技术领域：
本发明属于益生菌生物制剂技术领域，涉及一种治疗各类肠粘膜损伤、尤其是炎症性肠病的益生菌和多肽复合制剂。
背景技术：
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肠粘膜指的是肠道的管壁有环形的皱襞，粘膜上面有许多的绒毛，绒毛根部的上皮下陷至固有层，形成管状的肠腺，其开口位于绒毛根部之间，绒毛和肠腺与小肠的消化功能以及吸收功能关系密切，肠消化管内含有弥散的淋巴组织、孤立淋巴小结、集合淋巴小结以及淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞等，它们参与构成了机体免疫防御的第一道防线。肠粘膜对于维持上皮细胞通透性、机体内环境的稳态有重要作用，可维持肠道正常功能，保证机体健康。肠粘膜屏障功能一旦受损，肠道通透性升高，肠腔内的内毒素突破肠道屏障进入机体循环，促使大量炎性细胞因子释放，引起机体炎症，进而诱发异常的粘膜免疫反应。
然而多种因素，包括病原微生物因素、物理因素、化学因素、机械性因素等多种因素，均易引起肠道粘膜损伤。如严重创伤、严重感染、烧伤、休克、急性胰腺炎和其它危重病人均可出现肠粘膜屏障的损伤。
目前，用于肠粘膜损伤的治疗药物主要为抗生素、微生态制剂、肠外营养、中药，虽然以上各种治疗方法具有一定的治疗效果，且由于肠粘膜屏障的损伤，吸收功能会大大降低，有效的药效浓度很难控制和维持；使胃肠粘膜损伤的修复不尽如意，且上述药物大多具备一定的毒副作用，会增加人体肝脏负担。
事实上，当前人们已经开展了大量研究，并发现益生菌可以改变肠道健康，并对其原理做了一定研究，如了解了具体包括改善肠道中菌群比例并转化某些肠内物质、拮抗结合位点从而阻止致病菌定植、调节抗炎与生炎因子之间的平衡进而促进肠道损伤上皮的修复以及增强上皮紧密连接、加强肠道粘膜屏障保护作用从而阻止细菌移位等。但使用益生菌直接治疗肠粘膜损伤的缺陷时，其往往需要较长时间的调理，难以快速起效。
鉴于此，本发明提供一种益生菌生物制剂，其包含凝结芽孢杆菌和一种治疗多肽，能改善肠道环境，并快速修复损伤肠道粘膜，且无毒副作用，具备良好的临床应用价值。
技术实现要素：
本发明人经过研究发现一种短肽，所述短肽与凝结芽孢杆菌联合使用能够有效改善肠道环境，治疗修饰肠道粘膜损伤。最主要的是，本发明的凝结芽孢杆菌制剂安全且无毒副作用，临床应用潜力巨大。
本发明的多肽序列如seqidno：1所示，是本申请发明人研究获得的一种源自胸腺素β16的修饰的截短多肽，其与凝结芽孢杆菌联合使用，能快速改善肠道环境，治疗修复肠道粘膜损伤。
因此，本发明提供一种用于治疗肠道粘膜损伤的凝结芽孢杆菌制剂，所述制剂包含凝结芽孢杆菌和seqidno：1所示多肽。所述多肽可以通过固相合成法化学合成，也可以通过构建重组细胞工程菌表达发酵制备。
优选地，本发明的凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌bc30。
进一步地，本发明制剂中，凝结芽孢杆菌与seqidno：1所示多肽的用量比为1×109-1×1010cfu：10-50mg；优选为1010cfu/20mg，或1010cfu/40mg。
本发明多肽是一种源自胸腺素β16的修饰的多肽。胸腺素β16由45个氨基酸组成，分子量为5kda，存在于人的正常神经组织、腮腺组织、睾丸组织及角化上皮细胞内。胸腺素β16能结合到肌动蛋白单体上，从而抑制肌动蛋白的聚合。动物实验研究显示这些多肽小分子能使皮肤上皮细胞迁移到伤口，刺激伤口形成新生的毛细血管，刺激成纤维细胞及真皮细胞在伤口愈合过程中产生结构蛋白及其它连接组织成分，增强肉芽组织的形成，促进组织再生，进而促进伤口愈合。本申请发明人在研究胸腺素β16过程中，获得一种截短的修饰多肽，其序列如seqidno：1所示，其由26个氨基酸组成。发明人发现该多肽同样能有效修复肠道粘膜损伤，且与益生菌的组合，效果更为明显。
具体实施方式
以下实施方式进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明的方法、步骤和条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1：多肽制备
(1)原核表达载体的构建：根据seqidno.1所示氨基酸序列，设计其并合成其编码序列，将其克隆到原核表达载体pet28a上得到原核表达载体，构建的原核表达载体然后转化大肠杆菌bl21，筛选阳性克隆并测序，证实构建的重组大肠杆菌bl21表达的即为seqidno.1所示多肽。
(2)多肽的制备和纯化：将上述构建的重组菌株接种于浓度为50μg/ml的氨苄抗菌素的液体培养基中，37℃振荡培养至600nm吸光度值为2，iptg诱导表达，37℃振荡培养6小时，8000转/分钟离心12分钟收集菌体，超声破碎3分钟，12000转/分钟离心5分钟，弃上清，沉淀用磷酸盐缓冲液(ph7.0)重悬，再12000转/分钟离心5分钟，弃上清取沉淀，洗涤，即得到纯化多肽。
实施例2：葡聚糖硫酸钠致小鼠溃疡性结肠炎模型实验方案
参考现有文献和专利，以葡聚糖硫酸钠法制备小鼠疡性结肠炎模型，具体方法如下：
成年雌性balb/c小鼠，体重为22～25g，每组8只，让其自由饮用5％葡聚糖硫酸钠(dss)蒸馏水溶液，连续7d，然后饮用正常蒸馏水7d。
设空白组，模型组和实验组，共7组，每组小鼠8只，各给药组从模型试验第二天开始给药1ml，凝结芽孢杆菌bc30、多肽均使用0.9％生理盐水配置成溶液，至模型试验结束。每日观察动物的活动状态、大便性状和隐血情况。14天结束后眼眶取血，取血后处死小鼠，取肛门往上0.5cm处至回盲肠的整段结肠，在解剖镜下观察结肠大体形态。
实验结果显示，各治疗组小鼠结肠粘膜修复程度比模型组有明显改善。益生菌组作用有效，本发明多肽能有效降低导致的mpo、mda等过氧化物酶体的升高，降低il-1β等炎症因子，并且下调nf-κb的表达；而且通过谷丙转氨酶alt、天冬门氨酸酶ast数据可知，其基本无毒副作用。而益生菌与多肽的组合显然起到了协同增强的效果，进一步增强多肽作用。有理由相信，在凝结研报杆菌提供的肠道环境改善下，本发明多肽进一步起到了修饰肠道损伤作用。
序列表
<110>天津市宝恒生物科技有限公司
<120>一种修复肠粘膜的凝结芽孢杆菌制剂
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>26
<212>prt
<213>syntheticsequences
<400>1
lysgluaspargserlysilelyslystrpasnthrgluglulysasn
151015
thrleuproglylysgluthrileglngln
2025
1.一种用于修复肠道粘膜损伤的凝结芽孢杆菌药物组合物，其特征在于，所述组合物包含凝结芽孢杆菌和seqidno：1所示多肽。
2.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌bc30。
3.权利要求1-2任意一项所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物中凝结芽孢杆菌和多肽的含量比为：1×109-1×1010cfu:10-50mg。
4.权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物中凝结芽孢杆菌和多肽的含量比为：1010cfu/20mg，或1010cfu/40mg。
5.权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物剂型选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂、粉剂。
技术总结