本发明属于功能性杂化纳米平台制备技术领域，涉及一种多功能核壳树状大分子铜络合物及其制备和应用。
背景技术：
在纳米医学领域，各种纳米平台已经被广泛用于癌症的成像和治疗。其中，聚酰胺-胺树状大分子因其具有完美的球状结构、单分散性以及良好水溶性、非免疫原性和易官能化等特点，得到了研究者们极大的重视和广泛的关注。但是由于单代的树状大分子尺寸较小(如第5代树状大分子只有5.4nm)，所以仍具有许多缺点，如有限的载药量、受限的基于epr效应的肿瘤被动靶向以及缺乏具有刺激反应能力的多功能性等。为了克服单代树状大分子的局限性，利用树状大分子作为反应性模块或构件，以构建具有更高复杂性和尺寸和结构可控的基于超结构树状大分子的纳米平台，并将其应用于前沿的癌症纳米医学领域已经成为科研工作者研究的最新方向。
众所周知，胶质瘤(glioblastoma,gbm)是世界范围内严重危害人类的最常见的恶性颅内肿瘤之一，其恶性程度高，生长多呈广泛浸润性，具有攻击性和高复发风险。而且脑胶质瘤之所以比较难治，其主要原因是独有的物质交换调节机构-血脑屏障(bloodbrainbarrier,bbb)保护着中枢神经系统。bbb可以维持中枢神经系统的稳态，阻止大多数具有潜在成像或治疗作用的大分子物质或药物的穿透，这大大减少了药物或其它物质在脑胶质瘤处的聚集，从而限制了脑胶质瘤的诊断和治疗。因此，为了实施脑胶质瘤的精准诊断和高效治疗，有必要设计一种合理的诊疗体系，使其既能在输送过程中突破血脑屏障，又可实现在肿瘤组织中的富集，从而达到发挥高效诊疗作用的目的。
检索国内外文献尚没有发现关于利用多功能化的核壳树状大分子络合铜离子用于诊疗一体化的研究。
技术实现要素：
本发明的目的就是为了提供一种多功能核壳树状大分子铜络合物及其制备和应用，可以跨越小鼠血脑屏障用于脑部肿瘤mr成像及化学动力学治疗，具有诊疗一体化性能和良好的应用前景等。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的技术方案之一提供了一种多功能核壳树状大分子铜络合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)在溶液条件下，取金刚烷乙酸(ad-cooh)活化后，加入到第3代聚酰胺胺树状大分子(g3.nh2)溶液中反应，经透析、冻干后，得到ad-g3.nh2；
(2)在溶液条件下，取β-环糊精(β-cd)活化后，加入到第5代聚酰胺胺树状大分子(g5.nh2)溶液中反应，经透析、冻干后，得到g5.nh2-cd；
(3)在溶液条件下，靶向多肽rgd与聚乙二醇(mal-peg-cooh)反应，经透析、冻干后，得到rgd-peg-cooh；
(4)在溶液条件下，穿膜多肽-皮啡肽(dermorphin,der)与聚乙二醇(mal-peg-cooh)反应，经透析、冻干后，得到der-peg-cooh；
(5)在溶液条件下，取2-吡啶甲酸(pyridine-2-carboxylicacid,pyr)活化后，再加入到ad-g3.nh2溶液中反应，经透析、冻干后，得到ad-g3.nh2-pyr；
(6)在溶液条件下，取rgd-peg-cooh活化后，加入到ad-g3.nh2溶液中反应，经透析、冻干后，得到ad-g3.nh2-peg-rgd；
(7)在溶液条件下，取der-peg-cooh活化后，加入到ad-g3.nh2溶液中反应，经透析、冻干后，得到ad-g3.nh2-peg-der；
(8)在溶液条件下，将ad-g3.nh2-pyr、ad-g3.nh2-peg-rgd和ad-g3.nh2-peg-der混合均匀，再加入到g5.nh2-cd溶液中反应，接着滴加入三乙胺、醋酸酐溶液并混合均匀，经透析、冻干后，得到m-cstd.nhac；
(9)在溶液条件下，将m-cstd.nhac与氯化铜超声分散，即得到目的产物多功能化的核壳树状大分子铜络合物。
进一步的，步骤(1)中，金刚烷乙酸、第3代聚酰胺胺树状大分子的摩尔比为1～1.5:1。所处溶液环境为dmso(即二甲基亚砜)溶液中。同时，金刚烷乙酸可采用dmso溶解的edc·hcl和nhs溶液活化。优选的，ad-cooh、edc·hcl、nhs和g3.nh2的摩尔比为1～1.5:10:10:1。
进一步的，步骤(1)中，反应的温度为室温，时间为2～4d；活化温度也可以为室温，活化时间为2～4h。
进一步的，步骤(2)中，β-环糊精、第5代聚酰胺胺树状大分子的摩尔比为25～30:1。此处，所处溶液条件也可以为dmso(即二甲基亚砜)溶液，同时，β-cd可以采用dmso溶解的cdi溶液活化。优选的，β-cd、cdi和g5.nh2的摩尔比为25～30:250:1。
进一步的，步骤(2)中，反应温度为室温，时间为58～62h；活化温度为30℃，活化时间为5～7h。
进一步的，步骤(3)中，靶向多肽rgd与聚乙二醇的摩尔比为0.8～1.2:1，优选为1:1。此处，所处溶液条件也可以为dmso(即二甲基亚砜)溶液。
进一步的，步骤(3)中，反应温度为室温，反应时间为20～24h。
进一步的，步骤(4)中，穿膜多肽-皮啡肽与聚乙二醇的摩尔比为1.6～2.4:1，优选为2:1。此处，所处溶液条件也可以为dmso(即二甲基亚砜)溶液。
进一步的，步骤(4)中，反应温度为室温，反应时间为20～24h。
进一步的，步骤(5)中，2-吡啶甲酸和ad-g3.nh2的摩尔比为45～55:1，优选为50:1。另外，步骤(5)中，反应温度优选为室温，时间优选为2～4d。此处，所处溶液条件也可以为dmso(即二甲基亚砜)溶液。同时，2-吡啶甲酸可以采用edc·hcl活化，对应的，pyr、edc·hcl和ad-g3.nh2的摩尔比为50:100:1。
进一步的，步骤(6)中，rgd-peg-cooh和ad-g3.nh2的摩尔比为8～12:1，优选为10:1。此处，所处溶液条件也可以为dmso(即二甲基亚砜)溶液。同时，rgd-peg-cooh可以采用edc·hcl和nhs溶液进行活化，优选的，rgd-peg-cooh、edc·hcl、nhs和ad-g3.nh2的摩尔比为10:50:50:1。
进一步的，步骤(6)中，反应温度为室温，时间为2～4d。
进一步的，步骤(7)中，der-peg-cooh和ad-g3.nh2的摩尔比为8～12:1，优选为10:1。此处，所处溶液条件也可以为dmso(即二甲基亚砜)溶液。同时，der-peg-cooh可以采用edc·hcl和nhs溶液进行活化，优选的，der-peg-cooh、edc·hcl、nhs和ad-g3.nh2的摩尔比为10:50:50:1。
进一步的，步骤(7)中，反应温度为室温，时间为2～4d。
进一步的，步骤(8)中，各物料的添加量满足：g5和g3的摩尔比为1:12～18，优选为1:15。其中，ad-g3.nh2-pyr、ad-g3.nh2-peg-rgd和ad-g3.nh2-peg-der摩尔比优选为1:1:1，且加入的g5和g3的总摩尔量与醋酸酐、三乙胺的摩尔比为1:(10～100):(10～100)。
进一步的，步骤(8)中，加入到g5.nh2-cd溶液中反应的温度为室温，时间为20～24h；滴加三乙胺、醋酸酐溶液后混合的温度为室温，时间为20～24h。
进一步的，步骤(1)、(3)、(4)、(5)中的透析为用截留分子量为1000的纤维素透析膜在超纯水2l×3中透析3天；
步骤(2)、(6)、(7)中的透析为用截留分子量为5000的纤维素透析膜在超纯水2l×3中透析3天；
步骤(8)中的透析为用截留分子量为50000的纤维素透析膜在超纯水2l×3中透析3天。
进一步的，步骤(9)中，m-cstd.nhac与氯化铜的摩尔比为1:(100～140)，超声时间为2～4min。此处，所处溶液条件为生理盐水。
本发明的技术方案之二提供了一种多功能核壳树状大分子铜络合物，其采用如上所述的制备方法制备得到。
本发明的技术方案之三提供了一种多功能核壳树状大分子铜络合物在制备肿瘤mr成像及化学动力学治疗试剂中的应用。该大分子铜络合物具有诊疗一体化性能，进行了体外抗脑胶质瘤的研究和通过尾静脉注射用于原位脑胶质瘤小白鼠模型的肿瘤mr成像及化学动力学治疗研究。
本发明利用氨基末端的壳组分树状大分子分别修饰了皮啡肽、rgd肽和吡啶，并通过超分子自组装与核组分树状大分子形成核壳树状大分子并作乙酰化处理，进而络合铜离子构建多功能化的纳米复合物用于原位脑胶质瘤的诊疗一体化。该发明利用多功能化的核壳树状大分子铜络合物实现bbb的穿透，并靶向脑胶质瘤，取得了不错的成像效果，提高了脑胶质瘤小鼠的生存率。通过对树状大分子纳米材料的理性设计和精准合成，该发明克服了树状大分子在应用上的一些缺陷，并且将目前临床上诊断和治疗两个分离的过程/功能集成于一个纳米材料，利用乙酰化的多功能核壳树状大分子铜络合物构建了一种能够穿越血脑屏障并靶向肿瘤进行肿瘤mr成像及化学动力学治疗的诊疗一体化纳米平台。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明的方法简单，易于操作分离，成本低廉，原料来源商品化，具有良好的发展前景；
(2)本发明制备得到的多功能化的核壳树状大分子铜络合物纳米平台，具有良好的水溶性，可以穿越血脑屏障对原位脑胶质瘤细胞具有抑制性的同时还可以有一定的r1弛豫率，可用于原位脑胶质瘤的化学动力学治疗和mr成像，具有诊疗一体化效应。
附图说明
图1为本发明制备的多功能化的核壳树状大分子铜络合物合成及应用示意图。
图2为实施例1制备的g3.nh2-ad(a)、g5.nh2-cd(b)、rgd-peg-cooh(c)、der-peg-cooh(d)、rgd-peg-g3.nh2-ad(e)、der-peg-g3.nh2-ad(f)、pyr-g3.nh2-ad(g)和g5.nhac-cd/ad-g3.nhac-peg-der/peg-rgd/pyr(即m-cstd.nhac)(h)的核磁共振氢谱图。
图3为实施例1制备的m-cstd.nhac与不同比例的铜离子滴定的uv-vis图(a)和拟合图(b)以及吸光度分析图(c)。
图4为实施例1中制备的m-cstd.nhac/cu(ii)的tem图。
图5为实施例1中和对比例中制备的一些纳米材料的表面电势对比图、水动力学直径对比图。
图6为证明实施例1中制备的m-cstd.nhac/cu(ii)及氯化铜能发生类芬顿反应的红外光谱图(a)和紫外光谱图(b)。
图7为实施例6中经不同纳米材料处理c6细胞24小时后的细胞活性图(a)、铜及铜络合物处理c6细胞(b)和bend.3细胞(c)24小时后的细胞活性图。
图8a为实施例7中经不同浓度的铜及铜络合物m-cstd.nhac/cu(ii)分别处理αvβ3整合素受体高/低表达的c6细胞4小时后铜离子的含量图
图8b和图8c为实施例8中体外构建血脑屏障模型以及用fitc标记的多功能化修饰的核壳树状大分子及其对照材料处理bend.3细胞単分子层6小时后，流式检测c6细胞里的荧光强度图。
图9为实施例10中经不同浓度的铜及铜络合物m-cstd.nhac/cu(ii)处理c6细胞24小时后细胞凋亡的流式检测图。
图10为实施例10中经不同浓度的铜及铜络合物处理c6细胞24小时后细胞中的谷胱甘肽含量图(a)和谷胱甘肽过氧化物酶含量图(b)。
图11为实施例11中不同浓度的铜及铜络合物m-cstd.nhac/cu(ii)处理c6细胞6小时后，能够体现细胞中活性氧含量的共聚焦显微镜荧光图。
图12为实施例12中铜及铜络合物m-cstd.nhac/cu(ii)的t1弛豫时间的倒数随cu浓度变化的线性关系图(a)以及小鼠原位脑胶质瘤的mr成像图(b)和相应的肿瘤部位信噪比变化图(c)。
图13为实施例13中尾静脉注射实施例1制备的m-cstd.nhac/cu(ii)的生理盐水溶液(100ml，[cu]＝8mm)体内抗肿瘤效果。(a)为小鼠体重变化图，(b)为小鼠生存率统计图。
图14为对比例1和对比例2制备的g5.nh2-cd/g3.nh2-ad(a)、g5.nhac-cd/ad-g3.nhac(b)和g5.nhac-cd/ad-g3.nhac-mpeg/pyr(c)的核磁共振氢谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
特别的，在本文中所披露范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
以下各实施例中，g3.nh2、g5.nh2、靶向多肽rgd、穿膜多肽der等原料均为市售产品。其中，g3.nh2、g5.nh2购自dendritech公司(midland，mi)；靶向多肽rgd购自sigma-aldrich公司(st.louis,mo)，序列为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-asparticacid)；穿膜多肽der由南京肽生物技术有限公司合成，序列为：酪氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-酪氨酸-脯氨酸-丝氨酸-半胱氨酸(tyr-dala-phe-gly-tyr-pro-ser-cys)。
而其余如无特别说明的原料或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售原料或常规处理技术。
本发明使用核磁共振氢谱(1hnmr)、紫外可见吸收光谱(uv-vis)、zeta电势及动态光散射分析(dls)、透射电子显微镜(tem)、傅里叶红外光谱等手段表征制备的多功能化纳米平台(m-cstd.nhac)；利用cck-8法测试m-cstd.nhac及其相关材料的生物相容性，评价m-cstd.nhac铜络合物(m-cstd.nhac/cu(ii))及相关对比材料的细胞毒性；然后利用电感耦合等离子光谱发生仪评估m-cstd.nhac/cu(ii)对脑胶质瘤的靶向性能、构建体外血脑屏障模型评价m-cstd.nhac的穿越血脑屏障性能；测试铜离子及铜络合物对脑胶质瘤细胞凋亡的影响；分析并对比铜离子及铜络合物在脑胶质瘤细胞内消耗谷胱甘肽及相关指标的能力，同时测定铜络合物对脑胶质瘤细胞中活性氧含量的影响；另外，测定铜及其铜络合物的弛豫率，并进行白鼠原位脑胶质瘤模型的肿瘤mr成像和化学动力学治疗实验，考察所制备的多功能化核壳树状大分子铜络合物纳米平台的体内mr成像及治疗效果，图1为本发明制备的纳米平台合成及应用示意图。
具体测试结果如下：
(1)1hnmr测试结果
在g3.nh2-ad的核磁共振氢谱图中(参见图2a)，2.2-3.4ppm是g3.nh2的特征质子峰，1.6-1.9ppm是ad的特征质子峰，根据他们的积分面积之比，计算出每个g3.nh2连接了1.1个ad分子；在g5.nh2-cd的核磁共振氢谱图中(参见图2b)，2.2-3.4ppm是g5.nh2的特征质子峰，3.4-4.0ppm及5.0ppm是β-cd的特征质子峰，根据他们的积分面积之比，计算出每个g5.nh2连接了13.9个cd分子；在rgd-peg-cooh的核磁共振氢谱图中(参见图2c)，3.4-3.6ppm是peg的亚甲基质子峰，7.1-7.3ppm是rgd多肽苯环上的质子质子峰，根据他们的积分面积之比，计算出每个peg连接了0.7个rgd分子；在der-peg-cooh的核磁共振氢谱图中(参见图2d)，3.4-3.6ppm是peg的亚甲基质子峰，7.1-7.3ppm是der多肽苯环上的质子质子峰，根据他们的积分面积之比，计算出每个peg连接了0.8个der分子；在rgd-peg-g3.nh2-ad的核磁共振氢谱图中(参见图2e)，根据他们特征峰的积分面积之比，可计算出每个g3.nh2-ad连接了3.4个rgd-peg分子；在der-peg-g3.nh2-ad的核磁共振氢谱图中(参见图2f)，根据他们特征峰的积分面积之比，可计算出每个g3.nh2-ad连接了3.4个der-peg分子；在pyr-g3.nh2-ad的核磁共振氢谱图中(参见图2g)，7.5、8和8.5ppm是吡啶环上的的特征质子峰,根据他们特征峰的积分面积之比，可计算出每个g3.nh2-ad连接了4个pyr分子；在g5.nhac-cd/ad-g3.nhac-peg-rgd/peg-der/pyr(即m-cstd.nhac)的核磁共振氢谱图中(参见图2h)，根据他们特征峰的积分面积之比，可计算出每个g5.nhac-cd连接了6.6个功能化的ad-g3.nhac分子，此外，在1.9ppm处还出现乙酰基的甲基质子峰,这表明终材料m-cstd.nhac表面剩余氨基已被乙酰化。
(2)uv-vis光谱测试结果
参见图3，图3a为铜离子与乙酰化树状大分子在不同摩尔比例下(60：1，80：1，100：1，120：1，140：1，160：1)的紫外-可见光光谱图。同时我们对其最大吸收峰602nm处的吸光度与铜离子与乙酰化树状大分子的比例进行非线性拟合(参见图3b)，得到每摩尔乙酰化核壳树状大分子可以络合110～130摩尔铜离子。最终以铜离子与多功能化的乙酰化核壳树状大分子在120：1的摩尔比例下进行后续实验。
通过测定cucl2、m-cstd.nhac、m-cstd.nhac/cu(ii)的uv-vis图谱(参见图3c)，结果表明氯化铜水溶液的吸收峰在814nm处，m-cstd.nhac/cu(ii)水溶液的吸收峰在602nm处，而m-cstd.nhac在这两处均没有吸收峰。这表明由于功能化修饰造成了铜络合物周围环境的变化，从而影响了其吸收峰的位置。同时，m-cstd.nhac/cu(ii)络合物uv-vis图谱中铜离子的吸收峰消失标志着溶液中不存在游离的铜离子，m-cstd.nhac与120摩尔当量的铜离子络合后，铜离子完全处于络合状态。
(3)tem和zeta电势及水动力学直径测试结果
tem测试用于确定终材料铜络合物m-cstd.nhac/cu(ii)实际的尺寸大小(参见图4)，最终测出终材料铜络合物m-cstd.nhac/cu(ii)平均尺寸为27.89±1.54nm。
水动力学直径测试结果(参见图5b)显示，进行多功能化修饰后m-cstd.nhac的水动力学直径(410.3nm)较不进行功能化修饰的核壳树状大分子cstd.nhac(207.3nm)有很明显的增加，但络合铜离子后却略呈现出下降趋势，从410.3nm减少到365.6nm。
zeta电势测定结果(参见图5a)表明多功能化的乙酰核壳树状大分子m-cstd.nhac表面电势为 20.1mv，比同等条件下不进行功能化修饰的乙酰化核壳树状大分子cstd.nhac(电势为 18.4mv)略高，但却比络合铜后的电势(21.2mv)略低，这可能是络合铜离子后影响纳米平台表面电势的原因。
(4)类芬顿反应测试结果
利用傅里叶红外光谱技术和uv-vis光谱技术测试铜及铜络合物发生类芬顿反应的能力(参见图6)，傅里叶红外光谱图(图6a)显示铜及铜络合物能够将还原型谷胱甘肽(gsh)还原成氧化型谷胱甘肽(gssg)，uv-vis光谱图(图6b)则证明了铜及铜络合物在存在gsh条件下和过氧化氢(h2o2)反应能够产生羟基自由基，降解亚甲基蓝(mb)。
(5)细胞毒性试验结果
参见图7a，与生理盐水对照组相比，m-cstd.nhac及其相关对照材料cstd.nhac-mpeg/pyr在试验浓度范围内对脑胶质瘤c6细胞没有明显细胞毒性，细胞存活率均在90％以上，说明在络合铜之前m-cstd.nhac本身不具有肿瘤细胞抑制性。络合铜离子后(参见图7b)，m-cstd.nhac/cu(ii)及其相关对照材料铜络合物各浓度的细胞存活率较m-cstd.nhac及其相关对照材料相比有了明显的下降，说明铜离子的存在有一定的细胞毒性，即有助于增强材料的肿瘤细胞抑制性。同时，选择铜及铜络合物m-cstd.nhac/cu(ii)通过cck-8法测试其对内皮细胞(bend.3)的细胞抑制性(参见图7c)，单独铜离子及m-cstd.nhac/cu(ii)在试验浓度范围内对bend.3细胞的细胞毒性比对c6细胞低，并且发现铜离子浓度在0-100μm的浓度范围内，m-cstd.nhac/cu(ii)对bend.3细胞没有明显细胞毒性，细胞存活率在90％以上。
(6)电感耦合等离子光谱测试结果
图8a显示经不同浓度的铜及铜络合物处理后c6细胞对铜的吞噬量以评价m-cstd.nhac/cu(ii)的特异性靶向效果。以生理盐水组作为空白对照，将不同浓度的铜及铜的络合物分别与αvβ3整合素受体高、低表达的c6细胞共培养4小时，然后通过电感耦合等离子光谱测试c6细胞对纳米颗粒的吞噬量。结果显示，随着cu离子浓度的升高，细胞对铜及铜的络合物的吞噬量逐渐增加，而且在研究浓度范围内，与铜的络合物共培养的αvβ3整合素受体高表达(未rgd阻断)的c6细胞对铜的吞噬量明显高于αvβ3整合素受体低表达(被rgd阻断)的c6细胞，说明材料中靶向分子rgd的修饰使m-cstd.nhac/cu(ii)对c6细胞有特异性靶向能力。
(7)流式细胞仪检测结果
图8b和8c显示经fitc标记的多功能化修饰的核壳树状大分子及其对照材料能够穿越bend.3细胞单分子层被c6细胞吞噬的能力。以生理盐水组为空白对照，先将多功能化修饰的核壳树状大分子及其对照材料用fitc进行荧光标记，然后利用transwell板上室培养bend.3细胞，下层培养c6细胞以构建体外血脑屏障模型。当上室细胞铺满整个小室，且细胞膜电阻达到200ωm时(体外血脑屏障模型构建成功)，上层培养基换成含有fitc标记的多功能化修饰的核壳树状大分子或其对照材料的培养基培养6h，收集下室的c6细胞，利用流式细胞仪检测其荧光强度。结果显示，fitc标记的多功能化修饰的核壳树状大分子具有穿越bend.3细胞单分子层被c6细胞吞噬的能力，而对照材料(没有穿膜多肽der的修饰)则与生理盐水组区别不大，证明没有穿越血脑屏障的能力。
图9显示经不同浓度的铜及铜的络合物处理后对细胞凋亡的影响。在实验同等浓度下，经铜及m-cstd.nhac/cu(ii)处理过的c6细胞均表现出了凋亡现象，且在研究浓度范围内，细胞凋亡程度随铜浓度的升高而升高，呈现铜浓度依赖性。
(8)细胞内谷胱甘肽水平及相关指标测试结果
图10显示经不同浓度的铜及铜络合物处理c6细胞后，细胞内部的谷胱甘肽水平及相关指标谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)水平的变化。在试验同等浓度下，经铜及m-cstd.nhac/cu(ii)处理过的c6细胞内部的谷胱甘肽及gpx水平差别不大，均随铜浓度的增加而降低，由此说明m-cstd.nhac/cu(ii)与单独铜离子的能力相当，均能消耗体内谷胱甘肽。
(9)细胞活性氧含量测试结果
体外培养c6细胞，用铜络合物m-cstd.nhac/cu(ii)处理c6细胞，观察同一时间不同浓度下c6细胞内活性氧含量的变化(参见图11)。共聚焦显微镜结果显示，经过铜络合物处理后，c6细胞活性氧含量随着材料中铜浓度的增加而增加，这与谷胱甘肽水平的降低相互呼应。
(10)磁共振(mr)分析结果
分别配制cu浓度为0.2，0.4，0.8，1.6和3.2mm的铜及铜的络合物m-cstd.nhac/cu(ii)的水溶液1ml，通过磁共振成像分析仪测定材料在不同cu浓度下的t1弛豫效应(参见图12a)。通过计算得出cu(ii)和m-cstd.nhac/cu(ii)的r1值分别为0.8679和0.7331mm-1s-1。cu离子和m-cstd.nhac络合后仍然保持相似的r1值，说明m-cstd.nhac/cu(ii)可以作为mr分子影像诊断中的t1阳性造影剂。
在白鼠体内构建原位脑胶质瘤模型，通过尾静脉注射m-cstd.nhac/cu(ii)的生理盐水溶液(100ml，[cu]＝8mm)来评价肿瘤部位mr成像效果。与注射前的空白组相比较，注射后小鼠肿瘤部位的mr信号逐渐增强(图12b)，说明m-cstd.nhac/cu(ii)可以随着血液流通在肿瘤部位富集并显示出mr信号。同时mr信噪比定量分析结果(图12c)显示，注射m-cstd.nhac/cu(ii)45min后肿瘤部位信噪比snr达到最大值，这些结果说明m-cstd.nhac/cu(ii)可以作为t1造影剂应用于增强的体内肿瘤mr成像诊断。
(11)体内抗肿瘤效果评价
在白鼠体内构建原位脑胶质瘤模型，每隔3天通过尾静脉注射m-cstd.nhac/cu(ii)的生理盐水溶液(100ml，[cu]＝8mm)来治疗小鼠脑胶质瘤，通过记录小鼠体重变化(参见图13a)及生存率(参见图13b)来评价化学动力学治疗效果。经化学动力学治疗后，m-cstd.nhac/cu(ii)组小鼠的体重变化比空白生理盐水组小，生存率也比空白组高，比如在建模28天时，空白组小鼠生存率为0，而治疗组小鼠生存率还保持在50％。这说明本发明制备的多功能化的核壳树状大分子m-cstd.nhac/cu(ii)具有良好的体内抗肿瘤活性。
下面结合具体实施例来对本发明进行详细说明。
实施例1
一种多功能化的核壳树状大分子铜络合物纳米平台的制备方法，参见图1所示，具体包括以下步骤：
(1)分别称取4.22mgad-cooh，41.62mgedc·hcl，21.98mgnhs，分别溶于5ml的dmso溶液中，然后将edc·hcl和nhs溶液逐滴加入到ad-cooh溶液中，室温搅拌3h。然后称取100mgg3.nh2溶于5ml的dmso溶液，将活化的ad-cooh溶液逐滴加入g3.nh2溶液中，继续反应3天，将得到的产物转移至截留分子量为1000的透析袋中、在蒸馏水中透析三天(2l×3)，进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的ad-g3.nh2，-20℃保存备用。
(2)分别称取43.64mgβ-cd,62.34mgcdi，分别溶于5ml的dmso溶液中，然后将cdi溶液逐滴加入到β-cd溶液中，室温搅拌6h。称取40mgg5.nh2溶于5ml的dmso溶液，将得到的活化的β-cd溶液逐滴加入g5.nh2溶液中，继续反应60h，将得到的产物转移至截留分子量为5000的透析袋中、在蒸馏水中透析三天(2l×3)，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的g5-cd，-20℃保存备用。
(3)分别称取10mgrgd，29mgmal-peg-cooh，分别溶于5ml的dmso溶液中，然后将rgd溶液逐滴加入到同样用dmso溶解的聚乙二醇(mal-peg-cooh)溶液中反应24h，将得到的产物转移至截留分子量为1000的透析袋中、在蒸馏水中透析三天(2l×3)，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的rgd-peg-cooh，-20℃保存备用。
(4)分别称取26.36mgder,29mgmal-peg-cooh，分别溶于5ml的dmso溶液中，然后将der溶液逐滴加入到同样用dmso溶解的聚乙二醇(mal-peg-cooh)溶液中反应24h，将得到的产物转移至截留分子量为1000的透析袋中、在蒸馏水中透析三天(2l×3)，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的der-peg-cooh，-20℃保存备用。
(5)分别称取4.44mgpyr，13.85mgedc·hcl，5.16mgg3.nh2-ad分别溶于5ml的dmso溶液中，然后将edc·hcl溶液逐滴加入到pyr溶液中，室温搅拌0.5h，然后将得到的活化的pyr溶液加入到同样用dmso溶解的ad-g3.nh2溶液中反应3天，将得到的产物转移至截留分子量为1000的透析袋中、在蒸馏水中透析三天(2l×3)，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的ad-g3.nh2-pyr，-20℃保存备用。
(6)分别称取16.95mg步骤(3)中所得到的rgd-peg-cooh，6.94mgedc·hcl，3.77mgnhs分别溶于5ml的dmso中，然后将edc·hcl和nhs溶液逐滴加入到rgd-peg-cooh溶液中，室温搅拌3h。然后称取5.16mgg3.nh2-ad溶于5ml的dmso溶液中，将得到的活化的rgd-peg-cooh溶液逐滴加入g3.nh2-ad溶液中，继续反应3天，将得到的产物转移至截留分子量为5000的透析袋中、在蒸馏水中透析三天(2l×3)，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的ad-g3.nh2-peg-rgd，-20℃保存备用。
(7)分别称取18.86mg步骤(4)中所得到的der-peg-cooh,6.94mgedc·hcl，3.77mgnhs分别溶于5ml的dmso中，然后将edc·hcl和nhs溶液逐滴加入到der-peg-cooh溶液中，室温搅拌3h。然后称取5.16mgg3.nh2-ad溶于5ml的dmso溶液中，将得到的活化的der-peg-cooh溶液逐滴加入g3.nh2-ad溶液中，继续反应3天，将得到的产物转移至截留分子量为5000的透析袋中、在蒸馏水中透析三天(2l×3)，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的ad-g3.nh2-peg-der，-20℃保存备用。
(8)上述步骤(5)、(6)、(7)中得到的材料各称取2.75mg、5.63mg、5.96mg分别溶于5ml的dmso中，室温搅拌混合，然后称取2.93mgg5.nh2-cd溶于5ml的dmso溶液中，将混合溶液逐滴加入g5.nh2-cd溶液中反应24h，然后加入三乙胺(250μl)混合均匀，30分钟后再逐滴加入醋酸酐溶液(150μl)，继续室温搅拌24h，将得到的产物转移至截留分子量为50000的透析袋中、在蒸馏水中透析三天(2l×3)，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的多功能化的核壳树状大分子g5.nhac-cd/ad-g3.nhac-peg-der/peg-rgd/pyr，即m-cstd.nhac，-20℃保存备用。
(9)称取上述步骤(8)中得到的材料m-cstd.nhac溶于生理盐水中，加入适量氯化铜固体(m-cstd.nhac与氯化铜的摩尔比为1:120)，然后超声分散，即得到多功能化的核壳树状大分子铜络合物m-cstd.nhac/cu(ii)的生理盐水溶液。
实施例2
取实施例1制备的各个材料5-10mg溶于500μl氘代水中，使用bruker400mhz核磁共振仪进行氢谱测试，结果如图2所示，在g3.nh2-ad的核磁共振氢谱图中(图2a)，2.2-3.4ppm是g3.nh2的特征质子峰，1.6-1.9ppm是ad的特征质子峰，根据他们的积分面积之比，计算出每个g3.nh2连接了1.1个ad分子；在g5.nh2-cd的核磁共振氢谱图中(图2b)，2.2-3.4ppm是g5.nh2的特征质子峰，3.4-4.0ppm及5.0ppm是β-cd的特征质子峰，根据他们的积分面积之比，计算出每个g5.nh2连接了13.9个cd分子；在rgd-peg-cooh的核磁共振氢谱图中(图2c)，3.4-3.6ppm是peg的亚甲基质子峰，7.1-7.3ppm是rgd多肽苯环上的质子质子峰，根据他们的积分面积之比，计算出每个peg连接了0.7个rgd分子；在der-peg-cooh的核磁共振氢谱图中(图2d)，3.4-3.6ppm是peg的亚甲基质子峰，7.1-7.3ppm是der多肽苯环上的质子质子峰，根据他们的积分面积之比，计算出每个peg连接了0.8个der分子；在rgd-peg-g3.nh2-ad的核磁共振氢谱图中(图2e)，根据他们特征峰的积分面积之比，可计算出每个g3.nh2-ad连接了3.4个rgd-peg分子；在der-peg-g3.nh2-ad的核磁共振氢谱图中(图2f)，根据他们特征峰的积分面积之比，可计算出每个g3.nh2-ad连接了3.4个der-peg分子；在pyr-g3.nh2-ad的核磁共振氢谱图中(参见说明书附图2g)，7.5、8和8.5ppm是吡啶环上的的特征质子峰,根据他们特征峰的积分面积之比，可计算出每个g3.nh2-ad连接了4个pyr分子；在g5.nhac-cd/ad-g3.nhac-peg-rgd/peg-der/pyr(即m-cstd.nhac)的核磁共振氢谱图中(图2h)，根据他们特征峰的积分面积之比，可计算出每个g5.nhac-cd连接了6.6个功能化的ad-g3.nhac分子，此外，在1.9ppm处还出现乙酰基的甲基质子峰,这表明终材料m-cstd.nhac表面剩余氨基已被乙酰化。
实施例3
通过uv-vis测定实施例1制备的m-cstd.nhac进行不同摩尔比下的铜离子滴定,首先制备m-cstd.nhac溶液，随后根据铜离子与m-cstd.nhac的不同摩尔比(60：1，80：1，100：1，120：1，140：1，160：1)平行添加到m-cstd.nhac溶液中，最后将混合物用水稀释至700μl。通过紫外-可见光谱仪检测并进行拟合以检查cu(ii)的饱和结合。结果如图3所示，602nm处为m-cstd.nhac/cu(ii)的最大吸收峰(图3a),经过对最大吸收峰602nm处的吸光度与铜离子与m-cstd.nhac的比例进行非线性拟合得到每摩尔m-cstd.nhac可以络合110～130摩尔铜离子(图3b)，然后以铜离子与m-cstd.nhac在120：1的摩尔比例下进行测定氯化铜(cucl2)、m-cstd.nhac、m-cstd.nhac/cu(ii)的uv-vis图谱(图3c)，结果表明cucl2水溶液的吸收峰在814nm处，m-cstd.nhac/cu(ii)水溶液的吸收峰在602nm处，而m-cstd.nhac在这两处均没有吸收峰。这表明由于功能化修饰造成了铜络合物周围环境的变化，从而影响了其吸收峰的位置。同时，m-cstd.nhac/cu(ii)络合物的uv-vis图谱中814nm处的铜吸收峰消失标志着溶液中不存在游离的铜离子，m-cstd.nhac与120摩尔当量的铜离子络合后，铜离子完全处于络合状态。
实施例4
配制实施例1制得的m-cstd.nhac/cu(ii)溶液(1mg/ml)通过tem测定其尺寸，结果如图4所示，终材料铜络合物m-cstd.nhac/cu(ii)平均尺寸为27.89±1.54nm。随后，配制相应材料的水溶液(2mg/ml)通过马尔文激光粒度仪(malvern,μk，633nm激光)用于测定水动力直径和表面电势。水动力学直径测试结果(图5a)显示，进行多功能化修饰后m-cstd.nhac的水动力学直径(410.3nm)较不进行功能化修饰的核壳树状大分子cstd.nhac(207.3nm)有很明显的增加，但络合铜离子后m-cstd.nhac/cu(ii)却略呈现出下降趋势，从410.3nm减少到365.6nm。zeta电势测定结果(图5b)表明m-cstd.nhac表面电势为 20.1mv，比同等条件下不进行功能化修饰的乙酰核壳树状大分子cstd.nhac(电势为 18.4mv)略高，但却比络合铜后m-cstd.nhac/cu(ii)的电势(21.2mv)略低，这可能是络合铜离子后影响纳米平台表面电势的原因。
实施例5
按照(氯化铜与m-cstd.nhac)摩尔比120：1配制m-cstd.nhac/cu(ii)复合物溶液并保持溶液中cu(ii)浓度为10mm，并与浓度同为10mm的gsh进行等体积混合，然后将混合液进行冻干，通过傅里叶红外光谱仪进行表征，结果如图6a所示，与商品gssg的傅里叶红外光谱相似，m-cstd.nhac/cu(ii)复合物 gsh组和氯化铜 gsh组在2553cm-1处(代表巯基，-sh)均没有出现相应的峰，说明铜离子的存在使得gsh的-sh基团被氧化，生成了gssg。
分别配制10μg/ml亚甲基蓝(mb)溶液、10mmh2o2溶液、10mm的gsh溶液和含10mmcu(ii)的m-cstd.nhac/cu(ii)复合物溶液，以不同的组合方式进行等体积混合，30分钟后利用uv-vis测试吸光度来测量·oh诱导的mb降解。结果如图6b所示，与氯化铜相似，m-cstd.nhac/cu(ii)复合物在存在gsh条件下和过氧化氢(h2o2)反应能够产生羟基自由基，降解亚甲基蓝(mb)。
实施例6
以c6细胞或bend.3细胞作为模型细胞来检验实施例1中所制得的m-cstd.nhac及其对照材料、铜以及铜络合物m-cstd.nhac/cu(ii)的细胞毒性。以10000个细胞/孔的密度将细胞种于96孔板中，培养于添了加100u/ml青霉素，100u/ml链霉素和10％fbs的100μldmem培养基中，37℃，5％二氧化碳浓度下培养过夜。随后将培养基换成100μl含不同浓度的材料的dmem培养液，继续培养24h。随后将培养液倒掉，加入含10％cck-8的100μldmem培养基溶液，继续培养2h。用多功能酶标仪测试波长450nm下的吸光值。结果如图7所示，与生理盐水对照组相比，m-cstd.nhac及其相关对照材料cstd.nhac-mpeg/pyr在试验浓度范围内对脑胶质瘤c6细胞没有明显细胞毒性，细胞存活率均在90％以上(图7a)，说明在络合铜之前m-cstd.nhac本身不具有肿瘤细胞抑制性。而络合铜离子后，m-cstd.nhac/cu(ii)及其相关对照材料铜络合物各浓度的细胞存活率较m-cstd.nhac及其相关对照材料相比有了明显的下降(图7b)，说明铜离子的存在有一定的细胞毒性，即有助于增强材料的肿瘤细胞抑制性。同时，选择铜及铜络合物m-cstd.nhac/cu(ii)通过cck-8法测试其对内皮细胞(bend.3)的细胞抑制性(图7c)，单独铜离子及m-cstd.nhac/cu(ii)在试验浓度范围内对bend.3细胞的细胞毒性比对c6细胞低，并且发现铜离子浓度在0-100μm的浓度范围内，m-cstd.nhac/cu(ii)对bend.3细胞没有明显细胞毒性，细胞存活率在90％以上。
实施例7
选取鼠源胶质瘤c6细胞为模型细胞，通过检测细胞对铜络合物m-cstd.nhac/cu(ii)纳米颗粒的吞噬量来评价所制得的m-cstd.nhac/cu(ii)纳米颗粒的靶向效果。首先用无菌生理盐水分别配制不同铜浓度的cstd.nhac-mpeg/pyr/cu(ii)和m-cstd.nhac/cu(ii)溶液，按照20万细胞/孔的密度将c6细胞种于12孔板中。过夜培养后，一组c6细胞加入2μmrgd共培养3小时(定义为rgd阻断的c6细胞，即αvβ3整合素受体低表达的c6细胞)，另两组没有加rgd共培养的c6细胞定义为αvβ3整合素受体高表达的c6细胞。接着，加入上述配制好的纳米颗粒溶液的dmem培养基溶液分别与αvβ3整合素受体高、低表达的c6细胞在37℃下共培养4小时，以生理盐水作为空白对照。之后消化离心后收集细胞并用王水消化，通过电感耦合等离子光谱仪检测铜元素的细胞吞噬量。结果如图8a所示，随着cu离子浓度的升高，细胞对铜及铜络合物的吞噬量逐渐增加，而且在研究浓度范围内，与铜的络合物共培养的αvβ3整合素受体高表达(未rgd阻断)的c6细胞对铜的吞噬量明显高于αvβ3整合素受体低表达(被rgd阻断)的c6细胞，说明材料中靶向分子rgd的修饰使m-cstd.nhac/cu(ii)对c6细胞有特异性靶向能力。
实施例8
建立体外bbb模型，将bend.3细胞以2×105个细胞接种在上室(孔径：0.4μm)中。每2天更换一次培养基。6天后，将c6细胞接种在下腔室中。24小时后通过细胞膜电阻仪(millicel-res，密理博，美国)检测跨内皮电阻(teer)来确认屏障的完整性。当teer超过200ω/cm2时用于进一步实验。将fitc标记的多功能化修饰的核壳树状大分子及其对照材料以1mg/ml的浓度添加到上室培养基中，孵育6h后，用pbs冲洗下腔室中的c6细胞并消化收集在1mlpbs缓冲液中，然后用bdcalibur流式细胞仪(美国bd公司)确定细胞里fitc的荧光强度(绿色荧光)以评估多功能化的核壳树状大分子体外穿越血脑屏障的能力。结果如图8b-c所示，fitc标记的多功能核壳树状大分子具有穿越bend.3细胞单分子层被c6细胞吞噬的能力，而对照材料(没有der的修饰)则与生理盐水组区别不大，证明没有穿越血脑屏障的能力。
实施例9
将每孔2×105个c6细胞种植于12孔板中，培养过夜后倒掉培养基，加入含有不同浓度的铜及铜络合物m-cstd.nhac/cu(ii)的培养基共培养24小时。之后倒掉培养基，经pbs洗3次，用胰酶将细胞消化下来，转移到15ml离心管中，1000转离心5分钟去除上清液，加pbs1ml吹匀，放入冰盒，按照说明书经annexinv/pi凋亡检测试剂盒染色后，用流式细胞仪进行检测。结果如图9所示，在实验同等浓度下，经铜及m-cstd.nhac/cu(ii)处理过的c6细胞均表现出了凋亡现象，且在研究浓度范围内，细胞凋亡程度随铜浓度的升高而升高，呈现铜浓度依赖性。
实施例10
将每孔2×105个c6细胞种植于12孔板中，培养过夜后倒掉培养基，加入含有不同浓度的氯化铜及铜络合物m-cstd.nhac/cu(ii)的培养基共培养24小时。之后倒掉培养基，经pbs洗3次，用胰酶将细胞消化下来，转移到15ml离心管中，1000r/min离心5分钟去除上清液，然后加适当裂解液裂解细胞，根据碧云天bca蛋白试剂盒及其说明书测定总蛋白含量，根据碧云天总谷胱甘肽检测试剂盒及其说明书测定细胞内谷胱甘肽含量，根据碧云天谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒及其说明书测定细胞内谷胱甘肽过氧化物酶含量。结果如图10所示，在试验同等浓度下，经铜及m-cstd.nhac/cu(ii)处理过的c6细胞内部的谷胱甘肽及gpx水平差别不大，均随铜浓度的增加而降低，由此说明m-cstd.nhac/cu(ii)与单独铜离子的能力相当，均能消耗细胞内谷胱甘肽。
实施例11
将每孔2×105个c6细胞种植于12孔板中，培养过夜后倒掉培养基，加入含有不同浓度的铜络合物m-cstd.nhac/cu(ii)的培养基共培养4小时。之后倒掉培养基，经pbs洗3次，去除上清液，加入适当体积的终浓度为10微摩尔/升的活性氧探针(dcfh-da)。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的dcfh-da不少于1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的dcfh-da。之后，用共聚焦显微镜进行观察和拍照。结果如图11所示，经过铜络合物处理后，c6细胞活性氧含量随着材料中铜浓度的增加而增加，这与谷胱甘肽水平的降低相互呼应。
实施例12
首先，分别配制cu浓度为0.2，0.4，0.8，1.6和3.2mm的铜及铜络合物m-cstd.nhac/cu(ii)的水溶液1ml，通过磁共振成像分析仪测定材料在不同cu浓度下的t1弛豫效应，通过计算得出cu和m-cstd.nhac/cu(ii)的r1值，结果如图12a所示，cu(ii)和m-cstd.nhac/cu(ii)的r1值分别为0.8679和0.7331mm-1s-1，r1值相似，说明m-cstd.nhac/cu(ii)可以作为mr分子影像诊断中的t1阳性造影剂。
然后，进行构建小鼠体内原位脑胶质瘤模型(所有动物实验均严格按照动物保护协会标准进行)，即实验用的4-6周的雌性icr小白鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国，上海)。通过小鼠颅内注射(前囟向左移2mm，再向上移1mm处钻孔3mm深)按照1×106c6细胞/鼠的剂量注射肿瘤细胞在小白鼠体内构建原位脑胶质瘤模型，7天后通过尾静脉注射含有铜络合物m-cstd.nhac/cu(ii)的生理盐水溶液(100ml，[cu]＝8mm)来评价肿瘤部位mr成像效果(参见附图12)。其中，核磁共振成像仪扫描参数设置为：扫描序列参数为：重复时间(tr)＝300ms，回波时间(te)＝8.6ms，厚度＝0.5mm，采集矩阵(matrix)＝256mm×256，视野(fov)＝2.5×2.5cm2，翻转角度(fa)＝180°。结果如图12b所示，与注射前的空白组相比较，注射后小鼠肿瘤部位的mr信号逐渐增强，说明m-cstd.nhac/cu(ii)可以随着血液流通在肿瘤部位富集并显示出mr信号。同时mr信噪比定量分析结果(图12c)显示，注射m-cstd.nhac/cu(ii)45min后肿瘤部位信噪比snr达到最大值，这些结果说明m-cstd.nhac/cu(ii)可以作为t1造影剂应用于增强的体内肿瘤mr成像诊断。
实施例13
构建小鼠原位脑胶质瘤模型，七天后通过尾静脉注射含有铜络合物m-cstd.nhac/cu(ii)的生理盐水溶液(100ml，[cu]＝8mm)来评价化学动力学治疗效果。每间隔3天注射一次，总共给药3次。小鼠重量每2天称一次，生存状况每两天记录一次。结果如图13所示，经化学动力学治疗后，m-cstd.nhac/cu(ii)组小鼠的体重变化比空白生理盐水组小，生存率也比空白组高，比如在建模28天时，空白组小鼠生存率为0，而治疗组小鼠生存率还保持在50％。这说明实施例1制备的多功能核壳树状大分子m-cstd.nhac/cu(ii)具有良好的体内抗肿瘤活性。
对比例1
对照材料单纯乙酰的核壳树状大分子(g5.nhac-cd/ad-g3.nhac，即cstd.nhac)的制备方法为：
称取15.48mg实施例1中得到的ad-g3.nh2溶于5ml的dmso中，称取5.86mgg5.nh2-cd溶于5ml的dmso溶液中，然后将ad-g3.nh2溶液逐滴加入g5.nh2-cd溶液中反应24h，将得到的产物转移至截留分子量为50000的透析袋中、在蒸馏水中透析三天(2l×3)，然后进行冷冻干燥处理得到产物g5.nh2-cd/ad-g3.nh2(cstd)。随后称取20mgcstd溶于dmso溶液中，并加入三乙胺(250μl)混合均匀，30分钟后再逐滴加入醋酸酐溶液(150μl)，继续室温搅拌24h，将得到的产物转移至截留分子量为1000的透析袋中、在蒸馏水中透析三天(2l×3)，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的对照材料乙酰的核壳树状大分子g5.nhac-cd/ad-g3.nhac，即cstd.nhac，-20℃保存备用。表征结果如图14a和14b所示，根据他们特征峰的积分面积之比，可计算出每个g5.nh2-cd连接了12个功能化的ad-g3.nh2分子(图14a)，此外，在图14b中1.9ppm处还出现乙酰基的甲基质子峰,这表明终材料cstd.nhac表面剩余氨基已被乙酰化。
随后，通过电势粒径测定对比制备的cstd.nhac、多功能化修饰后的m-cstd.nhac以及络合铜离子后的m-cstd.nhac/cu的水合粒径和电势变化。水动力学直径测试结果(参见图5b)显示，进行多功能化修饰后m-cstd.nhac的水动力学直径(410.3nm)较不进行功能化修饰的核壳树状大分子cstd.nhac(207.3nm)有很明显的增加，但络合铜离子后却略呈现出下降趋势，从410.3nm减少到365.6nm。zeta电势测定结果(参见图5a)表明多功能化的乙酰核壳树状大分子m-cstd.nhac表面电势为 20.1mv，比同等条件下不进行功能化修饰的乙酰化核壳树状大分子cstd.nhac(电势为 18.4mv)略高，但却比络合铜后的电势(21.2mv)略低，这可能是络合铜离子后影响纳米平台表面电势的原因。
对比例2
对照材料-乙酰的无靶向无跨膜功能的核壳树状大分子(g5.nhac-cd/ad-g3.nhac-mpeg/pyr，即g5.nhac-cd/ad-g3.nhac-mpeg/pyr)的制备方法为：
(1)分别称取29mgmpeg-cooh，13.88mgedc·hcl，7.54mgnhs分别溶于5ml的dmso中，然后将edc·hcl和nhs溶液逐滴加入到mpeg-cooh溶液中，室温搅拌3h。然后称取5.16mgg3.nh2-ad溶于5ml的dmso溶液中，将得到的活化的mpeg-cooh溶液逐滴加入g3.nh2-ad溶液中，继续反应3天，将得到的产物转移至截留分子量为3500的透析袋中、在蒸馏水中透析三天(2l×3)，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的ad-g3.nh2-mpeg，-20℃保存备用。
(2)称取10.07mg(1)中得到的ad-g3.nh2-mpeg和2.75mg实施例1中得到的ad-g3.nh2-pyr分别溶于5ml的dmso中，室温搅拌混合，然后称取2.93mgg5.nh2-cd溶于5ml的dmso溶液中，将混合溶液逐滴加入g5.nh2-cd溶液中反应24h，然后加入三乙胺(250μl)混合均匀，30分钟后再逐滴加入醋酸酐溶液(150μl)，继续室温搅拌24h，将得到的产物转移至截留分子量为50000的透析袋中、在蒸馏水中透析三天(2l×3)，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的对照材料g5.nhac-cd/ad-g3.nhac-mpeg/pyr，即cstd.nhac-mpeg/pyr，-20℃保存备用。表征结果如图14c所示，并且根据他们特征峰的积分面积之比，可计算出每个g5.nhac-cd连接了7.1个功能化的ad-g3.nhac分子，此外，在1.9ppm处还出现了乙酰基的甲基质子峰,这表明终材料表面剩余氨基已被乙酰化。
(3)将上述材料cstd.nhac-mpeg/pyr溶于生理盐水中，按照1:120的摩尔比例加入氯化铜固体并超声分散，得到乙酰化的核壳树状大分子铜络合物cstd.nhac-mpeg/pyr/cu(ii)的生理盐水溶液。
随后，选取鼠源胶质瘤c6细胞为模型细胞，通过检测细胞对m-cstd.nhac/cu(ii)以及对照材料cstd.nhac-mpeg/pyr/cu(ii)纳米颗粒的吞噬量来评价所制得的m-cstd.nhac/cu(ii)纳米颗粒相比于铜及对照材料cstd.nhac-mpeg/pyr/cu(ii)纳米颗粒的靶向优越性。首先用无菌生理盐水分别配制不同铜浓度的cstd.nhac-mpeg/pyr/cu(ii)和m-cstd.nhac/cu(ii)溶液，按照20万细胞/孔的密度将c6细胞种于12孔板中。过夜培养后，一组c6细胞加入2μmrgd共培养3小时(定义为rgd阻断的c6细胞，即αvβ3整合素受体低表达的c6细胞)，另两组没有加rgd共培养的c6细胞定义为αvβ3整合素受体高表达的c6细胞。接着，加入上述配制好的纳米颗粒溶液的dmem培养基溶液分别与αvβ3整合素受体高、低表达的c6细胞在37℃下共培养4小时，以生理盐水作为空白对照。之后消化离心后收集细胞并用王水消化，通过电感耦合等离子光谱仪检测铜元素的细胞吞噬量。结果如图8a所示，随着cu离子浓度的升高，细胞对铜及铜络合物的吞噬量逐渐增加，而且在研究浓度范围内，与铜络合物共培养的αvβ3整合素受体高表达(未rgd阻断)的c6细胞对铜的吞噬量明显高于αvβ3整合素受体低表达(被rgd阻断)的c6细胞。在相同细胞(未rgd阻断)条件下，细胞对m-cstd.nhac/cu(ii)的吞噬量也显著高于cstd.nhac-mpeg/pyr/cu(ii)。这些结果说明材料中靶向分子rgd的修饰使m-cstd.nhac/cu(ii)对c6细胞有特异性靶向能力。
然后，建立体外bbb模型，将bend.3细胞以2×105个细胞接种在上室(孔径：0.4μm)中。每2天更换一次培养基。6天后，将c6细胞接种在下腔室中。24小时后通过细胞膜电阻仪(millicel-res，密理博，美国)检测跨内皮电阻(teer)来确认屏障的完整性。当teer超过200ω/cm2时用于进一步实验。将fitc标记的多功能化修饰的核壳树状大分子及其对照材料以1mg/ml的浓度添加到上室培养基中，孵育6h后，用pbs冲洗下腔室中的c6细胞并消化收集在1mlpbs缓冲液中，然后用bdcalibur流式细胞仪(美国bd公司)确定细胞里fitc的荧光强度(绿色荧光)以评估多功能化的核壳树状大分子体外穿越血脑屏障的能力。结果如图8b-c所示，fitc标记的多功能核壳树状大分子具有穿越bend.3细胞单分子层被c6细胞吞噬的能力，而对照材料(fitc-cstd.nhac-mpeg/pyr，即没有der的修饰)则与生理盐水组区别不大，证明没有穿越血脑屏障的能力。
以上实施例1中，所采用的各原料的添加量可以在以下范围内任意调整(即任意调整为其端值或任一中间点值)：
步骤(1)中，金刚烷乙酸、第3代聚酰胺胺树状大分子的摩尔比为1～1.5:1；
步骤(2)中，β-环糊精、第5代聚酰胺胺树状大分子的摩尔比为25～30:1；
步骤(3)中，靶向多肽rgd与聚乙二醇的摩尔比为0.8～1.2:1；
步骤(4)中，穿膜多肽-皮啡肽与聚乙二醇的摩尔比为1.6～2.4:1；
步骤(5)中，2-吡啶甲酸和ad-g3.nh2的摩尔比为45～55:1，反应温度为室温，时间为2～4d；
步骤(6)中，rgd-peg-cooh和ad-g3.nh2的摩尔比为8～12:1，反应温度为室温，时间为2～4d；
步骤(7)中，der-peg-cooh和ad-g3.nh2的摩尔比为8～12:1，反应温度为室温，时间为2～4d；
步骤(8)中，各物料的添加量满足：g5和g3的摩尔比为1:12～18，且加入的g5和g3的总摩尔量与醋酸酐、三乙胺的摩尔比为1:(10～100):(10～100)；加入到g5.nh2-cd溶液中反应的温度为室温，时间为20～24h；滴加三乙胺、醋酸酐溶液后混合的温度为室温，时间为20～24h。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
1.一种多功能核壳树状大分子铜络合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在溶液条件下，取金刚烷乙酸活化后，加入到第3代聚酰胺胺树状大分子溶液中反应，经透析、冻干后，得到ad-g3.nh2；
(2)在溶液条件下，取β-环糊精活化后，加入到第5代聚酰胺胺树状大分子溶液中反应，经透析、冻干后，得到g5.nh2-cd；
(3)在溶液条件下，靶向多肽rgd与聚乙二醇反应，经透析、冻干后，得到rgd-peg-cooh；
(4)在溶液条件下，穿膜多肽-皮啡肽与聚乙二醇反应，经透析、冻干后，得到der-peg-cooh；
(5)在溶液条件下，取2-吡啶甲酸活化后，再加入到ad-g3.nh2溶液中反应，经透析、冻干后，得到ad-g3.nh2-pyr；
(6)在溶液条件下，取rgd-peg-cooh活化后，加入到ad-g3.nh2溶液中反应，经透析、冻干后，得到ad-g3.nh2-peg-rgd；
(7)在溶液条件下，取der-peg-cooh活化后，加入到ad-g3.nh2溶液中反应，经透析、冻干后，得到ad-g3.nh2-peg-der；
(8)在溶液条件下，将ad-g3.nh2-pyr、ad-g3.nh2-peg-rgd和ad-g3.nh2-peg-der混合均匀，再加入到g5.nh2-cd溶液中反应，接着滴加入三乙胺、醋酸酐溶液并混合均匀，经透析、冻干后，得到m-cstd.nhac；
(9)在溶液条件下，将m-cstd.nhac与氯化铜超声分散，即得到目的产物多功能化的核壳树状大分子铜络合物。
2.根据权利要求1所述的一种多功能核壳树状大分子铜络合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，金刚烷乙酸、第3代聚酰胺胺树状大分子的摩尔比为1～1.5:1；
反应的温度为室温，时间为2～4d。
3.根据权利要求1所述的一种多功能核壳树状大分子铜络合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，β-环糊精、第5代聚酰胺胺树状大分子的摩尔比为25～30:1；
反应温度为室温，时间为58～62h。
4.根据权利要求1所述的一种多功能核壳树状大分子铜络合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，靶向多肽rgd与聚乙二醇的摩尔比为0.8～1.2:1；
反应温度为室温，反应时间为20～24h。
5.根据权利要求1所述的一种多功能核壳树状大分子铜络合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，穿膜多肽-皮啡肽与聚乙二醇的摩尔比为1.6～2.4:1；
反应温度为室温，反应时间为20～24h。
6.根据权利要求1所述的一种多功能核壳树状大分子铜络合物的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，2-吡啶甲酸和ad-g3.nh2的摩尔比为45～55:1，反应温度为室温，时间为2～4d；
步骤(6)中，rgd-peg-cooh和ad-g3.nh2的摩尔比为8～12:1，反应温度为室温，时间为2～4d；
步骤(7)中，der-peg-cooh和ad-g3.nh2的摩尔比为8～12:1，反应温度为室温，时间为2～4d。
7.根据权利要求1所述的一种多功能核壳树状大分子铜络合物的制备方法，其特征在于，步骤(8)中，各物料的添加量满足：g5和g3的摩尔比为1:12～18，且加入的g5和g3的总摩尔量与醋酸酐、三乙胺的摩尔比为1:(10～100):(10～100)；
加入到g5.nh2-cd溶液中反应的温度为室温，时间为20～24h；
滴加三乙胺、醋酸酐溶液后混合的温度为室温，时间为20～24h。
8.根据权利要求1所述的一种多功能核壳树状大分子铜络合物的制备方法，其特征在于，步骤(9)中，m-cstd.nhac与氯化铜的摩尔比为1:(100～140)，超声时间为2～4min。
9.一种多功能核壳树状大分子铜络合物，其采用如权利要求1-8任一所述的制备方法制备得到。
10.如权利要求9所述的一种多功能核壳树状大分子铜络合物在制备肿瘤mr成像及化学动力学治疗试剂中的应用。
技术总结