一种，获得突变菌株；构建启动子-外源基因-终止子的表达模块，将所述表达模块转化所述突变菌株；
所述外源基因包括4cl、ech中的至少一种；
所述底盘菌株的adh6、adh7、bdh1、bdh2基因被敲除。
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述骨架载体为prs415。
11.一种原儿茶酸的制备方法，其特征在于，利用权利要求1～7任一项所述的酵母工程菌株进行发酵。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的培养基包含阿魏酸、香草酸或木质素水解液。
技术总结