本发明属于工业微生物技术领域，尤其涉及一株具有抑制枯草芽孢杆菌增殖的埃切假丝酵母(candidaetchellsii)zb432及其应用，本发明还涉及所述埃切假丝酵母在减盐酱油生产中的作用。
背景技术：
传统高盐稀态酱油的生产采用开放、半开放的发酵方式进行，包括制曲和发酵两个阶段，经历多种微生物长达数月的共酵过程，生成脂肪族化合物、芳香族化合物、酮类、吡嗪等风味物质，形成具有特殊口感和风味的调味品。其中，高浓度盐对于发酵过程中功能菌群的维持至关重要，它有效抑制了发酵体系中易产生不良风味的微生物，使其难以生存或者维持在较低水平，所以高盐稀态酱油食盐浓度约16～18％。然而，随着人们对于健康的日益关注，降低食盐摄入量成为趋势，因此，减盐酱油日益受到消费者青睐。
现有市售减盐酱油多采用电渗析脱盐技术获得，这种方式既影响酱油风味，降低了酱油品质，又大大增加了生产的成本。还有报道采用减盐发酵工艺获得，然而当发酵体系中盐度降低后，芽孢杆菌、腐败乳酸菌等微生物由于缺少高盐的抑制作用而过度繁殖，将会导致发酵体系酸败或原油风味变差。也有报道进一步采用提高发酵体系中的温度来抑制杂菌的生成，然而该发酵体系仅适合少数耐高温微生物的生存发酵，往往造成减盐酱油产品风味不足。因此解决低盐酱油发酵过程中易感染杂菌导致发酵体系酸败的问题，同时保持酱油产品良好的风味，对于减盐酱油产品的推广具有重要意义，并且能够有效推动消费者形成低盐饮食习惯。
因此，寻找新的能够解决上述问题的减盐酱油发酵菌株是十分必要的。
技术实现要素：
本发明的发明人意外地从目前高盐稀态发酵酱醪中分离筛选获得一株埃切假丝酵母(candidaetchellsii)zb432，该菌株对盐度具有较宽的适应性，将其接种至低盐酱醪中发酵，具有较强的抑制芽孢杆菌的能力，无需另外添加抑菌剂或者改变生产工艺去抑制芽孢杆菌增殖。并且采用该埃切假丝酵母菌株发酵获得的低盐酱油色泽、香气、体态和口感方面得以显著提升，弥补了低盐酱油发酵时不能有效抑制芽孢杆菌过度增殖的缺陷。
基于上述发现，本发明提供一株埃切假丝酵母(candidaetchellsii)zb432，其保藏编号为：gdmccno：61293。
具体的菌株保藏信息如下：
保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心
保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼
保藏日期：2021年1月12日
保藏编号：gdmccno：61293
本发明的埃切假丝酵母(candidaetchellsii)zb432的菌落特征如下：在pda固态培养基上30℃培养48小时菌落圆形或椭圆形，直径3～5毫米，白色不透明，表面光滑湿润，有光泽，容易挑起，菌落质地均匀，边缘整齐。
本发明还提供了所述埃切假丝酵母zb432的筛选方法，其包括如下步骤：
1)稀释按常规酱油发酵工艺发酵培养60天的高盐酱醪；
2)将1)中所得稀释液涂布在pda平板培养基上初筛；
3)接种2)中获得的初筛菌株发酵获得发酵液；
4)对3)中所得发酵液与抑菌指示菌进行抑菌性测试复筛，筛选出抗芽孢杆菌效果最好的酵母菌菌株；
5)对4)中筛选的酵母菌菌株进行形态学、生理生化、its序列分析鉴定。
在某些实施方案中，本发明所述的筛选方法，其中步骤2)中初筛菌株形态特征为：菌落呈圆形或椭圆形，乳白色，表面湿润光滑，显微镜下呈椭球型，具有出芽生殖或分裂生殖特征。
在某些实施方案中，本发明所述的筛选方法，其中步骤3)中还包括发酵液的制备方法：
a)将初筛菌株接种至ypd培养基中培养；
b)将a)所得培养液离心，取上清液过滤。
在某些实施方案中，本发明所述的筛选方法，其中步骤4)中还包括，抑菌指示菌为芽孢杆菌(bacillus)。
在某些实施方案中，本发明所述的筛选方法，其中步骤4)中还包括，抑菌指示菌为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)中的一种或者多种。
在某些实施方案中，本发明所述的筛选方法，其中步骤4)中枯草芽孢杆菌为从低盐发酵酸化酱醪中分离获得。
在某些实施方案中，本发明所述的筛选方法，其中步骤4)中发酵液的抑菌性测试采用牛津杯琼脂扩散法进行筛选。
本发明还提供了由所述埃切假丝酵母(candidaetchellsii)zb432发酵的发酵液。
本发明还提供了所述埃切假丝酵母(candidaetchellsii)zb432或其发酵液在制备减盐和/或低盐发酵酱油中的用途。
优选地，所述减盐和/或低盐发酵酱油中氯化钠浓度为5％～15％。具体的，低盐发酵酱油中氯化钠浓度为5％～9％，减盐发酵酱油中氯化钠浓度为9％～15％。
优选地，所述的埃切假丝酵母(candidaetchellsii)zb432或其发酵液在抑制芽孢杆菌中的用途。本发明的埃切假丝酵母zb432其发酵液可在减盐酱油发酵过程中抑制芽孢杆菌的增殖。
本发明还提供了采用所述埃切假丝酵母zb432制备减盐和/或低盐酱油的方法，其包括如下步骤：
ⅰ)往发酵酱醪中接种埃切假丝酵母zb432；
ⅱ)对ⅰ)中所得酱醪继续发酵至60天；
ⅲ)对ⅱ)中所得发酵酱醪压榨、过滤、灭菌获得酱油原油。
在某些实施方案中，本发明所述的制备方法，其中步骤ⅰ)中发酵酱醪发酵天数为2d～25d(例如5d、10d、15d、20d)。
在某些实施方案中，本发明所述的制备方法，其中步骤ⅰ)中还包括，接种埃切假丝酵母菌zb432菌液浓度为107～109cfu/ml。
在某些实施方案中，本发明所述的制备方法，其中步骤ⅰ)中还包括，埃切假丝酵母菌zb432菌液接种量为104、105、106cfu/g曲料。
在某些实施方案中，本发明所述的制备方法，其中步骤ⅰ)中还包括，发酵酱醪氯化钠浓度为5％～15％。
在某些实施方案中，本发明所述的制备方法，其中步骤ⅰ)和步骤ⅱ)中酱醪发酵温度为25℃～30℃。
发明的有益效果：
(1)采用本发明提供的埃切假丝酵母(candidaetchellsii)zb432菌株进行发酵，所得发酵液具有较好的抑制芽孢杆菌能力。
(2)本发明提供的埃切假丝酵母(candidaetchellsii)zb432菌株具有较宽的盐度适应性，将该菌株接种至现有的减盐酱油发酵工艺中，发酵过程中无需另外添加抑菌剂或者改变生产工艺去除杂菌芽孢杆菌的影响，显著提升了低盐酱油产品品质，弥补了现有的低盐酱油发酵工艺中不能有效抵抗芽孢杆菌的缺陷。
附图说明
图1为埃切假丝酵母zb432菌落形态与显微镜下的细胞形态示意图
图2为埃切假丝酵母zb432与candidaetchellsii的its序列比对结果示意图
图3为生长曲线图。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本领域常规食品级试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明实施例所用试验条件为本领域常规试验条件。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。
实施例1埃切假丝酵母zb432的分离筛选
1、菌株的初筛
将置于30℃恒温室发酵罐中发酵培养60天的高盐酱醪摇匀，并在超净台中取0.5-1ml至15ml离心管中，加入适量无菌玻璃珠，震荡5-10分钟，用无菌水将样品稀释至10-2，10-3，10-4浓度梯度，备用；
将稀释后的样品涂布于pda平板，每个样品三个平行；吸取100μl稀释液于含6～10个无菌玻璃珠平板培养基中，左右平移摇晃使菌液均匀涂布于平板，倒出玻璃珠；将接种后的pda培养基置于30℃恒温培养箱中培养2-3天。
挑取pda培养基中菌落呈圆形或椭圆形，乳白色或淡黄色，表面湿润光滑的单菌落进行镜检，从pda培养基中共挑选出67个单菌落进行镜检复筛。筛选显微镜下呈椭球型，出芽生殖或分裂生殖特征的菌株，进行多次划线纯化，共获得17株具有典型酵母形态的菌株，分别为y1、y2、y3、y4、y5、y6、y7、y8、y9、y10、y11、y12、y13、y14、y15、y16、y17。
2、菌株的复筛
将初筛获得的17株酵母活化后发酵制备代谢产物，通过代谢产物中产抑菌活性物质检测进行进一步的复筛。
酵母菌代谢产物的制备：将上述酵母菌挑取适量菌于含5mlypd培养基的试管中培养，30℃，210r/min，24h。24h后将酵母活化第二代，吸取200ul(体积分数2％接种量)菌液于含10mlypd培养基的试管中，30℃，210r/min空气摇床培养163h。取1.5ml发酵液于2ml灭菌离心管，10000r/min离心5min，上清液用0.22μm孔径的滤菌器过滤，收集无细胞发酵上清液滤液，获得酵母菌代谢产物，4℃冰箱保存备用。
指示菌菌悬液的制备：(1)指示菌分离从低盐发酵酸化酱醪中分离出的一株枯草芽孢杆菌12-3，枯草芽孢杆菌是酱油酿造过程中的常见异常增殖杂菌，通过常规的技术手段即可获得，即取1g低盐发酵酸化酱醪溶于5ml生理盐水中，充分震荡混匀，然后取100ul混合液涂布于pca平板固体培养基上，37℃培养12h。(2)菌悬液的制备将指示菌接种于lb肉汤培养基，37℃培养12h，连续活化培养两代，利用平板活菌计数法将各菌株用无菌生理盐水配制成终浓度为104cfu/ml的菌悬液作为指示菌菌悬液，备用。
ypd培养基：1％(w/v)酵母粉，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)葡萄糖。
lb肉汤培养基：1％(w/v)蛋白胨，1％(w/v)氯化钠，0.5％(w/v)葡萄糖，0.1％酵母膏粉，最终ph7.0±0.2；
pca固体培养基：胰蛋白胨5g/l,酵母浸粉2.5g/l，葡萄糖1.0g/l，琼脂15g/l，ph7.0。
产抑菌活性物质酵母菌的复筛：采用牛津杯琼脂扩散法进行筛选。指示菌培养基采用半固体营养琼脂培养基(0.7％)，配制半固体营养琼脂培养基后分装于试管中，每支试管10mlna，115℃灭菌15min后置于45℃-55℃烘箱内，备用。将稀释的指示菌(12-3)加入到固体营养琼脂培养基中，使其活菌浓度为104cfu/ml。用旋涡振荡器震荡均匀后，将其倾斜倒入已提前倒好的营养琼脂培养基中(牛津杯在倒入半固体前放置好，每个平板均匀放置7个牛津杯)，待半固体营养琼脂凝固后将牛津杯取出，形成双层培养基(上层0.7％琼脂，下层1.5％琼脂)。以培养基为空白对照，在小孔内加入100ul酵母菌代谢物，将含枯草芽孢杆菌12-3的平皿30℃培养16h，用游标卡尺，采用十字交叉法测量抑菌圈直径，以直径表示抑菌圈的大小。每次试验做2次平行，取平均值，测试结果如表1。
表1：不同酵母菌的抑菌结果
由表1可知，大部分酵母菌株无明显抑菌效果，对枯草芽孢杆菌12-3的生长没有抑制作用，y3则呈现明显抑菌圈，抑菌圈直径大小为13.98±0.13mm，酵母菌株y3具有较好的抑制芽孢杆菌的能力。
双层培养基；下层为营养琼脂培养基(na)，含0.5％(w/v)蛋白胨，0.3％(w/v)牛肉膏粉，1.5％(w/v)琼脂，ph7.3；上层培养基为半固体营养琼脂培养基，含0.5％(w/v)蛋白胨，0.3％(w/v)牛肉膏粉，0.7％(w/v)琼脂，ph7.3。
3、酵母菌株y3抑菌性能验证
纯培养体系：挑取酵母y3单菌落接种于ypd液体培养基于30℃、210r/min培养，枯草芽孢杆菌12-3单菌落于lb液体培养基37℃、210r/min，分别活化培养12h，制备种子液。分别接种酵母y3与枯草芽孢杆菌于50ml培养基(ypd 15％酱油)进行纯培养，酵母y3和枯草芽孢杆菌的接种浓度均为1×107cfu/ml，培养条件为30℃、200r/min，培养时间为72h。，培养条件为30℃、200r/min，培养时间为72h。
混菌培养体系：酵母与芽孢分别活化培养后，将酵母y3与枯草芽孢杆菌同时接种于培养基(ypd 15％酱油)，然后添加氯化钠溶液调整体系盐浓度为6％。菌液接种浓度为1×107cfu/ml，培养条件为30℃、210r/min，培养时间为72h。
活菌数测定：从纯培养体系、混菌培养体系中分别取第12h、24h、36h、48h、60h、72h的发酵液进行发酵活菌数测定。活菌数测试如下：取100μl发酵液加入到900μl无菌水中，依次做10倍梯度稀释，分别选取10-3、10-4、10-5、10-6梯度发酵液100μl均匀涂在平板培养基上，每个梯度3次重复。置于30℃恒温培养箱中培养，枯草芽孢杆菌12-3培养12h，酵母y3培养3天，选取菌落数介于30～300的培养皿计菌落数。将酵母y3接种至pda平板培养基上计数，将枯草芽孢杆菌12-3接种至lb平板培养基上计数。测试结果如图3所示：
图3中代号标示意义如下：c12-3为枯草芽孢杆菌12-3纯培养的生长曲线；c-y3为酵母y3(菌株zb432)纯培养的生长曲线；g12-3为枯草芽孢杆菌12-3和酵母y3共培养时芽孢杆菌12-3的生长曲线；g-y3为枯草芽孢杆菌12-3和酵母y3共培养时酵母y3(菌株zb432)的生长曲线。
由图3结果表明：酵母y3在纯培养与混合培养体系下生长表现一致，没有差异，表明枯草芽孢杆菌12-3对酵母y3的生长没有影响；枯草芽孢杆菌12-3在纯培养体系中生长较良好，在无外添加盐分时最高生物量达126330cfu/ml，在混合培养体系中，枯草芽孢杆菌12-3的活菌数均持下降趋势，说明其生长受到了酵母y3的抑制作用。
4、酵母菌株y3分子鉴定
采用通用引物its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)和its86(5’-gtgaatcatcgaatctttgaac-3’)扩增y3的its序列，并由华大基因测序，获知序列seqidno:1所示：
5’-aggacttcggatcttgcttgattgggggcataaaatattactgcacagagttattaacgtgtgctgttccatttctttgactccaataaggagcaacacctcgtaatccacaagaagtagattagagagaaagttcggcgctccaacaagcatgctactaggagatcctagaagcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcacaaa-3’(seqidno:1)
在数据库ncbi中通过blast发现其与candidaetchellsii序列覆盖度为93％，相似度超过97％，序列间存在个别碱基的差异，因此酵母y3为一株新的埃切假丝酵母。本实施例选育获得的酵母y3已经由发明人于2021年1月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，命名为埃切假丝酵母(candidaescheri)zb432，保藏编号为：gdmccno：61293，酵母y3与埃切假丝酵母(candidaescheri)zb432为相同菌株。
实施例2埃切假丝酵母zb432菌株耐盐特性的鉴定
挑取酵母zb432单菌落接种ypd培养基，于30℃、210r/min培养过夜获得种子液。以10％种子液接种量转接于含5％(m/m)、8％(m/m)、10％(m/m)12％(m/m)、15％(m/m)、18％(m/m)nacl的ypd液体培养基中，于30℃、210r/min培养72小时，分别在12h、24h、48h、72h测定od600。
从表2看出，随着盐度增加，y3培养72小时后，od600有所降低，但是仍能正常生长，说明y3耐盐性较好。在低盐体系，如5％(m/m)、8％(m/m)中，生长早期盐的加入对于细胞生长有一定促进作用，表现出一定嗜盐性。说明y3耐盐性良好，不仅适合在低盐发酵体系中应用，而且适合在含较高盐分的发酵体系中使用，应用范围较广。
表2：y3在不同盐度下的生长情况
实施例3埃切假丝酵母zb432菌株在低盐发酵中的效果验证
酱油发酵：取圆盘曲250g，置于900ml酱瓶中，加入450g15％(m/m)盐水，充分混匀，记为低盐对照组，在30℃恒温室进行发酵2天后，补充盐水至500g。并设置高盐对照组，加入18％(m/m)盐水，其他发酵条件与低盐对照组一致。
菌株zb432培养：zb432经活化一代后转接到含15％(m/m)氯化钠的ypd培养基，30℃，210r/min，恒温空气摇床培养3天。
菌株zb432回填：将培养3天的zb432种子液以104(水平1)、105(水平2)、106(水平3)cfu/g曲料的接种量回填到发酵第2天含15％(m/m)盐水的酱醪中，加入15％(m/m)盐水补至总重量为500g(菌液质量计入盐水总质量)，记为低盐回填组(水平1)、低盐回填组(水平2)、低盐回填组(水平3)。
发酵15天、25天、60天取样计数菌落总数和酵母数，并取发酵60天酱醪过滤得原油，测定总酸、氨氮、全氮等理化指标。
菌落总数和酵母数计数方法：将置于30℃恒温室发酵罐中发酵培养的酱醪摇匀，并在超净台中取0.5-1ml至15ml离心管中备用；用无菌生理盐水将样品稀释至10-1，10-2，10-3，10-4浓度梯度，待接种。将稀释后的样品分别涂布于pda，pca平板(环凯生物)，每个样品三个平行；吸取100μl稀释液于含无菌玻璃珠平板培养基中，左右平移摇晃使菌液均匀涂布于平板，倒出玻璃珠，置于30℃环境中培养。pca培养基接种后培养16h左右计数其菌落总数，pda培养基接种后培养2-3天对酵母进行计数，计数选择菌落数介于30-300的浓度梯度，结果取三个平行的平均值。
结果见表3、表4所示。低盐对照组菌落总数相比高盐对照组整体处于较高水平，而加入zb432后，菌落总数整体呈现下降趋势，随着添加量增加，对菌落总数的抑制作用越明显，说明zb432对低盐发酵体系中的细菌具有一定抑制作用。此外，低盐发酵原油总酸明显偏高，而回填组总酸随着添加量的提升，总酸水平逐渐接近高压对照组，说明zb432对于低盐发酵体系酸败菌有一定抑制作用。
表3：不同组别发酵过程中微生物计数
表4：不同组别原油理化指标对比
酱油感官评价：将发酵60天酱醪过滤获得原油，经巴氏杀菌后，组织有丰富经验的鉴评人员10人，从色泽、香气、体态、口感四个方面对黄豆酱进行打分，每一项为10分，权重分别为20％，30％，20％，30％，最终结果取平均分。
实验结果如下：低盐对照组所得原油的香气、口感等均不理想，感官品质明显低于高盐对照组，而添加不同浓度的菌株zb432种子液回填后，所得低盐回填组原油总酸得到显著的降低，尤其以低盐回填组(水平3)最为显著。低盐回填组(水平3)较低盐对照组所获得原油香气、口感获得明显提升，综合评价也获得提升，体现出zb432菌株在低盐发酵中具有较大应用潜力。
表5：不同组别感官鉴评结果
采用spme-gc-ms方式对低盐对照组和低盐回填组(水平3)原油进行挥发性风味成分分析，分析结果见表6所示，添加菌株zb432原油的酯类、醇类、酸类、醛类、酮类等风味成分均有提升，尤其是醇类，提升50％以上，酯类提升20％以上，使原油整体风味更佳饱满醇厚。
表6：不同组别原油风味物质总峰面积
因此，本发明埃切假丝酵母(candidaetchellsii)zb432能够抑制低盐环境下酱油发酵过程中的常见污染杂菌芽孢杆菌，实现从色泽、香气、体态、口感全方面明显提升原油的品质和风味，应用前景广阔。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
sequencelisting
<110>佛山市海天调味食品股份有限公司
<120>一株埃切假丝酵母zb432及其应用
<130>5.13
<160>1
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>209
<212>dna
<213>candidaetchellsii
<400>1
aggacttcggatcttgcttgattgggggcataaaatattactgcacagagttattaacgt60
gtgctgttccatttctttgactccaataaggagcaacacctcgtaatccacaagaagtag120
attagagagaaagttcggcgctccaacaagcatgctactaggagatcctagaagcgcaat180
gtgcgttcaaagattcgatgattcacaaa209
1.一株埃切假丝酵母(candidaetchellsii)zb432，其特征在于，所述埃切假丝酵母zb432保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：61293。
2.权利要求1所述的埃切假丝酵母(candidaetchellsii)zb432的发酵液。
3.权利要求1所述的埃切假丝酵母(candidaetchellsii)zb432或如权利要求2所述的发酵液在制备减盐和/或低盐发酵酱油中的用途。
4.权利要求3所述的用途，其特征在于，所述减盐和/或低盐发酵酱油中氯化钠浓度为5％～15％。
5.权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的埃切假丝酵母(candidaetchellsii)zb432或其发酵液在酱油发酵过程中抑制芽孢杆菌中的用途。
6.一种减盐和/或低盐酱油的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
ⅰ)往发酵酱醪中接种如权利要求1所述的埃切假丝酵母zb432；
ⅱ)对ⅰ)中所得酱醪继续发酵至60天；
ⅲ)对ⅱ)中所得发酵酱醪压榨、过滤、灭菌获得酱油原油。
7.权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤ⅰ)发酵酱醪发酵天数为2d～25d。
8.权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤ⅰ)接种埃切假丝酵母菌zb432菌液浓度为107～109cfu/ml。
9.权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤ⅰ)埃切假丝酵母菌zb432菌液接种量为104、105、106cfu/g曲料。
10.权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤ⅰ)中发酵酱醪氯化钠浓度为5％～15％。
11.权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤ⅰ)和步骤ⅱ)中酱醪发酵温度为25℃～30℃。
技术总结