本发明属于基因技术领域，涉及一株产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌及其构建方法、培养方法与应用。
背景技术：
α-葡聚糖酶(dextranase，1,6-α-d-glucan-6-glucanohydrolase；ec3.2.1.11)也被称为右旋糖酐酶，能够随机水解葡聚糖中的α-1,6糖苷键，终产物包括异麦芽糖、异麦芽三糖和葡萄糖以及痕量的多聚糖。α-葡聚糖酶分为两类，内切α-葡聚糖酶(endodextranases)水解葡聚糖内部的糖苷键；外切α-葡聚糖酶(exodextranases)从葡聚糖的非还原端切割，终产物一般为异麦芽糖或异麦芽三糖等。众多微生物都可产α-葡聚糖酶，包括青霉、曲霉、细丽毛壳、镰刀霉菌、申克孢子丝菌、斯达油脂酵母、口腔拟杆菌、嗜热厌氧杆菌、链球菌等。
目前商品化的α-葡聚糖酶主要是通过青霉属(penicillium)和毛壳属(chaetomium)等真菌的培养物得到。与此同时，利用基因工程菌生产外源蛋白也极具发展前景。在α-葡聚糖酶的基因克隆和异源蛋白表达方面，大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统均有报道。大肠杆菌表达系统虽然具有操作方便，培养简易的特点，但是发酵细胞密度不高，获取表达蛋白需要破碎细胞，蛋白容易形成包涵体，给纯化分离，变性复性带来困难。目前α-葡聚糖酶的研究进展主要集中在甲醇诱导型毕赤酵母工程菌产外源α-葡聚糖酶。甲醇酵母是可利用甲醇作为唯一碳源的酵母，其中巴斯德毕赤酵母pichiapastoris的基因操作相对简单、外源蛋白的超高量表达、易于工业化生产、能够完成真核系统蛋白的蛋白水解成熟、糖基化修饰和二硫键形成等翻译后的修饰加工过程。毕赤酵母表达载体分为游离型载体和整合型载体两种，目前整合型载体应用较广，其中大部分属于醇氧化酶aox启动子调控的甲醇诱导型载体，少部分如pgapz和pgapzα属于三磷酸甘油醛脱氢酶gap启动子调控的组成型载体。chen等用5l发酵罐培养获得了83.9u/ml的酶活，kanghk等用10l发酵罐取得了134u/ml的酶活。
毕赤酵母属于子囊菌芽殖酵母，通常以单倍体形式存在。在营养限制的条件下可接合形成二倍体细胞。一般毕赤酵母工程菌的外源蛋白表达量与该外源蛋白基因拷贝数呈正相关，在构建工程菌的过程中，可通过将多个基因拷贝整合进入毕赤酵母单倍体中以提高外源蛋白表达水平。但是拷贝数达到一定数量后，往往产生负相关的效应，使得普通单倍体工程菌的外源蛋白表达产量遇到瓶颈，无法继续提高。因此，提供一株产α-葡聚糖酶能力处于领先水平的毕赤酵母工程菌，具有实际的应用价值。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌，该二倍体工程菌由单倍体工程菌km-hz和km-hk通过接合形成，其所产α-葡聚糖酶的酶活较高。
本发明的第二目的在于提供所述的产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌的构建方法。
本发明的第三个目的在于提供所述的产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌的培养方法。
本发明的最后一个目的在于提供所述的产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌(pichiapastoris)dip1，已于2020年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno.61378。
所述的产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1在生产α-葡聚糖酶中的应用。
一种产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1的构建方法，包括如下步骤：
(1)单倍体产酶工程菌km-hz的构建：根据朱黄青霉α-葡聚糖酶氨基酸序列(genbankgi:37927147)，将其经密码子优化后合成α-葡聚糖酶基因dex，α-葡聚糖酶基因dex经酶切，与质粒pgapzαa连接，构建得到重组表达质粒pgapzαa-dex，经测序验证，序列正确；表达载体pgapzαa-dex使用avrii单酶切，使之线性化，电击转化感受态毕赤酵母km71h，在含有博来霉素的ypd平板上筛选得到阳性克隆，得到工程菌km-hz；
(2)单倍体产酶工程菌km-hk的构建：对质粒pgapzαa进行改造，将其原有的博来霉素抗性基因及相应调控序列替换为卡那霉素抗性基因及相应调控序列，得到新的质粒pgk；
步骤(1)所述合成的α-葡聚糖酶基因dex经酶切，与pgk质粒连接，构建得到重组表达质粒pgk-dex，经测序验证，序列正确；表达载体pgk-dex使用avrii单酶切，使之线性化，电击转化感受态毕赤酵母km71h，在含有遗传霉素(geneticin)的ypd平板上筛选得到阳性克隆，得到工程菌km-hk；
(3)将工程菌km-hz、工程菌km-hk分别在ypd平板上划线，培养，分别用无菌水将上述平板上的菌落洗下，然后充分混合，混合后的菌液涂布于接合培养基平板，培养；刮取适量菌落，放入无菌水中充分混合，涂布于筛选培养基，培养，长出的阳性克隆，得到二倍体工程菌，命名为产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌(pichiapastoris)dip1，该菌株已于2020年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmccno.61378。
步骤(1)中所述的α-葡聚糖酶基因片段dex优选通过如下方法得到：根据朱黄青霉α-葡聚糖酶氨基酸序列(genbankgi:37927147)，综合考虑毕赤酵母密码子的使用偏爱性，基因的gc含量以及mrna的二级结构，经密码子优化后合成α-葡聚糖酶基因dex。
步骤(1)中所述的合成α-葡聚糖酶基因dex所用的引物优选为：
引物p1：cgcgaattccatggtactacagctaacacac；
引物p2：tgaatgcggccgcagaaatttgccactctcc。
步骤(1)中所述的合成α-葡聚糖酶基因dex所用的扩增程序优选为：95℃变性5min；94℃变性1min；53℃退火1min；72℃延伸2min，30个循环；72℃总延伸10min。
步骤(1)中所述的α-葡聚糖酶基因片段dex的核苷酸序列为seqidno.1。
步骤(1)中所述的酶切是指用ecori和noti进行双酶切。
步骤(1)中所述的连接优选为用t4dna连接酶连接。
步骤(2)中所述的得到质粒pgk的方法为：以质粒pgapzαa为模板，引物p3：gtgcggatcccatgtgagcaaaaggccagc和引物p4：gtgcggatccgcacaaacgaaggtct，进行pcr扩增，纯化后用bamhi酶切；以质粒ppic9k为模板，使用引物p5：gtgcggatccgtcggacagtgagtgtagtctt和引物p6：gatcagatctcgctctcccttatgcgactcct进行pcr扩增，纯化后用bamhi和bglii双酶切；将前述两个酶切产物用t4dna连接酶连接，转化感受态大肠杆菌jm109，于lb抗性平板(含30μg/ml卡那霉素)上筛选阳性克隆，经菌落pcr鉴定，测序，得到质粒pgk。
步骤(2)中所述的用于酶切α-葡聚糖酶基因片段dex和pgk质粒的酶为ecori和noti。
步骤(3)中所述的在ypd平板上划线培养的条件优选为30℃培养48h。
步骤(3)中所述的接合培养基平板的组分为0.2％～0.5％乙酸钠、0.5％～1％氯化钾、0.5％～2％葡萄糖、1.5％～2％琼脂。
步骤(3)中所述的在接合培养基平板上培养的条件优选为25℃培养72h。
步骤(3)中所述的筛选培养基优选为含有博来霉素、遗传霉素的ypd平板。
步骤(3)中所述的在筛选培养基中培养的条件优选为27℃～30℃培养72h。
一种产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1的摇瓶发酵培养方法，包括将产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1接种至发酵培养基中培养的操作。
所述发酵培养基的组成优选为：酵母粉8～12g/l，蛋白胨15～25g/l，2～6％(w/v)甘油；更优选为酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，5％(w/v)甘油。
所述的培养温度优选为27～30℃，转速为240～260r/min，培养时间为96～120h；更优选培养温度为30℃，转速为250r/min，培养时间为100h。
一种产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1的发酵罐流加培养方法，包括如下步骤：
1)种子培养：将产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1于ypd培养基中进行斜面培养后，转入液体培养基中培养；
2)将步骤1)中培养后的产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1接种到发酵罐培养基中培养，培养条件为：温度28～30℃，ph5.0～6.0，溶氧量大于10％；
3)待甘油含量低于0.5％时，起始甘油流加，通过甘油流加维持溶氧在10％～20％之间进行发酵；
4)培养96～130小时即可。
步骤1)中所述的ypd培养基的组分为：含有100μg/ml博来霉素、200μg/ml遗传霉素、2％胰蛋白胨、2％葡萄糖和2％琼脂粉。
步骤1)中所述的ypd培养基培养的条件优选为：28℃～30℃培养2～3天。
步骤1)中所述的液体培养基的成分优选为：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，5％(w/v)甘油。
步骤1)中所述的液体培养基的培养温度优选为30℃。
步骤2)中所述发酵罐培养基的组成为：在bsm培养基中加入12ml/l的ptm1微量盐溶液及5％(w/v)的甘油；所述的pmt1的组成为：cuso4·5h2o6.0g/l、nai0.08g/l、mnso4·h2o3.0g/l、na2moo4·2h2o0.2g/l、h3bo30.02g/l、cocl20.5g/l、zncl220.0g/l、feso4˙7h2o65.0g/l、生物素0.2g/l、98％h2so45.0ml/l。
一种酶制剂，其含有保藏编号为gdmccno.61378的产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1的发酵培养物、该发酵培养物中的菌株和该发酵培养物中的上清液中的至少一种。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明的菌株在250ml三角瓶中摇瓶发酵培养和在发酵罐流加培养，α-葡聚糖酶的酶活分别达到220u/ml和1870u/ml，其产酶能力相对于已报道的产α-葡聚糖酶菌种处于领先水平，且培养方法简单，产酶能力强，遗传特性稳定，是一种适合高密度发酵产α-葡聚糖酶的优良菌种。
2.本发明提供一种产α-葡聚糖酶的毕赤酵母二倍体工程菌，与现有技术报道的重组毕赤酵母(黄曾慰等，重组毕赤酵母发酵生产α-葡聚糖酶的放大研究[j].甘蔗糖业，2016，2：20-26.doi：10.3969/j.issn.1005-9695.2016.02.005)相比，在同样的培养条件和周期下，其所产α-葡聚糖酶的酶活提高了30％以上。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中酶活的定义和测定方法：
1、酶活定义：采用dns法，在45℃、ph5.5的条件下，每分钟催化底物水解产生1μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活单位，以u表示。
2、酶活测定方法：发酵液经12000r/min离心5min后取上清液，经稀释适当倍数后即为待测的酶液。取900μl0.02g/ml的dextrant2000溶液作为反应底物，置于45℃恒温水浴中保温5min，然后加入100μl酶液，反应10min，加入2mldns(二硝基水杨酸钠试剂)以终止反应，沸水浴5min，然后迅速将其冷却，用蒸馏水定容至25ml，于540nm下测定吸光值。从标准曲线的回归方程求得相对应的葡萄糖的量，并计算出酶活。
实施例1：表达α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1的构建
1.实验方法
根据朱黄青霉(penicilliumminioluteum)的α-葡聚糖酶氨基酸序列(genbankgi:37927147)，综合考虑毕赤酵母密码子的使用偏爱性，基因的gc含量以及mrna的二级结构，经密码子优化后，合成α-葡聚糖酶基因dex(序列如seqidno.1所示)，全长1722bp，对应574aa；合成α-葡聚糖酶基因dex连接于puc57质粒(购于上海柯雷生物科技有限公司)中得到克隆载体puc57-dex。设计引物p1(cgcgaattccatggtactacagctaacacac)和引物p2(tgaatgcggccgcagaaatttgccactctcc)。以克隆载体puc57-dex为模板，p1、p2为引物，进行pcr扩增，条件为：95℃变性5min；94℃变性1min；53℃退火1min；72℃延伸2min，30个循环；72℃总延伸10min。pcr产物经胶回收得到α-葡聚糖酶基因片段dex。
(2)将(1)中所得α-葡聚糖酶基因片段dex和质粒pgapzαa(购于invitrogen公司)分别用ecori和noti进行双酶切。酶切产物经t4dna连接酶连接，转化感受态大肠杆菌jm109(购于北京百奥莱博科技有限公司)，于llb抗性平板(含25μg/ml博来霉素)上筛选阳性克隆。挑取若干克隆进行菌落pcr鉴定，测序鉴定，得到重组表达载体pgapzαa-dex。
(3)以质粒pgapzαa为模板，引物p3(gtgcggatcccatgtgagcaaaaggccagc)和引物p4(gtgcggatccgcacaaacgaaggtct)，进行pcr扩增，纯化后用bamhi酶切；以质粒ppic9k(购于invitrogen公司)为模板，使用引物p5(gtgcggatccgtcggacagtgagtgtagtctt)和引物p6(gatcagatctcgctctcccttatgcgactcct)进行pcr扩增，纯化后用bamhi和bglii双酶切；将前述两个酶切产物用t4dna连接酶连接，转化感受态大肠杆菌jm109，于lb抗性平板(含30μg/ml卡那霉素)上筛选阳性克隆，经菌落pcr鉴定，测序，得到质粒pgk。
将α-葡聚糖酶基因片段dex和质粒pgk分别用ecori和noti进行双酶切。酶切产物经t4dna连接酶连接过夜，转化感受态大肠杆菌jm109，于lb抗性平板(含30μg/ml卡那霉素)上筛选阳性克隆，经菌落pcr鉴定，测序，得到重组表达载体pgk-dex。
(4)表达载体pgapzαa-dex和表达载体pgk-dex分别用avrii酶切，37℃过夜，酶切产物使用dna片段纯化试剂盒(购于宝生物工程(大连)有限公司)纯化后得到线性化载体。感受态毕赤酵母km71h按照invitrogen公司毕赤酵母表达手册所述制备。所得的两种线性化载体分别与约80μl感受态毕赤酵母km71h混合，放入1mm电击转化杯中冰浴5min后电击转化。电击参数为：1600v、25μf、200ω。酵母细胞转化之后分别涂布于含100μg/ml博来霉素的ypd抗性平板(含100μg/ml博来霉素、1％酵母提取物、2％蛋白胨、琼脂2％)和含200μg/ml遗传霉素的ypd抗性平板(含200μg/ml遗传霉素、1％酵母提取物、2％蛋白胨、琼脂2％)，30℃培养3-4天。分别挑选阳性克隆，经菌落pcr，测序验证，获得两种单倍体工程菌km-hz和km-hk。
(5)将上一步所得两种单倍体工程菌分别在ypd平板上划线，30℃，培养48h。分别用无菌水将上述平板上的菌落洗下，然后充分混合。混合后的菌液涂布于接合培养基平板(0.5％乙酸钠、1％氯化钾、1％葡萄糖、2％琼脂)，25℃，培养72h。刮取适量菌落，放入无菌水中充分混合。涂布于含有100μg/ml博来霉素、200μg/ml遗传霉素的ypd平板，30℃，培养72h。挑选阳性克隆，经菌落pcr，测序验证，得到产酶二倍体工程菌，命名为产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌(pichiapastoris)dip1，该菌株已于2020年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno.61378。
实施例2
一种制备α-葡聚糖酶的方法(摇瓶发酵培养)，其步骤如下：
(1)菌种活化：将实施例1得到的产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1接到ypd斜面培养基(含有100μg/ml博来霉素、200μg/ml遗传霉素、1％酵母粉、2％胰蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂粉)，30℃培养约2～3天；
(2)摇瓶培养：将步骤(1)活化后的菌种转接入液体培养基(培养基成分：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，5％(w/v)甘油)中培养，培养条件为：250ml三角瓶中装液量40ml，温度30℃，转速250r/min，培养120小时；
(3)培养120小时后测定培养液中α-葡聚糖酶酶活为220u/ml。
实施例3
一种制备α-葡聚糖酶的方法(发酵罐流加培养)，其步骤如下：
(1)种子培养：将实施例1得到的产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1接到ypd培养基(含有100μg/ml博来霉素、200μg/ml遗传霉素、1％酵母粉、2％胰蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂粉)进行斜面培养，30℃培养约2～3天；转接入液体培养基(培养基成分：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，5％(w/v)甘油)中培养，培养条件为：250ml三角瓶中装液量40ml，温度30℃，转速250r/min，培养16h；然后转接入300mlypd培养基中，摇瓶培养，温度30℃，转速250r/min，至od600达到12～15，得到种子液；
(2)接种：将步骤(1)中培养后的产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1300ml种子液接入装有2.7lbsm培养基(组分：85％h3po426.7ml/l、caso4˙2h2o0.93g/l、k2so418.2g/l、mgso4˙2h2o14.9g/l、koh4.13g/l、5％(v/v)甘油40g/l、pmt112ml/l；其中pmt1的组成为：cuso4·5h2o6.0g/l、nai0.08g/l、mnso4·h2o3.0g/l、na2moo4·2h2o0.2g/l、h3bo30.02g/l、cocl20.5g/l、zncl220.0g/l、feso4˙7h2o65.0g/l、生物素0.2g/l、98％h2so45.0ml/l)的6.8l发酵罐中，培养，培养条件为：温度28～30℃，ph5.0～6.0，溶氧量大于10％；
(3)待甘油含量低于0.5％时，起始甘油流加，通过调节甘油流加量、搅拌转速和通气量，维持溶氧在10％～20％之间进行发酵；培养96小时后测定培养液中α-葡聚糖酶酶活为1870u/ml。
实施例4
单倍体工程菌km-hz的培养
(1)菌种活化：将实施例1中获得的单倍体工程菌km-hz接到ypd斜面培养基(含有1％酵母粉、2％胰蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂粉)，30℃培养约2～3天；
(2)摇瓶培养：将活化后的菌种转接入液体培养基(培养基成分：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，5％(w/v)甘油)中培养，培养条件为：250ml三角瓶中装液量40ml，温度30℃，转速250r/min，培养120小时；
(3)测定培养液中α-葡聚糖酶酶活为150u/ml。
实施例5
单倍体工程菌km-hk的培养
(1)菌种活化：将实施例1中获得的单倍体工程菌km-hk接到ypd斜面培养基(含有1％酵母粉、2％胰蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂粉)，30℃培养约2～3天；
(2)摇瓶培养：将活化后的菌种转接入液体培养基(培养基成分：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，5％(w/v)甘油)中培养，培养条件为：250ml三角瓶中装液量40ml，温度30℃，转速250r/min，培养120小时；
(3)测定培养液中α-葡聚糖酶酶活为135u/ml。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120>一株产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌及其构建方法、培养方法与应用
<160>7
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1722
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>α-葡聚糖酶基因片段dex的核苷酸序列
<400>1
catggtactacagctaacacacactgtggagctgatttctgtacttggtggcatgactct60
ggtgaaattaacactcaaacaccagttcagcctggaaatgttagacaatcacataagtac120
tctgttcaggtttccttggctggtactaacaacttccacgattctttcgtttacgagtcc180
attcctagaaacggaaatggtagaatctacgctccaacagatccacctaactctaatact240
ttggactcttccgttgatgacggtatttctatcgaaccttctattggattgaacatggct300
tggtcacaatttgagtattctcacgatgttgacgttaaaattttggctactgatggttca360
tctttgggatctccatccgacgttgttatcagacctgtttcaatttcttacgctatctcc420
cagtcagatgacggtggaattgttatcagagttcctgctgatgctaacggtagaaagttc480
tcagttgaatttaagacagatttgtacactttcttgtctgacggtaacgaatacgttaca540
tccggtggatcagttgttggagttgagccaactaatgctttggttattttcgcttcccca600
tttttgccttctggtatgatcccacatatgactcctgacaacactcaaacaatgactcca660
ggacctattaacaatggagattggggtgctaagtctatcttgtactttccacctggtgtt720
tattggatgaaccaagatcagtctggaaattccggaaagttgggatctaaccacatcaga780
ttgaactccaacacttactgggtttatttggctcctggtgcttacgttaagggagctatc840
gaatacttcacaaagcaaaacttctacgctactggacatggtatcttgtctggagagaat900
tacgtttatcaggctaacgctggagataattatattgctgttaagtctgactccacttca960
ttgagaatgtggtggcacaacaatttgggtggaggtcaaacatggtactgtgttggtcca1020
actattaacgctccacctttcaatactatggactttaacggtaattcaggaatctcctca1080
caaatctctgattacaagcaggttggtgctttctttttccaaactgacggaccagaaatt1140
taccctaactctgttgttcatgatgttttctggcacgttaacgatgacgctatcaagatt1200
tactactctggtgcttctgtttccagagctacaatctggaagtgtcataacgatccaatc1260
atccaaatgggttggacttccagagatatttcaggagttacaatcgacactttgaacgtt1320
atccacacaagatacatcaagtctgaaactgttgttccatccgctattatcggtgcttca1380
cctttctacgcttcaggaatgtctccagactccagaaagtcaatctctatgacagtttct1440
aacgttgtttgtgagggtttgtgtccatccttgtttagaatcactcctttgcaaaactac1500
aagaacttcgttgttaagaacgttgcttttcctgatggattgcagacaaattctattgga1560
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tggacaatcggaggtcaaaaggttactatggaaaacttccaagctaattctttgggacag1680
tttaatattgatggttcctactggggagagtggcaaatttct1722
<210>2
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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<212>dna
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
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<400>5
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>引物p5
<400>6
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<210>7
<211>32
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>引物p6
<400>7
gatcagatctcgctctcccttatgcgactcct32
1.一种产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌(pichiapastoris)dip1，已于2020年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno.61378。
2.权利要求1所述的产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1在生产α-葡聚糖酶中的应用。
3.一种产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)单倍体产酶工程菌km-hz的构建：根据朱黄青霉α-葡聚糖酶氨基酸序列(genbankgi:37927147)，将其经密码子优化后合成α-葡聚糖酶基因dex，α-葡聚糖酶基因dex经酶切，与质粒pgapzαa连接，构建得到重组表达质粒pgapzαa-dex，经测序验证，序列正确；表达载体pgapzαa-dex使用avrii单酶切，使之线性化，电击转化感受态毕赤酵母km71h，在含有博来霉素的ypd平板上筛选得到阳性克隆，得到工程菌km-hz；
(2)单倍体产酶工程菌km-hk的构建：对质粒pgapzαa进行改造，将其原有的博来霉素抗性基因及相应调控序列替换为卡那霉素抗性基因及相应调控序列，得到新的质粒pgk；
步骤(1)所述合成的α-葡聚糖酶基因dex经酶切，与pgk质粒连接，构建得到重组表达质粒pgk-dex，经测序验证，序列正确；表达载体pgk-dex使用avrii单酶切，使之线性化，电击转化感受态毕赤酵母km71h，在含有遗传霉素的ypd平板上筛选得到阳性克隆，得到工程菌km-hk；
(3)将工程菌km-hz、工程菌km-hk分别在ypd平板上划线，培养，分别用无菌水将上述平板上的菌落洗下，然后充分混合，混合后的菌液涂布于接合培养基平板，培养；刮取适量菌落，放入无菌水中充分混合，涂布于筛选培养基，培养，长出的阳性克隆，得到二倍体工程菌，命名为产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌(pichiapastoris)dip1，该菌株已于2020年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno.61378。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述的α-葡聚糖酶基因片段dex通过如下方法得到：根据朱黄青霉α-葡聚糖酶氨基酸序列(genbankgi:37927147)，综合考虑毕赤酵母密码子的使用偏爱性，基因的gc含量以及mrna的二级结构，经密码子优化后合成α-葡聚糖酶基因dex。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，
步骤(1)中所述的合成α-葡聚糖酶基因dex所用的引物为：
引物p1：cgcgaattccatggtactacagctaacacac；
引物p2：tgaatgcggccgcagaaatttgccactctcc；
步骤(1)中所述的合成α-葡聚糖酶基因dex所用的扩增程序为：95℃变性5min；94℃变性1min；53℃退火1min；72℃延伸2min，30个循环；72℃总延伸10min；
步骤(1)中所述的α-葡聚糖酶基因片段dex的核苷酸序列为seqidno.1。
6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，
步骤(2)中所述的得到质粒pgk的方法为：以质粒pgapzαa为模板，引物p3：gtgcggatcccatgtgagcaaaaggccagc和引物p4：gtgcggatccgcacaaacgaaggtct，进行pcr扩增，纯化后用bamhi酶切；以质粒ppic9k为模板，使用引物p5：gtgcggatccgtcggacagtgagtgtagtctt和引物p6：gatcagatctcgctctcccttatgcgactcct进行pcr扩增，纯化后用bamhi和bglii双酶切；将前述两个酶切产物用t4dna连接酶连接，转化感受态大肠杆菌jm109，于含30μg/ml卡那霉素的lb抗性平板上筛选阳性克隆，经菌落pcr鉴定，测序，得到质粒pgk。
7.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，
步骤(3)中所述的在ypd平板上划线培养的条件为30℃培养48h；
步骤(3)中所述的接合培养基平板的组分为0.2％～0.5％乙酸钠、0.5％～1％氯化钾、0.5％～2％葡萄糖、1.5％～2％琼脂；
步骤(3)中所述的在接合培养基平板上培养的条件为25℃培养72h；
步骤(3)中所述的筛选培养基为含有博来霉素、遗传霉素的ypd平板；
步骤(3)中所述的在筛选培养基中培养的条件为27℃～30℃培养72h。
8.一种产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1的摇瓶发酵培养方法，其特征在于，包括将产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1接种至发酵培养基中培养的操作。
9.一种产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1的发酵罐流加培养方法，包括如下步骤：
1)种子培养：将产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1于ypd培养基中进行斜面培养后，转入液体培养基中培养；
2)将步骤1)中培养后的产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1接种到发酵罐培养基中培养，培养条件为：温度28～30℃，ph5.0～6.0，溶氧量大于10％；
3)待甘油含量低于0.5％时，起始甘油流加，通过甘油流加维持溶氧在10％～20％之间进行发酵；
4)培养96～130小时即可。
10.一种酶制剂，其特征在于，所述的酶制剂含有保藏编号为gdmccno.61378的产α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌dip1的发酵培养物、该发酵培养物中的菌株和该发酵培养物中的上清液中的至少一种。
技术总结