以ITGB1蛋白为靶标的抑制剂在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用的制作方法

专利2022-05-09 38

本发明涉及以itgb1蛋白为靶标的抑制剂在制备sars-cov-2药物中的应用。

背景技术：

新型冠状病毒肺炎是指由新型冠状病毒感染引起的肺炎，以发热、干咳、乏力为主要表现，部分患者以嗅觉、味觉减退或丧失等为首发症状，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等症状。重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，值得注意的是重型、危重型患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。轻症患者仅表现为低热、轻微乏力等症状，无肺炎表现。传播新冠病毒的主要是病人，但新冠病毒很隐匿，无症状感染者也可传播病毒。传播途径主要为呼吸道飞沫和接触传播等。

冠状病毒在系统分类上属套式病毒目(nidovirales)冠状病毒科(coronaviridae)冠状病毒属(coronavirus)。冠状病毒属的病毒是自然界广泛存在的一大类病毒。sars-cov-2是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov(引发重症急性呼吸综合征)。

冠状病毒粒子呈不规则形状，直径约60-220nm。病毒粒子外包着脂肪膜，膜表面有三种糖蛋白：刺突糖蛋白(s，spikeprotein，是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点)；小包膜糖蛋白(e，envelopeprotein，较小，与包膜结合的蛋白)；膜糖蛋白(m，membraneprotein，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成)。少数种类还有血凝素糖蛋白(he蛋白，haemaglutinin－esterase)。冠状病毒的核酸为非节段单链( )rna，长27-31kb，是rna病毒中最长的rna核酸链，具有正链rna特有的重要结构特征：即rna链5’端有甲基化“帽子”，3’端有polya“尾巴”结构。这一结构与真核mrna非常相似，也是其基因组rna自身可以发挥翻译模板作用的重要结构基础，而省去了rna－dna－rna的转录过程。

sars-cov-2为线性单链rna(ssrna)病毒，基因组全长约29kb，共包含10个编码基因，其中orf1a/b基因能够编码大的多聚蛋白，由自身编码的蛋白水解酶水解产生16个成熟的非结构蛋白(nsp1-16)，这些非结构蛋白参与调节病毒基因组rna的复制和转录以及病毒感染宿主等过程。编码结构蛋白的基因包括：s(spike)基因，编码病毒表面纤突糖蛋白；e(envelope)基因，编码病毒包膜蛋白；m(membrane)基因，编码病毒膜糖蛋白；n(nucleocapsid)基因，编码病毒核衣壳蛋白，此外还有多种参与种属特异性相关修饰和辅助蛋白的orf3a、orf6、orf7a、orf8、orf9等编码基因。其中，位于病毒表面的s蛋白在病毒入侵宿主细胞过程中发挥重要作用，已有研究表明s蛋白可与人血管紧张素转化酶2(ace2)蛋白产生相互作用，从而介导病毒对人呼吸道上皮细胞的入侵。

技术实现要素：

本发明的目的是提供以itgb1蛋白为靶标的抑制剂在制备sars-cov-2药物中的应用。

本发明保护用于抑制itgb1蛋白的物质在制备sars-cov-2药物中的应用。

具体的，用于抑制itgb1蛋白的物质为itgb1蛋白的抗体。

本发明还保护用于抑制itgb1蛋白的物质在制备抑制sars-cov-2感染细胞的产品中的应用。

具体的，所述细胞为哺乳动物细胞。

所述sars-cov-2感染细胞由ace2蛋白介导。

本发明还保护itgb1蛋白在制备产品中的应用；所述产品的功能为结合sars-cov-2的s蛋白。

本发明还保护itgb1蛋白在制备产品中的应用；所述产品的功能为检测sars-cov-2的s蛋白。

本发明还保护itgb1蛋白在制备产品中的应用；所述产品的功能为结合ace2蛋白。

本发明还保护itgb1蛋白在制备产品中的应用；所述产品的功能为检测ace2蛋白。

本发明还保护以itgb1蛋白为靶标的抑制剂在制备sars-cov-2药物中的应用。

itgb1蛋白全称为整合素β1。

所述itgb1蛋白为哺乳动物的itgb1蛋白。

itgb1蛋白具体可为序列表的序列7所示的蛋白质。

ace2蛋白具体可为序列表的序列8所示的蛋白质。

sars-cov-2的s蛋白具体可为序列表的序列9所示的蛋白质。

itgb1蛋白的抗体具体可为itgb1蛋白的特异性抗体。

itgb1蛋白的抗体具体可为santacruzbiotechnology的itgb1抗体。

itgb1蛋白的抗体具体可为santacruzbiotechnology的货号为sc-374429的itgb1抗体。

所述哺乳动物具体可为人。

本发明的发明人通过蛋白质相互作用筛选研究发现s蛋白的与宿主细胞的itgb1蛋白存在相互作用，而且itgb1蛋白能够促进sars-cov-2假病毒对细胞的感染，同时，itgb1蛋白的封闭抗体可以抑制sars-cov-2假病毒对宿主细胞的感染。结果表明，itgb1蛋白在sars-cov-2感染过程中具有重要功能，可以作为药物靶标。itgb1蛋白抑制剂可用于制备抑制sars-cov-2感染细胞的产品，从而发挥sars-cov-2疫苗和/或sars-cov-2药物的作用。

附图说明

图1为实施例1的结果。

图2为实施例2的结果。

图3为实施例3的结果。

图4为实施例4的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

质粒pcdna6b-s-turbo-myc如序列表的序列1所示。质粒pcdna6b-s-turbo-myc表达具有turbo-myc标签的sars-cov-2的s蛋白，简称s-turbo-myc蛋白。序列1中，第988-5871位核苷酸编码s-turbo-myc蛋白。序列1中，第988-4833位核苷酸编码sars-cov-2的s蛋白。

与质粒pcdna6b-s-turbo-myc相比，质粒pcdna6b-turbo-myc的差异仅在于缺少了序列1中第988-4833位核苷酸所示的dna区段。

质粒pflag-cmv2-itgb1是将itgb1蛋白编码基因插入到pflag-cmv2载体的noti和sali酶切位点之间得到的重组质粒。质粒pflag-cmv2-itgb1中，插入外源dna分子后形成序列表的序列2所示的融合基因，表达具有flag标签的itgb1蛋白，简称flag-itgb1蛋白。序列2中，第40-2433位核苷酸编码itgb1蛋白。pflag-cmv2载体为市售载体。

质粒pcmv-myc-ace2是将ace2蛋白编码基因插入到pcmv-myc载体的sali和noti酶切位点之间得到的重组质粒。质粒pcmv-myc-ace2中，插入外源dna分子后形成序列表的序列3所示的融合基因，表达具有myc标签的ace2蛋白，简称myc-ace2蛋白。序列3中，第73-2487位核苷酸编码ace2蛋白。pcmv-myc载体为市售载体。

myc抗体：mbllifescience，m047-3。hrp-conjugatedmyc抗体：santacruzbiotechnology，sc-40hrp。flag抗体：mbllifescience，m185-3l。hrp-conjugatedflag抗体：sigma-aldrich，a8592。

实施例1、

1、分组处理

myc-s组：将质粒pcdna6b-s-turbo-myc和质粒pflag-cmv2-itgb1共转染hek293t细胞，然后培养24小时；转染借助转染试剂pei，每5×10⁶个hek293t细胞转染3μg质粒pcdna6b-s-turbo-myc和3μg质粒pflag-cmv2-itgb1，采用含10％fbs的dmem培养基进行培养。

vector组：用质粒pcdna6b-turbo-myc代替质粒pcdna6b-s-turbo-myc，其它同myc-s组。

2、完成步骤1后，收集细胞，裂解细胞，取样部分裂解液(用lysate表示)，剩余裂解液加入偶联myc抗体的磁珠(argarosebeads)进行捕获，然后收集磁珠(用ip表示)。

3、分别将lysate和ip进行westernblot分析(采用的一抗为hrp-conjugatedflag抗体或hrp-conjugatedmyc抗体)。

结果见图1。sars-cov-2的s蛋白与itgb1蛋白之间存在相互作用。

实施例2、

1、分组处理

flag-itgb1组：将质粒pflag-cmv2-itgb1和质粒pcmv-myc-ace2共转染hek293t细胞，然后培养24小时；转染借助转染试剂pei，每5×10⁶个hek293t细胞转染3μg质粒pflag-cmv2-itgb1和3μg质粒质粒pcmv-myc-ace2，采用含10％fbs的dmem培养基进行培养。

vector组：用质粒pflag-cmv2代替质粒pflag-cmv2-itgb1，其它同flag-itgb1组。

2、完成步骤1后，收集细胞，裂解细胞，取样部分裂解液(用lysate表示)，剩余裂解液加入偶联flag抗体的磁珠(argarosebeads)进行捕获，然后收集磁珠(用ip表示)。

3、分别将lysate和ip进行westernblot分析(采用的一抗为hrp-conjugatedflag抗体或hrp-conjugatedmyc抗体)。

结果见图2。itgb1蛋白与ace2蛋白之间具有相互作用。ace2蛋白是sars-cov-2进入细胞的辅助受体。进一步说明了itgb1蛋白在sars-cov-2感染细胞的过程中可能发挥着重要作用。

实施例3、

一、假病毒的制备

1、转染

(1)将hek293t细胞接种至细胞培养皿中(每个培养皿约2×10⁷个细胞)，培养至细胞密度达到80-90％(18-24小时)。

(2)取1ml无血清dmem培养基，加入45μl转染试剂pei，轻柔吹打混匀，室温静置5min，然后加入质粒混合物，轻柔吹打均匀，室温静置15min。此为一个培养皿的量。

质粒混合物的组成：质粒pcdh-cmv-luciferse-ef1α-copgfp6.25μg、质粒plp1

1.83μg、质粒plp22.62μg和质粒pcag-sars-cov2-sδc19-flag4.30μg，共计15μg。质粒pcdh-cmv-luciferse-ef1α-copgfp是将序列表的序列4所示的luciferse蛋白编码基因插入pcdh-cmv-mcs-ef1α-copgfp载体的ecori和bamhi酶切位点之间得到的重组质粒。pcdh-cmv-mcs-ef1α-copgfp载体为市售载体。质粒pcag-sars-cov2-sδc19-flag如序列表的序列5所示。质粒plp1、质粒plp2：thermofishervirapower^tmlentiviralpackagingmix，catalognumber：k4975-00。

(3)将步骤(2)得到的混合物加入完成步骤(1)的培养皿中，培养6小时。

(4)完成步骤(3)后，更换为新鲜的含10％fbs的dmem培养基，培养24-36小时。

(5)完成步骤(4)后，在荧光显微镜下观察转染效率，然后4℃、3500g离心15min，收集上清液(其中含有假病毒)。

2、病毒浓缩(peg8000浓缩法)

5×peg8000溶液：50gpeg8000和8.733gnacl溶于200ml超纯水中，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。

(1)取步骤1得到的上清液，加入5×peg8000溶液(每8ml上清液配比2ml5×peg8000溶液)，充分混匀，然后4℃静置过夜(中间混匀两次)。

(2)完成步骤(1)后，4℃、3000g离心2小时，弃除上清，沉淀用pbs缓冲液清洗2次，然后用含2％fbs的dmem培养基将沉淀重悬，即为sars-cov-2假病毒病毒液，简称sars-cov-2病毒液。

二、试验一

质粒pcdna6b-ace2-flag如序列表的序列6所示。序列6中，第979-3393位核苷酸编码ace2蛋白。与质粒pcdna6b-ace2-flag相比，质粒pcdna6b-flag的差异仅在于缺少了编码ace2蛋白的dna区段。

1、分组转染(转染借助转染试剂pei)

第一组(ev组)：将质粒pcdna6b-flag转染hek293t细胞；约0.3×10⁵个细胞配比100ng质粒。

第二组(itgb1组)：将质粒pflag-cmv2-itgb1转染hek293t细胞；约0.3×10⁵个细胞配比50ng质粒。

第三组(ace2组)：将质粒pcdna6b-ace2-flag转染hek293t细胞；约0.3×10⁵个细胞配比50ng质粒。

第四组(ace2 itgb1组)：将质粒pcdna6b-ace2-flag和质粒pflag-cmv2-itgb1共转染hek293t细胞；约0.3×10⁵个细胞配比50ng质粒pcdna6b-ace2-flag和50ng质粒pflag-cmv2-itgb1。

2、完成步骤1后，采用含10％fbs的dmem培养基培养48小时。

3、完成步骤2后，弃上清，接种sars-cov-2病毒液(moi＝10⁶)，采用含2％fbs和10μg/mlpolybrene的dmem培养基培养12小时。

4、完成步骤3后，弃上清，采用含4％fbs的dmem培养基，培养24-36小时。

5、完成步骤4后，收集细胞，裂解细胞，检测luciferse活性。

结果见图3的a。ace2蛋白为sars-cov-2感染细胞的受体。itgb1蛋白对于sars-cov-2假病毒感染hek293t细胞没有作用，但是可以促进由ace2蛋白介导的sars-cov-2假病毒对hek293t细胞的感染。

三、制备hek293t-ace2细胞

1、取24孔板，接种hek293t细胞(约1×10⁵个细胞/孔)，采用含10％fbs的dmem培养基培养12小时，然后转染质粒pcdna6b-ace2-flag(400ng质粒/孔)，然后培养48小时。

2、完成步骤1后，弃除上清，采用含20μg/mlbsd(blasticidin)和10％fbs的dmem培养基培养(每2-3天更换新制备的培养基)，直至无明显细胞死亡。

3、完成步骤2后，取细胞，接种至直径为10cm的细胞培养皿，采用含20μg/mlbsd和10％fbs的dmem培养基培养，至细胞长出单克隆。

4、取步骤3得到的单克隆，胰酶消化，然后转移至24孔板中，采用含20μg/mlbsd和10％fbs的dmem培养基培养至80％汇合度。

5、完成步骤4后，收集细胞，胰酶消化，取样部分进行检测，剩余部分继续传代。

检测方法：取细胞，进行裂解，然后进行westernblot检测(采用的一抗为hrp-conjugatedflag抗体)，如果显示与ace2蛋白大小相应的阳性信号，该细胞为hek293t-ace2细胞。

四、试验二

1、分组转染(转染借助转染试剂pei)

第一组：将质粒pflag-cmv2转染hek293t-ace2细胞；约0.3×10⁵个细胞配比100ng质粒。

第二组：将质粒pflag-cmv2和质粒pflag-cmv2-itgb1共转染hek293t-ace2细胞；约0.3×10⁵个细胞配比80ng质粒pflag-cmv2和20ng质粒pflag-cmv2-itgb1。

第三组：将质粒pflag-cmv2和质粒pflag-cmv2-itgb1共转染hek293t-ace2细胞；约0.3×10⁵个细胞配比60n质粒pflag-cmv2和40ng质粒pflag-cmv2-itgb1。

第四组：将质粒pflag-cmv2和质粒pflag-cmv2-itgb1共转染hek293t-ace2细胞；约0.3×10⁵个细胞配比20ng质粒pflag-cmv2和80ng质粒pflag-cmv2-itgb1。

第五组：将质粒pflag-cmv2-itgb1转染hek293t-ace2细胞；约0.3×10⁵个细胞配比100ng质粒。

2、完成步骤1后，采用含10％fbs的dmem培养基培养48小时。

3、完成步骤2后，弃上清，接种sars-cov-2病毒液(moi＝10⁶)，采用含2％fbs和10μg/mlpolybrene的dmem培养基培养12小时。

4、完成步骤3后，弃上清，采用含4％fbs的dmem培养基培养24-36小时。

5、完成步骤4后，收集细胞，裂解细胞，检测luciferse活性。

结果见图3的b。ev代表质粒pflag-cmv2，itgb1代表质粒pflag-cmv2-itgb1，自左至右的五个柱形依次对应第一组至第五组。

实施例4、

1、取96孔板，接种实施例3获得的hek293t-ace2细胞(0.2×10⁵个细胞-0.3×10⁵个细胞/孔)，采用含10％fbs的dmem培养基，培养至密度达到约60-70％。

2、取供试抗体，采用pbs缓冲液进行梯度稀释，得到抗体稀释液。取实施例3制备的sars-cov-2病毒液，用含2％fbs的dmem培养基调整病毒浓度。将病毒液和抗体稀释液混合(混合体系中，抗体工作浓度分别为2μg/ml、10μg/ml或50μg/ml，设置用等体积pbs代替抗体稀释液的对照，作为0μg/ml抗体工作浓度)，然后4℃孵育1h，然后加入polybrene并使其浓度为10μg/ml。

供试抗体为itgb1抗体(sc-374429)或igg抗体(sc-69786)，均购自santacruzbiotechnology。

3、完成步骤1后，弃上清，每孔加入150μl步骤2得到的混合物(moi＝10⁶)，培养24-36小时。

4、完成步骤3后，收集细胞，裂解细胞，检测luciferse活性。

结果见图4。图4中，自左至右，第一个柱形对应0浓度的抗体稀释液，第二至四个柱形对应itgb1抗体的抗体稀释液，第五至七个柱形对应igg抗体的抗体稀释液。itgb1的封闭抗体可以抑制sars-cov-2假病毒对hek293t细胞的感染。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

山东大学

<120>以itgb1蛋白为靶标的抑制剂在制备抗sars-cov-2药物中的应用

<130>gncyx210612

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>9935

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatg60

ccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcg120

cgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgc180

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