本分案申请是基于申请号201510619910.2，申请日为2015年9月25日，发明名称为“一种含微血管管腔的双层皮肤及其制备方法”的中国专利申请的分案申请。
本发明属于生物医学工程中组织工程技术领域，主要涉及一种含微血管管腔的双层皮肤及其制备方法。
背景技术：
正常皮肤细胞对氧气和营养的需求、代谢废物的清除是靠细胞附近的血液扩散和运输作用实现，而目前基于成纤维细胞复合支架材料和表皮细胞构建的双层皮肤因缺乏血管结构，无法满足长期存活及功能性的要求，导致成纤维细胞的功能失调，角化细胞的迁移能力和增殖能力降低，最终造成皮肤组织的功能受限；将构建好的双层皮肤移植到创面上，由于双层皮肤中活细胞营养成分的获取和废物的排泄主要依靠创面基底的渗液完成，因此细胞的物质交换速度慢，严重影响双层皮肤中活细胞的存活及其功能的实现。含血管皮肤除了提高皮肤存活时间及功能之外，这种具有分化结构的双层皮肤还可以用于血管机制的基础科学研究，以及筛选对血管生成有抑制或促进作用的药物。
因此，如何构建出含有血管的双层皮肤及加速人工真皮替代物血管化引起广大研究者的关注。现有的血管化工程皮肤多数都是以细胞外基质（ecm）替代物为支架进行构建，例如2004年5月，金岩等人申请了有关专利（中国专利申请号03134540.9），该发明利用ⅰ型胶原作为支架结构构建了含有血管结构的组织工程皮肤。细胞外基质替代物尽管能构成细胞生长的外部微环境，但同时也带来很多外源性物质，例如牛胶原，同种异体真皮层、人造聚合物等，这些都存在一定的缺陷，即不同外源性物质的免疫原性，降解率，降解产物的毒性，宿主免疫应答，支架降解引起的组织纤维化，以及同周围组织机械性的不匹配，都可能成为影响构建皮肤结构的长期生物活性以及主要生物功能的关键因素。并且细胞外基质替代物均并非是由细胞自身分泌，外源性的添加不利于细胞间信号的传导，进而影响构建皮肤的结构及功能发挥。
另外，目前构建含微血管的双层皮肤模型主要在以成纤维细胞为主的真皮层加入内皮细胞，同时添加血管前新生因子以促进皮肤内的血管生成。现常用的添加因子有：血管内皮生长因子(vegf)，碱性成纤维生长因子(bfgf)以及血小板源性生长因子(pdgf)等，此方法经常需要重复实施或严格控制释放系统，例如所添加因子的浓度，不同添加因子间的配比以及各个因子作用时间等，这些均不可避免的造成整个构建过程的复杂性及不稳定性，在一定程度上限制了其应用。
技术实现要素：
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提出一种含微血管管腔的双层皮肤及其制备方法，通过将成纤维细胞，脐带间充质干细胞以及脐静脉内皮细胞以一定比例混合，使用多次接种法，利用细胞自身胞外基质分泌能力和旁分泌系统，一方面形成皮肤真皮的组织学结构，另一方面促进内皮细胞的增殖，迁移，管腔形成及稳定。这种模拟正常人体皮肤组配，通过细胞间相互作用和相互影响达到真皮层构成及真皮内微管腔形成的组织构建方法，避免了人为添加外源支架及血管前新生因子所带来结构和功能的不稳定以及操作的繁琐。
本发明制备的含微血管管腔双层皮肤，具有两层皮肤结构，自上而下分别为表皮层，含有微血管管腔的真皮层；所述表皮层由表皮细胞生发复层组成；所述含有微血管管腔的真皮层由成纤维细胞、脐带间充质干细胞和脐静脉内皮细胞构建而成。
本发明所提出的含微血管管腔双层皮肤的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、成纤维细胞和表皮细胞的提取：
将皮肤组织块浸入75%乙醇溶液中，再转入pbs溶液中浸洗至无血污；将组织块加入dispase消化液，置入4℃条件下放置16~17h；再加入胶原酶37℃条件下孵化1~3h左右，终止消化后在1000r/min下，离心8~10min，加入成纤维细胞培养液(gibico)37℃5%,co2条件培养；将组织块剥离下的表皮放至37℃预热的0.25%胰酶/edta消化液(gibico)中，转入37℃条件下消化8~10min，消化完成后终止，过滤获得的表皮，800r/min离心5~6min；离心结束后倾出上清，加入pbs缓冲液，800r/min离心5~6min；离心后倾出上清，加入表皮细胞培养液(gibico)，进行接种培养；
步骤二、原代提取脐带间充质干细胞和脐静脉内皮细胞
将0.8~1.2cm3大小的脐带组织用pbs缓冲液冲洗，剔除血管、结缔组织后，置于离心管内300~800r/min，离心5~8min，弃上清后再次离心至上清液无红色为止；将组织块按照间隔0.5cm进行接种，在无菌条件下放置10～20min，待组织块表面干燥时，加入含非必需氨基酸(0.1~0.6mmol/l),ｌ-谷氨酰胺(1~10mmol/l)，1×105ｕ/ｌ青霉素，链霉素，β-巯基乙醇(0.1~1.0mmol/l)及5~10%胎牛血清的高糖dmem培养基，在37℃、5%co2的条件下培养，每3～5ｄ换液1次；待细胞80%融合后，去除组织块，加入0.25%胰酶/edta消化传代培养，之后每代细胞80%融合后用0.25%胰酶/edta消化2~3min，500~1000ｒ/min离心5~10min后传代；
在无菌条件下，将18~20cm长、断面整齐的两段脐带分别用pbs缓冲液冲洗至无血迹，将脐带的动脉两端结扎，以防污染；再将0.1~0.5%胶原酶ⅱ注入一段脐带的脐静脉中使其充盈,另一条以同样的方法注入0.1~0.5%胶原酶ⅰ和0.25%胰酶/edta等比混合消化液使其充盈；将脐带置于37℃条件下孵育10~20min；收集两段脐静脉内的消化液,注入含10%胎牛血清的rpmi-1640培养液再次冲洗管腔,将消化液与冲洗液一并收集，500~1000r/min,离心5~8min,弃上清,加入rpmi-1640完全培养液,吹打均匀进行接种,置于5%co2,37℃条件下培养8~24h后更换培养液，去除未贴壁的细胞,然后每隔18~24h半定量换液1次至细胞生长铺满瓶底；
所述rpmi-1640完全培养液是指，在rpmi-1640培养液中加入5~20%胎牛血清,6~20ng/mlvegf，l-谷氨酰胺1~10mmol/l,青霉素100u/ml,链霉素100μg/ml；
步骤三、含微血管管腔结构的真皮层构建：
当第三代的成纤维细胞，脐带间充质干细胞及内皮细胞融合至70%~80%，将三种细胞以1.0×105~1.5×105个/ml的密度分别在构建基础培养基中重悬并于500~1000rpm/min离心5~8min；其中构建基础培养基的组成为，在体积比1:1的α-mem和rpmi-1640混合培养液中添加胰岛素1~35ug/ml，腺嘌呤10~50ug/ml，氢化可的松0.1~4.5ug/ml，vc20~80ug/ml，5~10%胎牛血清；
培养过程如下：第一天在预先包被有1~5%明胶的细胞培养小室（nunc，后文中简称小室）中接种以1:1:1比例混合的三种细胞，接种密度为0.15×106~0.5×106个/小室，18~24h后弃去构建基础培养基，随后继续铺以1~5%明胶，在37℃条件下孵育45~60min，弃明胶，再次接种1:1:1比例混合的三种细胞，接种密度为0.15×106~0.5×106个/小室，培养70~72h后，铺以1~5%明胶，继续孵育45~60min，弃明胶，按照体积比2:1接种成纤维细胞和脐带间充质干细胞的细胞悬液，接种密度为0.15×106~0.5×106个/小室，继续培养2~3d，隔天换液。
本步骤是构建的关键步骤。通过成纤维细胞，脐带间充质干细胞以及脐静脉内皮细胞在三维环境中以不同比例进行共培养，以建立含微血管管腔的真皮组织结构。间充质干细胞不仅具有很好的成膜效果而且还具有重要的内分泌功能，以往的间充质干细胞取材于骨髓，因取材有创性，且随供体年龄增加其细胞活力及数量随之下降等风险使其应用逐渐受到限制。后期的研究表明，脐带间充质干细胞具有骨髓间充质干细胞的大部分生物学特征，比如：细胞因子谱、表型特点等。并且脐带是分娩后的废弃物，来源广泛，得率高，能够满足后期产业化要求。
在真皮层引入脐带间充质干细胞的优势有以下几点：1）分泌胞外基质能力强，同成纤维细胞能够协同发挥分泌真皮层骨架成分的作用，能够增加真皮层厚度；2）通过旁分泌作用促进血管的增生。脐带间充质干细胞可分泌vefg、bfgf等促血管新生的活性因子。vegf是高度特异的促内皮细胞有丝分裂因子，刺激内皮细胞的增殖、分化，诱导血管生成；bfgf可刺激vegf受体的上调，与vegf产生协同作用，促进微血管管腔形成。除此之外，脐带间充质干细胞还可以分泌血管新生所需要的细胞外基质成分如整合素、钙粘素等参与血管的生成；3）脐带间充质干细胞具有分化能力，本发明将其同人脐静脉内皮细胞共培养，内皮细胞所形成的微环境会影响脐带间充质干细胞的分化方向，使其向血管内皮诱导分化，进一步形成微血管管腔样结构。
真皮层胞外基质分泌量需达到一定程度才能维持正常的皮肤结构及提供表皮所需营养。因此在真皮层的培养过程中，本发明采用了三次接种法。由于脐带间充质干细胞本身的结节式生长特性以及分泌大量胞外基质的功能，长期培养真皮层易出现模型收缩成球，导致真皮层构建的失败。因此本发明使用1~5%明胶接种前预先包被法及连续三次真皮层接种的方式，以缓解真皮层的收缩、增加真皮层厚度、缩短真皮层培养周期。在进行第三次真皮层接种时，以成纤维细胞：脐带间充质干细胞=2:1的比例进行培养构建，目的是为避免脐带间充质干细胞旁分泌因子对表皮层生发的影响。
步骤四、含微血管管腔结构的双层皮肤构建：将融合率达60%左右的第四代表皮细胞用构建培养液skc1重悬细胞并离心，以0.1~0.8×106个/小室的细胞密度进行接种。skc1培养的第1天为液下培养方式，从skc1液下培养的第2天开始进行气-液面培养。连续液下培养2~3d后换skc2培养液气-液面培养2~3d，接着换skc3培养液气-液面培养2~3d，最后换skc4培养液气-液面培养3~4d，构建过程完成。
上述培养液的成分如下：基础培养基的组成：在体积比为1:1的α-mem和f12混合液中添加胰岛素1~35ug/ml，腺嘌呤10~50ug/ml，氢化可的松0.1~4.5ug/ml，5~10%胎牛血清；培养液skc1是在基础培养基中添加10~50μg/ml的bpe，0.1~0.5ng/ml的egf，乙醇胺磷酸酯0.01~0.09nm,黄体酮2~10nm，商用肝素60~90μg/ml；培养液skc2是在基础培养基中添加10~50μg/ml的bpe，0.1~0.5ng/ml的egf，0.5~2.5mm的cacl2，20~80μg/ml的vc，乙醇胺磷酸酯0.01~0.09nm,黄体酮2~10nm；培养液skc3是在基础培养基中添加10~50μg/ml的bpe，0.1~0.5ng/ml的egf，2.6~3.5mm的cacl2，20~80μg/ml的vc，乙醇胺磷酸酯0.01~0.09nm,黄体酮2~10nm；培养液skc4是在基础培养基中添加10~50μg/ml的bpe，0.1~0.5ng/ml的egf，3.6~4.5mm的cacl2，20~80μg/ml的vc，乙醇胺磷酸酯0.01~0.09nm,黄体酮2~10nm，商用肝素60~90μg/ml；本步骤通过模拟正常人体皮肤表皮层的生发过程，在表皮不同生发阶段添加各生长因子，通过培养方式的改变，使表皮层正常生发为基底层、棘层、颗粒层、角质层。添加的因子不仅支持表皮层的生发而且能够维持真皮层的生长，微血管管腔结构的形成。
本发明在构建含有微血管管腔的双层皮肤模型中以成纤维细胞、脐带间充质干细胞以及脐静脉内皮细胞为种子细胞，使用真皮层多次接种法，并在构建不同阶段添加营养因子保证真皮及表皮层的生发。引入的脐带间充质干细胞来源广泛，易获取，得率高，能够满足后期产业化要求。利用脐带间充质干细胞的胞外基质分泌能力和旁分泌能力参与构成真皮层骨架和血管管腔。采用多次连续接种，增加真皮层厚度，缩短培养时间，避免真皮层长时间培养时因胞外基质分泌，细胞受到机械牵拉所带来的收缩问题，为下一步表皮层的接种提供有利条件。整个构建过程不引入外源性支架及血管前新生因子，利用细胞自身胞外基质分泌功能及旁分泌系统组装真皮层组织骨架，构成微血管管腔结构，模拟人体皮肤正常生发过程，达到组织学和人体皮肤结构的高度相似性。本发明可在短期内构建出含有微血管管腔的双层皮肤，操作过程简便，可重复性强，并能实现产业化。
附图说明
图1、正常的人脐静脉内皮细胞形态的照片；
图2、在24孔板中进行人成纤维细胞、脐带间充质干细胞以及人脐静脉内皮细胞三种细胞的2d共培养，6d后的照片。可见图中在不添加外源性刺激血管生成因子，依靠三种细胞的共培养，人脐静脉内皮细胞能够首尾相连，构成管腔样结构。
图3、为本实施例进行人成纤维细胞、脐带间充质干细胞以及人脐静脉内皮细胞三种细胞的共培养后，所形成的的管腔样结构表达内皮细胞标记物cd31的免疫组织化学染色结果。
具体实施方式
实施例中使用的成纤维细胞培养液、表皮细胞培养液、胰酶/edta消化液均购自gibico公司，所使用的细胞培养小室均购自nunc公司。
实施例1：一种含微血管管腔双层皮肤的制备方法
步骤一、成纤维细胞和表皮细胞的提取：
将皮肤组织浸入75%乙醇溶液中，再转入pbs溶液中浸洗至无血污；将组织块加入dispase消化液，置入4℃条件下放置16h；再加入胶原酶37℃孵箱孵化1h左右，终止消化后1000rpm/min，离心8min，加入成纤维细胞培养液进行培养，剥离下的表皮放至8ml37℃预热的0.25%胰酶/edta消化液中，转入37℃孵箱中消化8min，消化完成后终止，过滤获得的表皮，800r/min离心5min；离心结束后加入pbs缓冲液，800r/min离心5min；倒出上清，加入表皮细胞培养液，进行接种培养；
步骤二、脐带间充质干细胞和脐静脉内皮细胞的原代提取
将0.8~1.2cm3大小的脐带组织用pbs缓冲液冲洗，剔除血管、结缔组织后，置于50ｍl离心管内300rpm/min，离心5min，弃上清，再次离心至上清液无红色为止；将组织块接种于10cm培养皿中，间隔0.5cm,超净台内放置10min，待组织块表面干燥时，加入4ml含非必需氨基酸(0.1mmol/l),ｌ-谷氨酰胺(2mmol/l)，1×10ｕ/ｌ青霉素，链霉素，β-巯基乙醇(0.2mmol/l)及10%胎牛血清的高糖dmem培养基，在37℃、5%co2的孵箱内培养，每3d换液1次；待细胞80%融合后，去除组织块，加入0.25%胰酶/edta消化传代培养。之后每代细胞80%融合后0.25%胰酶/edta消化3min，1000ｒ/min离心5min后传代。
在超净台上，将脐带放入pbs培养皿中,挤出脐带中的血,用剪刀修齐两断面，分成20cm的一段，找出脐静脉用带平针头的注射器从一端插入脐静脉,血管钳固定,再用预热的pbs冲洗3次以上,将血迹完全冲洗干净，为防止脐动脉残留的血液混入,可将动脉分离少许用消毒线结扎,用止血钳钳夹另一端。从冲洗的针头中注入0.1%胶原酶ⅱ使其充盈,另一条以同样的方法注入0.1%胶原酶ⅰ和0.25%胰酶等比混合消化液；取出针头,用止血钳夹住注入端,移入无菌烧杯中,置于37℃培养箱中孵育15min；取出,松开注入端的血管钳,收集脐静脉内的消化液,然后注入含10%胎牛血清的rpmi-1640培养液再次冲洗管腔,将消化液与冲洗液一并收集于离心管,1000r/min,离心8min,弃上清,加入rpmi-1640完全培养液,用巴氏吸管轻轻吹打均匀,接种于培养瓶,置于5%co2,37℃培养箱中培养,24h后更换培养液去除未贴壁的细胞,然后每隔24h半定量换液1次至细胞生长铺满瓶底。
所述rpmi-1640完全培养液是指，在rpmi-1640培养液中加入5~20%胎牛血清,6~20ng/mlvegf，l-谷氨酰胺1~10mmol/l,青霉素100u/ml,链霉素100μg/ml。
步骤三、含微血管管腔结构的真皮层构建：细胞传至第三代，当成纤维细胞，脐带间充质干细胞及内皮细胞融合至70%~80%，三种细胞以1.5×10个/ml的密度分别在构建基础培养基中重悬并于800rpm/min离心5min；其中构建基础培养基的组成为：α-mem，rpmi-1640（体积比α-mem：rpmi-1640=1:1），胰岛素15ug/ml，腺嘌呤25ug/ml，氢化可的松3ug/ml，vc50ug/ml，10%胎牛血清。
培养过程如下：第一天时在预先包被有1%明胶的细胞培养小室中接种以1:1:1比例混合的三种细胞，接种密度为0.2×10个/小室，18h后弃去细胞培养液，并继续铺以1%明胶，在孵箱中孵育45min，弃明胶，接种按照1:1:1比例混合的三种细胞，接种密度为0.2×10个/小室，72h后，铺以1%明胶，孵箱中孵育45min，弃明胶，接种成纤维细胞：脐带间充质干细胞=2:1的细胞悬液，接种密度为0.2×10个/小室，继续培养3d，隔天换液。
步骤四、含微血管管腔结构的双层皮肤构建：表皮细胞传代至第四代，待细胞培养至融合率达60%左右时，用构建培养液skc1重悬细胞并离心，以0.5×10/小室的细胞密度将其接种至细胞培养小室中。skc1培养的第1天为液下培养方式，从skc1液下培养的第2天开始进行气-液面培养。连续液下培养2d后换skc2培养液气-液面培养2d，接着换skc3培养液气-液面培养2d，最后换skc4培养液气-液面培养3d，构建过程完成。
上述培养液的成分如下：构建基础培养基：α-mem，f12（体积比α-mem：f12=1:1），胰岛素1ug/ml，腺嘌呤22ug/ml，氢化可的松0.22ug/ml，10%胎牛血清。培养液skc1是在构建基础培养基中添加15μg/ml的bpe，0.1ng/ml的egf，乙醇胺磷酸酯0.03nm,黄体酮3nm，商用肝素60μg/ml；培养液skc1是在构建基础培养基中添加15μg/ml的bpe，0.5ng/ml的egf，乙醇胺磷酸酯0.04nm,黄体酮5nm，商用肝素75μg/ml；培养液skc2是在构建基础培养基中添加15μg/ml的bpe，0.1ng/ml的egf，乙醇胺磷酸酯0.03nm,黄体酮3nm，2.5mm的cacl2，50μg/ml的vc；培养液skc3是在构建基础培养基中添加15μg/ml的bpe，0.1ng/ml的egf，乙醇胺磷酸酯0.03nm,黄体酮3nm，3.5mm的cacl2，50μg/ml的vc；培养液skc4是在构建基础培养基中添加15μg/ml的bpe，0.1ng/ml的egf，乙醇胺磷酸酯0.03nm，4.5mm的cacl2，黄体酮3nm,50μg/ml的vc，商用肝素60μg/ml。
实施例2：一种含微血管管腔双层皮肤的制备方法
步骤一、成纤维细胞和表皮细胞的提取：
将皮肤组织浸入75%乙醇溶液中，去除血污，再转入pbs溶液中浸洗至无血污；将组织块加入dispase消化液，置入4℃条件下放置17h；再加入胶原酶37℃孵箱孵化2h左右，终止消化后1000rpm/min，离心10min，加入成纤维细胞培养液进行培养；剥离下的表皮放至37℃预热的0.25%胰酶/edta消化液中，转入37℃孵箱中消化10min，终止后过滤获得的表皮，800rpm/min离心5min；
离心结束后倾出上清，加入10mlpbs缓冲液，800rpm/min离心5min；离心后倾出上清，加入表皮细胞培养液，进行接种培养；
步骤二、脐带间充质干细胞和脐静脉内皮细胞的原代提取
将0.8~1.2cm3大小的脐带组织用pbs缓冲液冲洗，剔除血管、结缔组织后，置于50ｍl离心管内300rpm/min，离心5min，弃上清，再次离心至上清液无红色为止；将组织块接种于培养皿中，间隔0.5cm,超净台内放置10min，待组织块表面干燥时，小心加入含非必需氨基酸(0.1mmol/l),ｌ-谷氨酰胺(2mmol/l)，1×10ｕ/ｌ青霉素，链霉素，β-巯基乙醇(0.2mmol/l)及10%胎牛血清的高糖dmem培养基，在37℃、5%co2的孵箱内培养，每3～5ｄ换液1次；待细胞80%融合后，去除组织块，加入0.25%胰酶/edta消化传代培养；之后每代细胞80%融合后0.25%胰酶/edta消化2min，1000ｒ/min离心5min，1：3传代。
无菌条件下将脐带放入提前盛有预热pbs培养皿中,剪去有钳夹痕及血肿的部分,挤出脐带中的血,用剪刀修齐两断面,分成20cm的一段。用带平针头的注射器从一端插入脐静脉,血管钳固定,再用预热的pbs冲洗至无血迹；从冲洗的针头中注入0.1%胶原酶ⅱ使其充盈,另一条以同样的方法注入0.1%胶原酶ⅰ和0.25%胰酶等比混合消化液；取出针头,用止血钳夹住注入端,移入无菌烧杯中,置于37℃培养箱中孵育15min。取出,松开注入端的血管钳,收集脐静脉内的消化液,然后注入含10%胎牛血清的rpmi-1640培养液再次冲洗管腔,将消化液与冲洗液一并收集于离心管,1000r/min,离心8min,弃上清,加入rpmi-1640完全培养液接种于培养瓶,置于5%co2,37℃培养箱中培养,24h后更换培养液去除未贴壁的细胞,然后每隔24h半定量换液1次至细胞生长铺满瓶底。
所述rpmi-1640完全培养液是指，在rpmi-1640培养液中加入5~20%胎牛血清,6~20ng/mlvegf，l-谷氨酰胺1~10mmol/l,青霉素100u/ml,链霉素100μg/ml。
步骤三、含微血管管腔结构的真皮层构建：细胞传至第三代，当成纤维细胞，脐静脉间充质干细胞及内皮细胞融合至70%~80%，三种细胞以1.0×10个/ml的密度分别在构建基础培养基中重悬并于800r/min离心5min。
其中构建基础培养基的组成为：α-mem，rpmi-1640（体积比α-mem：rpmi-1640=1:1），胰岛素10ug/ml，腺嘌呤25ug/ml，氢化可的松1ug/ml，vc50ug/ml，10%胎牛血清。
培养过程如下：第一天时在预先包被有2%明胶的细胞培养小室中接种以1:1:16的比例混合的三种细胞，接种密度为0.2x106个/小室，24h后弃去细胞培养液，并继续铺以2%明胶，在孵箱中孵育45min，弃明胶，接种1:1:1比例混合的三种细胞，接种密度为0.2x106/小室，72h后，弃明胶，接种成纤维细胞：脐带间充质干细胞=2:1的细胞悬液，接种密度为0.15x106个/小室，继续培养3d，隔天换液。
步骤四、含微血管管腔结构的双层皮肤构建：表皮细胞传代至第四代，待细胞培养至融合率达60%左右时，用构建培养液skc1重悬细胞并离心，以0.5×106个/小室的细胞密度将其接种至细胞培养小室中。skc1培养的第1天为液下培养方式，从skc1液下培养的第2天开始进行气-液面培养。连续液下培养2d后换skc2培养液气-液面培养2d，接着换skc3培养液气-液面培养2d，最后换skc4培养液气-液面培养4d，构建过程完成。
上述培养液的成分如下：构建基础培养基：α-mem，f12（体积比α-mem：f12=1:1）,胰岛素10ug/ml，腺嘌呤25ug/ml，氢化可的松1ug/ml,10%胎牛血清。
培养液skc1是在构建基础培养基中添加15μg/ml的bpe，0.5ng/ml的egf，乙醇胺磷酸酯0.04nm,黄体酮5nm，商用肝素75μg/ml；培养液skc2是在构建基础培养基中添加15μg/ml的bpe，0.5ng/ml的egf，乙醇胺磷酸酯0.04nm,黄体酮5nm，2.0mm的cacl2，35μg/ml的vc；培养液skc3是在构建基础培养基中添加15μg/ml的bpe，0.5ng/ml的egf，乙醇胺磷酸酯0.04nm,黄体酮5nm，3.0mm的cacl2，35μg/ml的vc；培养液skc4是在构建基础培养基中添加15μg/ml的bpe，0.5ng/ml的egf，乙醇胺磷酸酯0.04nm，黄体酮5nm,4.0mm的cacl2，35μg/ml的vc，商用肝素75μg/ml。
实施例3：一种含微血管管腔双层皮肤的制备方法
步骤一、成纤维细胞和表皮细胞的提取：
将皮肤组织浸入75%乙醇溶液中，去除血污，再转入pbs溶液中浸洗；将组织块加入dispase消化液，置入4℃条件下放置16h；再加入胶原酶37℃孵箱孵化2h左右，终止消化后1000rpm/min，离心10min，加入成纤维细胞培养液进行培养；剥离下的表皮放至37℃预热的0.25%胰酶/edta消化液中，转入37℃孵箱中消化10min，终止后过滤获得的表皮，800rpm/min离心5min；离心结束后倾出上清，加入10mlpbs缓冲液，800rpm/min离心5min；离心后倾出上清，加入表皮细胞培养液，进行接种培养；
步骤二、脐带间充质干细胞和脐静脉内皮细胞的原代提取
将脐带组织用pbs缓冲液冲洗，剔除血管、结缔组织后，置于50ml离心管内300rpm/min，离心5min，弃上清，再次离心至上清液无红色为止；将组织块接种于培养皿中，间隔0.5cm,超净台内放置10min，待组织块表面干燥时，小心加入含非必需氨基酸(0.1mmol/ｌ),ｌ-谷氨酰胺(2mmol/l)，1×10ｕ/ｌ青霉素，链霉素，β-巯基乙醇(0.2mmol/l)及10%胎牛血清的高糖dmem培养基，在37℃、5%co2的孵箱内培养，每3～5ｄ换液1次；待细胞80%融合后，去除组织块，加入0.25%胰酶/edta消化传代培养；之后每代细胞80%融合后0.25%胰酶/edta消化2min，1000ｒ/min离心5min，1：3传代。
无菌条件下将脐带放入提前盛有预热pbs培养皿中,剪去有钳夹痕及血肿的部分,挤出脐带中的血,用剪刀修齐两断面,分成20cm的一段。用带平针头的注射器从一端插入脐静脉,血管钳固定,再用预热的pbs冲洗至无血迹；从冲洗的针头中注入0.1%胶原酶ⅱ使其充盈,另一条以同样的方法注入0.1%胶原酶ⅰ和0.25%胰酶等比混合消化液；取出针头,用止血钳夹住注入端,移入无菌烧杯中,置于37℃培养箱中孵育15min。取出,松开注入端的血管钳,收集脐静脉内的消化液,然后注入含10%胎牛血清的rpmi-1640培养液再次冲洗管腔,将消化液与冲洗液一并收集于离心管,1000r/min,离心8min,弃上清,加入rpmi-1640完全培养液接种于培养瓶,置于5%co2,37℃培养箱中培养,24h后更换培养液去除未贴壁的细胞,然后每隔24h半定量换液1次至细胞生长铺满瓶底。
所述rpmi-1640完全培养液是指，在rpmi-1640培养液中加入5~20%胎牛血清,6~20ng/mlvegf，l-谷氨酰胺1~10mmol/l,青霉素100u/ml,链霉素100µg/ml。
步骤三、含微血管管腔结构的真皮层构建：细胞传至第三代，当成纤维细胞，脐静脉间充质干细胞及内皮细胞融合至70%~80%，三种细胞以1.0×10个/ml的密度分别在构建基础培养基中重悬并于800rpm/min离心5min。
其中构建基础培养基的组成为：α-mem，rpmi-1640（体积比α-mem：rpmi-1640=1:1），胰岛素10ug/ml，腺嘌呤25ug/ml，氢化可的松1ug/ml，vc50ug/ml，10%胎牛血清。
培养过程如下：第一天时在预先包被有2%明胶的细胞培养小室中接种以1:1:16的比例混合的三种细胞，接种密度为0.2x106个/小室，24h后弃去细胞培养液，并继续铺以2%明胶，在孵箱中孵育45min，弃明胶，接种1:1:1比例混合的三种细胞，接种密度为0.2x106/小室，72h后，弃明胶，接种成纤维细胞：脐带间充质干细胞=2:1的细胞悬液，接种密度为0.15x106个/小室，继续培养3d，隔天换液。
步骤四、含微血管管腔结构的双层皮肤构建：表皮细胞传代至第四代，待细胞培养至融合率达60%左右时，用构建培养液skc1重悬细胞并离心，以0.5×106个/小室的细胞密度将其接种至细胞培养小室中。skc1培养的第1天为液下培养方式，从skc1液下培养的第2天开始进行气-液面培养。连续液下培养2d后换skc2培养液气-液面培养2d，接着换skc3培养液气-液面培养2d，最后换skc4培养液气-液面培养4d，构建过程完成。
上述培养液的成分如下：构建基础培养基：α-mem，f12（体积比α-mem：f12=1:1）,胰岛素10ug/ml，腺嘌呤25ug/ml，氢化可的松1ug/ml,10%胎牛血清。
培养液skc1是在构建基础培养基中添加15μg/ml的bpe，0.5ng/ml的egf，乙醇胺磷酸酯0.04nm,黄体酮5nm，商用肝素75μg/ml；培养液skc2是在构建基础培养基中添加15μg/ml的bpe，0.5ng/ml的egf，乙醇胺磷酸酯0.04nm,黄体酮5nm，0.5mm的cacl2，35μg/ml的vc；培养液skc3是在构建基础培养基中添加15μg/ml的bpe，0.5ng/ml的egf，乙醇胺磷酸酯0.04nm,黄体酮5nm，2.6mm的cacl2，35μg/ml的vc；培养液skc4是在构建基础培养基中添加15μg/ml的bpe，0.5ng/ml的egf，乙醇胺磷酸酯0.04nm，黄体酮5nm,3.6mm的cacl2，35μg/ml的vc，商用肝素75μg/ml。图1是正常的人脐静脉内皮细胞形态，可以看到内皮细胞散在均匀分布；图2为本实施例在24孔板中进行人成纤维细胞、人脐带间充质干细胞以及人脐静脉内皮细胞三种细胞的2d共培养,6d后可见有明显的管腔样结构形成；图3为本实施例进行人成纤维细胞、人脐带间充质干细胞以及人脐静脉内皮细胞三种细胞的共培养后，所形成的的管腔样结构表达内皮细胞标记物cd31的免疫组织化学染色结果。
1.一种用于含微血管管腔的双层皮肤培养的培养液，其特征在于，由以下组分构成：在基础培养基中添加10~50μg/ml的bpe，0.1~0.5ng/ml的egf，3.6~4.5mm的cacl2，20~80μg/ml的vc，乙醇胺磷酸酯0.01~0.09nm,黄体酮2~10nm，商用肝素60~90μg/ml。
2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，由以下组分构成：在基础培养基中添加15μg/ml的bpe，0.1ng/ml的egf，乙醇胺磷酸酯0.03nm，4.5mm的cacl2，黄体酮3nm,50μg/ml的vc，商用肝素60μg/ml。
3.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，由以下组分构成：在基础培养基中添加15μg/ml的bpe，0.5ng/ml的egf，乙醇胺磷酸酯0.04nm，黄体酮5nm,4.0mm的cacl2，35μg/ml的vc，商用肝素75μg/ml。
4.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，由以下组分构成：在基础培养基中添加15μg/ml的bpe，0.5ng/ml的egf，乙醇胺磷酸酯0.04nm，黄体酮5nm,3.6mm的cacl2，35μg/ml的vc，商用肝素75μg/ml。
5.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述基础培养基的组成为：在体积比为1:1的α-mem和f12混合液中添加胰岛素1~35ug/ml，腺嘌呤10~50ug/ml，氢化可的松0.1~4.5ug/ml，5~10%胎牛血清。
6.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述基础培养基的组成为：在体积比为1:1的α-mem和f12混合液中添加胰岛素1ug/ml，腺嘌呤22ug/ml，氢化可的松0.22ug/ml，10%胎牛血清。
7.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述基础培养基的组成为：在体积比为1:1的α-mem和f12混合液中添加胰岛素10ug/ml，腺嘌呤25ug/ml，氢化可的松1ug/ml,10%胎牛血清。
技术总结