本发明属肿瘤治疗领域，涉及用于肿瘤靶向治疗的脂质体纳米药物，具体涉及一种负载多柔比星的蛋黄脂质纳米药物eylns-dox及其制备方法和应用。
背景技术：
肿瘤仍是威胁人类健康的头号杀手，其中化疗药物的应用在晚期肿瘤治疗中仍是最为重要的手段之一，但化疗药物靶向性的缺乏及其严重毒副反应极大地限制了其治疗效果。寻求新的靶向治疗策略以提升疗效是当前肿瘤研究的重点和难点。而随着纳米科技的发展，纳米药物的开发成为肿瘤靶向治疗研究的热点和新兴领域。纳米药物不仅可增加药物的溶解性，降低药物的清除率，最重要的是实体瘤的高通透性和滞留效应(epr效应)介导的肿瘤靶向效应可有效提升药物的肿瘤靶向分布，减少化疗药物对正常组织器官的毒副作用。
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于提供一种负载多柔比星的纳米药物eylns-dox；本发明的第二个目的在于提供制备eylns-dox的制备方法；本发明的第三个目的在于提供纳米药物eylns-dox在肿瘤治疗方面的应用。
本发明的技术解决方案是：一种负载多柔比星的蛋黄脂质纳米药物eylns-dox，该纳米药物以蛋黄脂质为基础，以多柔比星为负载药物。
其中，该蛋黄脂质纳米药物eylns-dox的制备方法包括以下步骤：
(1)蛋黄脂质提取：采用脂质提取试剂盒(lipidextractionandpolar/neutrallipidseparationcombokit,cellbiolabs,inc.lot:12520164)提取蛋黄脂质，提取具体方法依据试剂盒提供步骤进行，脂质置于玻璃安剖瓶中经氮气吹干备用；
(2)纳米药物eylns-dox的制备：取400μl双蒸水与干燥蛋黄脂质3mg混合，水浴超声5-10分钟直至溶液清亮；然后加入终浓度为1mg/ml的多柔比星400μg，水浴超声5分钟后孵育30分钟；100,000×g离心1小时后弃上清，pbs重悬收集eylns-dox后4℃保存。
更进一步是，所述纳米药物在肿瘤治疗中的应用。
更进一步是，以该纳米药物为核心，制备同时负载其它治疗性制剂的纳米药物体系。
本发明的优点是：以蛋黄脂质为核心，制备获得了一种负载多柔比星的纳米药物eylns-dox，前期数据证实该纳米药物机体毒性小，肿瘤靶向性好，肿瘤抑制效率高，是一种具有极大临床转化应用价值的新型纳米药物。
附图说明
图1为纳米药物eylns-dox形态、粒径及表面zeta电位鉴定；其中：a，透射电子显微镜观察纳米药物的形态；b，粒度仪检测其粒径分布约80nm；c，表面电势约-36mv。
图2为纳米药物eylns-dox肿瘤靶向性分析；其中，a，活体成像观察纳米药物在肿瘤部位的分布情况，发现随着时间的延长，肿瘤部位的药物蓄积量逐渐增加；b，72小时后取小鼠的脏器和肿瘤组织，扫描发现纳米药物在肿瘤组织中分布约占6％。
图3为纳米药物eylns-dox体内抗肿瘤活性分析；其中：a，活体成像比较纳米药物eylns-dox与dox的体内抗小鼠乳腺癌活性；b，小鼠乳腺癌生长情况；c，各组小鼠乳腺癌瘤体影像；d，活体成像比较纳米药物eylns-dox与dox的体内抗小鼠肝癌活性；e，小鼠肝癌生长情况；f，各组小鼠肝癌瘤体影像。
图4为纳米药物eylns-dox体内毒性分析；其中：a，反应肝脏毒性指标alt，ast，alp的检测；b，反应心脏毒性指标心肌肌钙蛋白、肌酸激酶的检测；c，反应肾脏毒性指标urea、crea的检测；结果显示eylns-dox具有较dox更低的机体毒性。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的技术解决方案，但不能理解为是对技术方案的限制，在此基础上的适应性改进皆属于本发明的保护范围。
1、一种负载多柔比星的蛋黄脂质纳米药物eylns-dox的制备方法
(1)蛋黄脂质提取：采用脂质提取试剂盒(lipidextractionandpolar/neutrallipidseparationcombokit,cellbiolabs,inc.lot:12520164)提取蛋黄脂质，提取具体方法依据试剂盒提供步骤进行，脂质置于玻璃安剖瓶中经氮气吹干备用；
(2)纳米药物eylns-dox的制备：取400μl双蒸水与干燥蛋黄脂质(3mg)混合，水浴超声5-10分钟直至溶液清亮；然后加入终浓度为1mg/ml的多柔比星(400μg)，水浴超声5分钟后孵育30分钟；100,000×g离心1小时后弃上清，pbs重悬收集eylns-dox后4℃保存。
2、纳米药物eylns-dox形态、粒径、表面zeta电位表征：取10μl制备好的eylns-dox滴于碳包覆的铜网上，质量浓度1％的醋酸铀酰负性染色后通过透射电镜观察其形态；取20μl纳米药物eylns-dox溶于400μl双蒸水，移至样品管后通过粒度仪分析纳米药物粒径大小；溶于2ml双蒸水后粒度仪分析表面zeta电位。
如图1所示，纳米药物eylns-dox形态、粒径及表面zeta电位鉴定；其中：a，透射电子显微镜观察纳米药物的形态；b，粒度仪检测其粒径分布约80nm；c，表面电势约-36mv。
3、纳米药物eylns-dox肿瘤靶向性分析：将dir荧光标记的eylns-dox尾静脉注射4t1细胞荷瘤小鼠乳腺癌模型，分别于注射后12、24、48、72小时通过小动物活体成像仪扫描小鼠体内dir信号，分析纳米药物的组织、肿瘤分布。
如图2所示，纳米药物eylns-dox肿瘤靶向性分析；其中，a，活体成像观察纳米药物在肿瘤部位的分布情况，发现随着时间的延长，肿瘤部位的药物蓄积量逐渐增加；b，72小时后取小鼠的脏器和肿瘤组织，扫描发现纳米药物在肿瘤组织中分布约占6％。
4、纳米药物eylns-dox肿瘤抑制效果：分别以表达luciferase报告基因的小鼠乳腺癌细胞4t1及肝癌细胞h22建立小鼠乳腺癌和肝癌模型，瘤体长至约100mm3时将小鼠随机分为3组，分别给予pbs、dox、eylns-dox处理(dox剂量按5mg/kg小鼠体重给药)，每6天处理一次，共处理5次，每6天对小鼠进行一次活体成像，每3天测量一次小鼠肿瘤大小及小鼠体重。
如图3所示，纳米药物eylns-dox体内抗肿瘤活性分析；其中：a，活体成像比较纳米药物eylns-dox与dox的体内抗小鼠乳腺癌活性；b，小鼠乳腺癌生长情况；c，各组小鼠乳腺癌瘤体影像；d，活体成像比较纳米药物eylns-dox与dox的体内抗小鼠肝癌活性；e，小鼠肝癌生长情况；f，各组小鼠肝癌瘤体影像。
5、纳米药物eylns-dox体内毒性分析：分别取pbs、dox、eylns-dox处理后小鼠的外周血，通过小动物生化分析小鼠肝、肾、心脏功能指标变化情况。
如图4所示，纳米药物eylns-dox体内毒性分析；其中：a，反应肝脏毒性指标alt，ast，alp的检测；b，反应心脏毒性指标心肌肌钙蛋白、肌酸激酶的检测；c，反应肾脏毒性指标urea、crea的检测；结果显示eylns-dox具有较dox更低的机体毒性。
结果显示：我们制备获得了粒径约80nm、表面zeta电位约-36mv的纳米药物eylns-dox；纳米药物有效增强药物在肿瘤部位的分布；同时，相对于多柔比星，eylns-dox具有更为有效的小鼠乳腺癌及肝癌抑制效果，是一种具有较大临床转化应用前景的纳米药物。
1.一种负载多柔比星的蛋黄脂质纳米药物eylns-dox，其特征是：该纳米药物以蛋黄脂质为基础，以多柔比星为负载药物。
2.一种负载多柔比星的蛋黄脂质纳米药物eylns-dox的制备方法，其特征是该制备方法包括以下步骤：
(1)蛋黄脂质提取：采用脂质提取试剂盒(lipidextractionandpolar/neutrallipidseparationcombokit,cellbiolabs,inc.lot:12520164)提取蛋黄脂质，提取具体方法依据试剂盒提供步骤进行，脂质置于玻璃安剖瓶中经氮气吹干备用；
(2)纳米药物eylns-dox的制备：取400μl双蒸水与干燥蛋黄脂质3mg混合，水浴超声5-10分钟直至溶液清亮；然后加入终浓度为1mg/ml的多柔比星400μg，水浴超声5分钟后孵育30分钟；100,000×g离心1小时后弃上清，pbs重悬收集eylns-dox后4℃保存。
3.一种负载多柔比星的蛋黄脂质纳米药物eylns-dox的应用，其特征是：所述纳米药物在肿瘤治疗中的应用。
4.一种负载多柔比星的蛋黄脂质纳米药物eylns-dox的应用，其特征是：以该纳米药物为核心，制备同时负载其它治疗性制剂的纳米药物体系。
技术总结