本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物及其应用和免疫药物。
背景技术：
细菌脂多糖(lps)又名内毒素，是一种位于革兰氏阴性杆菌外表面的双嗜性分子。细菌脂多糖能和免疫系统相互作用，导致大量的抗炎症因子生成并释放，对机体免疫有重要影响，近年来，随着分子生物学研究的不断深入，国内外对人体和其他哺乳动物的大量研究中都发现no(一氧化氮)在细菌脂多糖引起的休克时含量增高，对内毒素性组织损伤起重要作用。
众所周知，no是一种内皮衍生的血管舒张因子，它参与细胞内信号传导，具有舒张动脉和抗炎等作用，但过量no及其代谢产物则可使机体损伤，引起一系列疾病，如血管性休克、神经退行性疾病、关节炎及慢性炎症等。因此，降低或抑制因lps诱导而导致细胞产生过量的no有助于降低对机体的损伤和疾病的治疗。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物，该组成物能够抑制lps诱导巨噬细胞分泌no，以解决上述问题中的至少一种；
提供一种具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物在制备免疫药物中的应用；
提供一种免疫药物，包括具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物。
第一方面，本发明提供了一种具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物，所述组成物包括：(a)藻蓝蛋白、(b)接骨木果和任选的(c)松花粉提取物。
进一步地，所述(a)藻蓝蛋白和所述(b)接骨木果的重量配比为1:(1～2)。
进一步地，所述(a)藻蓝蛋白和所述(b)接骨木果的重量配比为1:1。
进一步地，所述(a)藻蓝蛋白、所述(b)接骨木果和所述(c)松花粉提取物的重量配比为2:(2～4):(1～4)。
进一步地，所述(a)藻蓝蛋白、所述(b)接骨木果和所述(c)松花粉提取物的重量配比为2:2:(1～4)。
进一步地，(c)松花粉提取物为松花粉水提物，所述(a)藻蓝蛋白、所述(b)接骨木果和所述(c)松花粉提取物的重量配比为2:2:1。
进一步地，松花粉水提物通过以下方法制备得到：
松花粉经水提取，得到松花粉水提物；
优选地，提取的固液质量配比为0.08～0.12，优选为0.1；
优选地，提取为超声提取；
优选地，超声提取的温度为25～45℃，时间为10～30min。
进一步地，(c)松花粉提取物为松花粉多糖，所述(a)藻蓝蛋白、所述(b)接骨木果和所述(c)松花粉提取物的重量配比为1:1:1。
第二方面，本发明提供了一种具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物组在制备免疫药物中的应用。
第三方面，本发明提供了一种免疫药物，包括具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物组以及辅料。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物主要由藻蓝蛋白、接骨木果和任选的松花粉提取物组成，经发明人研究发现，藻蓝蛋白和接骨木果具有免疫活性，且安全可靠，具有降低lps诱导巨噬细胞分泌no水平和提高巨噬细胞的吞噬活性的功能，将藻蓝蛋白和接骨木果一起使用能够明显降低lps诱导巨噬细胞分泌的no水平，远优于藻蓝蛋白和接骨木果单独使用，说明藻蓝蛋白和接骨木果具有复配增效的作用；将藻蓝蛋白接骨木果和松花粉提取物一起使用能够进一步降低lps诱导巨噬细胞分泌的no水平，说明藻蓝蛋白、接骨木果和松花粉提取物同样具有复配增效的作用，能够用于制备免疫药物。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的研究思路图；
图2为本发明实施例1提供的单一样品对巨噬细胞增殖活性的影响；
图3为本发明实施例1提供的单一样品对巨噬细胞吞噬活性的影响；
图4为本发明实施例1提供的单一样品对lps诱导巨噬细胞no生成量的影响；
图5为本发明实施例1提供的双组分样品对lps诱导巨噬细胞no生成量的影响；
图6为本发明实施例1提供的多组分样品对lps诱导巨噬细胞no生成量的影响；
图7为本发明实施例1提供的单一样品对nk92细胞自然杀伤活性的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
第一方面，本发明提供了一种具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物，所述组成物包括：(a)藻蓝蛋白、(b)接骨木果和任选的(c)松花粉提取物。
藻蓝蛋白是一类普遍存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素，是一种特殊的色素蛋白，由开链的四吡咯化合物-藻胆素和脱辅基蛋白通过硫醚键共价交联而成。藻蓝蛋白主要存在于螺旋藻中，在螺旋藻中的含量高达10-20％。藻蓝蛋白既可以作为天然色素被广泛用作食品和化妆品的着色剂，同时藻蓝蛋白还是存在于自然界的一种罕有的天然荧光色素蛋白质，可制成荧光试剂、荧光探针、荧光示踪标记物，用于临床医学诊断、免疫化学及生物工程等领域。另有研究表明藻蓝蛋白具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗辐射、保肝和降血脂等生理功能。本发明研究发现，藻蓝蛋白具有免疫活性，能够增强巨噬细胞的吞噬活性、降低lps诱导细胞分泌no。
接骨木指忍冬科接骨木属植物，主要包括中国接骨木、金叶接骨木、淡黑接骨木、西洋接骨木、加拿大接骨木，其果实即为接骨木，一般呈红色，极少呈蓝紫黑色，接骨木广泛种植于欧洲、北非、中西亚，它的药用部位有叶、果、花，生于海拔540-1600米的山坡、灌丛、沟边、路旁、宅边等地，接骨木果的多酚类化合物包括花青素类和黄酮类，以及其他高抗氧化物质，花青素是接骨木果及其他一些水果蔬菜红色、紫色和紫罗兰色的主要原因，也是自然界中广泛存在的一种天然色素，黄酮类化合物，是一种很好的抗氧化剂，能够清除自由基。
接骨木果(elderberry)，又名接骨木莓，含有丰富的生物活性成分和营养成分，其中，最主要的生物活性成分是多酚类化合物和氰苷，接骨木果具有“天然医药箱”之称，在欧洲被作为草药和保健食材已有悠久的历史，具有消炎、抗病毒的作用，能抑制流感病毒及舒缓感冒症状，可以用于治疗流感及其引发的咽喉肿痛，咳嗽等上呼吸道感染症状，以及伤风感冒，对心血管保健及增进运动表现也具有相当的潜力，接骨木果萃取物能显着提升内皮细胞之no合成酶的活性，还可提升肌肤防御力和免疫力。本发明研究表明，接骨木果具备免疫调节能力，能够增强巨噬细胞的吞噬活性，降低lps诱导细胞分泌no。
松花粉是松科马尾松(pinusmassonianalamb.)、油松(pinustabulaeformiscarr.)或同属树种植物的干燥花粉，又名松黄，始载于《新修本草》，《神农本草经》记载了松花粉的功用：“松黄，气味甘平无毒，主治心腹寒热邪气，利小便，消瘀血，久服轻身益气力，延年。”现在松花粉已广泛应用于保健食品、普通食品、药品、化妆品等领域。科学研究证实松花粉富含人体所需的多种糖类、蛋白质、脂肪、维生素、微量元素和生物活性物质等，具有改善心血管系统，延缓衰老，抗辐射，抑瘤，保护消化系统等作用。
松花粉提取物为从松花粉中提取得到的物质，提取方法包括水提或者醇提，提取得到的物质例如可以为松花粉水提物(松花水提物)、松花粉多糖(松花多糖)等。
需要说明的，在本发明中，“任选的(c)松花粉提取物”的含义为该组成物中可以包含该松花粉提取物，也可以不包含松花粉提取物。
本发明提供的具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物主要由藻蓝蛋白、接骨木果和任选的松花粉提取物组成，经发明人研究发现，藻蓝蛋白和接骨木果具有免疫活性，且安全可靠，具有降低lps诱导巨噬细胞分泌no水平和提高巨噬细胞的吞噬活性的功能，将藻蓝蛋白和接骨木果一起使用能够明显降低lps诱导巨噬细胞分泌的no水平，远优于藻蓝蛋白和接骨木果单独使用，说明藻蓝蛋白和接骨木果具有复配增效的作用；将藻蓝蛋白接骨木果和松花粉提取物一起使用能够进一步降低lps诱导巨噬细胞分泌的no水平，说明藻蓝蛋白、接骨木果和松花粉提取物同样具有复配增效的作用，能够用于制备免疫药物。
进一步地，所述(a)藻蓝蛋白和所述(b)接骨木果的重量配比为1:(1～2)，例如可以为，但不限于1:2或1:1。
进一步地，所述(a)藻蓝蛋白和所述(b)接骨木果的重量配比为1:1。
在本发明中，通过对组成物中藻蓝蛋白和接骨木果重量配比的具体选择，更好地发挥藻蓝蛋白和接骨木果之间的复配增效作用，进一步降低lps诱导巨噬细胞分泌no的水平。并且，经过发明人进一步研究发现，当藻蓝蛋白和接骨木果以1:1配比组合时，降低lps诱导巨噬细胞分泌no的作用最强。
发明人根据藻蓝蛋白和接骨木果降低lps诱导巨噬细胞分泌no水平结果，将藻蓝蛋白和接骨木果与松花粉提取物进行组合，进一步研究了三组分对巨噬细胞raw264.7分泌no的影响。
进一步地，所述(a)藻蓝蛋白、所述(b)接骨木果和所述(c)松花粉提取物的重量配比典型但非限制性的为2:2:1、2:4:3、2:3:2或2:3:4。
进一步地，所述(a)藻蓝蛋白、所述(b)接骨木果和所述(c)松花粉提取物的重量配比典型但非限制性的为2:2:1、2:2:3、2:2:2或2:2:4。
进一步地，(c)松花粉提取物为松花粉水提物，所述(a)藻蓝蛋白、所述(b)接骨木果和所述(c)松花粉提取物的重量配比为2:2:1。
在本发明中，通过对组成物中藻蓝蛋白、接骨木果和松花粉水提物质量配比的具体的选择，更好地发挥藻蓝蛋白、接骨木果和松花粉水提物之间的复配增效作用，降低lps诱导巨噬细胞分泌no的水平。并且，当藻蓝蛋白、接骨木果和松花粉水提物以2:2:1的重量配比进行组合时，对降低lps诱导巨噬细胞大量分泌no水平的作用最强。
进一步地，松花粉水提物通过以下方法制备得到：
松花粉经水提取，得到松花粉水提物；
优选地，提取的固液质量配比典型但非限制性的为0.008、0.009、0.01、0.011或0.012，但不限于，优选为0.1；
优选地，提取为超声提取；
优选地，超声提取的温度典型但非限制性的为25℃、27℃、30℃、33℃、35℃、37℃、40℃、43℃或45℃，优选为37℃；
超声提取的时间典型但非限制性的为10min、13min、15min、17min、20min、23min、25min、27min或30min，优选为20min。
通过对松花粉水提物制备参数进行具体的选择，能够更好的实现对松花粉水提物的制备。
进一步地，(c)松花粉提取物为松花粉多糖，所述(a)藻蓝蛋白、所述(b)接骨木果和所述(c)松花粉提取物的重量配比为1:1:1。
在本发明中，通过对组成物中藻蓝蛋白、接骨木果和松花粉多糖质量配比的具体的选择，更好地发挥藻蓝蛋白、接骨木果和松花粉多糖之间的复配增效作用，降低lps诱导巨噬细胞分泌no的水平。并且，当藻蓝蛋白、接骨木果和松花粉多糖以1:1:1的重量配比进行组合时，对降低lps诱导巨噬细胞大量分泌no水平的作用最强。而且藻蓝蛋白、接骨木果和松花粉多糖以1:1:1的重量配比进行组合的组成物在降低lps诱导巨噬细胞分泌no的水平上要优于藻蓝蛋白、接骨木果和松花粉水提物以2:2:1的重量配比进行组合的组成物。
第二方面，本发明提供了一种组成物在制备免疫药物中的应用。
经发明人研究发现，藻蓝蛋白和接骨木果具有免疫活性，且安全可靠，具有降低lps诱导巨噬细胞分泌no水平和提高巨噬细胞的吞噬活性的功能，将藻蓝蛋白和接骨木果一起使用能够明显降低lps诱导巨噬细胞分泌的no水平，远优于二者单独使用，说明藻蓝蛋白和接骨木果具有复配增效的作用；将藻蓝蛋白接骨木果和松花粉提取物一起使用能够进一步降低lps诱导巨噬细胞分泌的no水平，说明藻蓝蛋白、接骨木果和松花粉提取物同样具有复配增效的作用，能够用于制备免疫药物。
第三方面，本发明提供了一种免疫药物，包括组成物以及辅料。
其中，辅料包括但不限于稀释剂、填充剂、赋形剂、粘合剂、湿润剂、崩释剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂和香味剂，或者本领域技术人员所熟知的其他药学上可接受的辅料。
由于本发明的免疫药物包括上述具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物，因此该免疫药物同样具有上述组成物的所用功能，具有免疫活性，具有增强机体免疫力的功效。
为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合具体的实施例详细介绍如下。
本研究主要思路从6种功能性原料中筛选出具有免疫调节作用的原料，被筛选出的2-3种原料以不同比例组合，通过研究结果，确定免疫组方各原料之间的最佳比例。
本发明具体的研究思路如图1所示。
实施例1
1、原料制备
(1)藻蓝蛋白：将500mg藻蓝蛋白置于5ml水中，超声10min，充分溶解后过0.22μm滤膜，制备得到100mg/ml藻蓝蛋白溶液，于5℃储存备用。
(2)接骨木果：崴达国际股份有限公司，含10％花青素，制备40mg/ml接骨木果储备，将1000mg提取物置于25ml水中，过0.22μm滤膜除菌，于-20℃冰箱储存备用。
(3)松花粉水提物：将200mg松花粉置于2ml水中，水浴37℃，超声20min，过0.22μm滤膜，制备得到100mg/ml松花粉水提物溶液，于5℃储存备用。
(4)松花粉多糖：将300mg自制松花粉多糖置于3ml热水中，充分溶解后10000r/min离心5min，取上清，过0.22μm滤膜，制备得到100mg/ml松花粉多糖溶液，于5℃储存备用。
2、细胞培养
2.1巨噬细胞raw264.7细胞
(1)细胞生长特性：半贴壁/贴壁，生长快；
(2)培养基：90％dmem(高糖，含双抗) 10～12％fbs；
(3)复苏：37℃水浴，含15％胎牛血清的培养基(配制方法：85％dmem(高糖，含双抗) 15％fbs)；
(4)换液：1天1次；
(5)传代：0.25％胰酶(含edta)，消化3～5分钟，传代比例1:4～6；
(6)冻存：50％完全培养基 40％血清 10％dmso或者90％血清 10％dmso。
2.2nk92细胞
(1)细胞生长特性：悬浮，生长极慢；
(2)培养基：90％1640培养基(含双抗) 10～12％fbs；
(3)复苏：37℃水浴，含15％培养基；
(4)换液：2天一次，取一半到新瓶，各补加一半培养基，或收集离心(1500r，5min)，再重悬；
(5)传代：同换液，传代比例1:2；
(6)冻存：90％血清 10％dmso；
(7)注意事项：全过程操作轻缓。
3、巨噬细胞增殖率测定
(1)复苏、培养巨噬细胞raw264.7。
(2)将细胞密度2.0～3.0×105/ml的细胞接种到96孔板中，培养24h。
(3)用培养基稀释各个原料，制备得到含不同浓度原料的样品溶液。
(4)培养结束后弃去细胞上清液，将不同浓度(0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml和1000μg/ml)的藻蓝蛋白、接骨木果、松花粉多糖和松花粉水提物样品溶液加入各个孔中，每孔100μl，每个浓度4个复孔，同时设置正常对照，同样设4个复孔，每孔加100μl培养基，培养24h。
(5)配制cck8孵育液，按照碧云天试剂盒说明书，1ml培养基加100μlcck8溶液，混匀，培养结束后弃去上清液，加pbs溶液清洗一遍，每孔加110μlcck8孵育液，孵育2h。
(6)孵育结束，测量od450，细胞增殖率的计算公式如下。
细胞增值率(％)＝[(样品孔od值－正常孔od值)/正常孔od值]×100％。
实验结果如图2所示。从图2中可以看出，样品在0-1mg/ml浓度范围内，接骨木果、松花粉多糖和松花粉水提物不影响巨噬细胞的增殖活性，藻蓝蛋白能够促进巨噬细胞的增殖。
4、中性红法检测巨噬细胞raw264.7吞噬活性
(1)复苏、培养raw264.7细胞。
(2)将细胞密度2.0～3.0×105/ml的细胞接种到96孔板中，贴壁培养2h。
(3)贴壁后弃去上清，分组，空白组(只含培养基)、正常对照组(细胞 培养基)、lps对照组(细胞 含1μg/mllps的培养基)、样品组(细胞 样品溶液)，各组设4个复孔，给药后，于培养箱培养24h。
(4)弃上清，各孔用pbs溶液洗一遍后，加入碧云天的中性红溶液50μl/孔，避光孵育10min后，弃中性红，用pbs溶液洗3遍，每次200μl/孔，加入细胞裂解液(醋酸：无水乙醇＝1:1)100μl/孔，继续避光孵育30min。
(5)孵育结束后，立即于570nm处测得od值，样品组吞噬活性计算公式如下：
相对吞噬活性(％)＝[(样品孔od值-空白孔od值)/(正常孔od值-空白孔od值)-1]×100％。
取不同浓度(0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml和1000μg/ml)的接骨木果、藻蓝蛋白、松花粉多糖和松花粉水提物作为样品组，研究以上各个样品对于巨噬细胞吞噬活性的影响，实验结果如图3所示。
从图3中可以看出，松花粉多糖、接骨木果和松花粉水提物能够提高巨噬细胞的吞噬活性，且在1-1mg/ml范围内，随着松花粉多糖、接骨木果和松花粉水提物浓度的升高，对于巨噬细胞吞噬活性的增强作用逐渐加强；藻蓝蛋白对于巨噬细胞的吞噬活性不存在明显影响。
根据上述各个物质单独使用对于巨噬细胞的吞噬活性和增殖能力的结果，将藻蓝蛋白和接骨木果以1:0，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，0:1的比例组合作为样品组，研究以上各个组合对于巨噬细胞吞噬活性的影响，单组分(即仅含藻蓝蛋白或者接骨木果)和双组分(即含有藻蓝蛋白和接骨木果)的总质量浓度均是1mg/ml，实验结果如表1所示。
根据表1的结果可知，将藻蓝蛋白与接骨木果配合使用具有增强巨噬细胞的吞噬活性的作用，当藻蓝蛋白与接骨木果以1:2和1:4的质量配比进行组合时，将巨噬细胞的相对吞噬活性分别提高至133.31％和141.48％。
表1双组分样品对巨噬细胞的相对吞噬活性百分值(％，mean±sd)
根据双组分降低lps诱导巨噬细胞产生no水平的结果，将蓝藻多糖和接骨木果以1:1的质量配比进行混合，得到组合2。将组合2与松花粉多糖和松花粉水提物分别以1:0，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，0:1的比例组合作为样品组，研究以上各个组合对于巨噬细胞吞噬活性的影响，单组分(即仅含组合2或者松花粉多糖或者松花粉水提物)和双组分(即含有组合2和松花粉多糖，或者组合2和松花粉水提物)的总质量浓度均是1mg/ml，实验结果如表2所示。
从表2的结果中可以得出，组合2与松花粉多糖或者组合2与松花粉水提物配合使用均具有增强巨噬细胞的吞噬活性的作用，且前者具有更好的增强效果。但是将组合2与松花粉多糖和松花粉水提物一起使用对于巨噬细胞的吞噬活性不存在明显的复配增效作用。
表2多组分对巨噬细胞的相对吞噬活性百分值(％，mean±sd)
5、griess法检测巨噬细胞raw264.7分泌no含量
(1)取对数期细胞raw264.7，细胞密度为2×105个/ml，接种于24孔板，每孔添加1ml的细胞悬液，设置正常对照孔(1ml细胞悬液)，lps诱导的模型孔(1ml细胞悬液)、样品孔(1ml细胞悬液 样品)，空白孔(只含细胞培养基)，培养24h。
(2)小心弃去上清液，用pbs溶液洗一遍，正常对照孔和空白孔加入1ml培养基，模型孔和样品孔加入1ml含1μg/mllps的培养基，培养24h，收集各孔细胞培养基。
(3)将培养基5000r/min离心5min，取上清液，待测。
(4)根据no试剂盒(北京碧云天，s0021s)的说明书操作，测定并计算每个实验孔no浓度。
将浓度为1mg/ml的接骨木果、松花粉水提物、藻蓝蛋白和松花粉多糖作为样品，研究以上各个样品对于巨噬细胞产生no的影响，试验结果如图4(*p＜0.05表示与模型组差异显著，**p＜0.01表示与模型组差异极显著)所示。
从图4中可以看出，在lps诱导巨噬细胞炎症反应前，分别用浓度为1mg/ml的接骨木果、松花粉水提物、藻蓝蛋白和松花粉多糖预孵育细胞24h，lps诱导巨噬细胞产生no的量明显降低，避免了高浓度no对细胞的伤害。
根据上述各个物质单独使用对于降低lps诱导巨噬细胞产生no的结果，将藻蓝蛋白和接骨木果以1:0，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，0:1的比例组合作为样品组，研究以上各个样品对于巨噬细胞产生no的影响，单组分(即仅含藻蓝蛋白或者接骨木果)和双组分(即含有藻蓝蛋白和接骨木果)的总质量浓度均是1mg/ml，实验结果如图5(*p＜0.05表示与模型组差异显著，**p＜0.01表示与模型组差异极显著)所示。
从图5中的结果可知，将藻蓝蛋白与接骨木果配合使用具有降低lps诱导巨噬细胞产生no的作用，当藻蓝蛋白和接骨木果以1:1的质量配比进行组合时，对lps诱导巨噬细胞产生no的降低作用最好。
根据双组分降低lps诱导巨噬细胞产生no水平的结果，将蓝藻多糖和接骨木果以1:1的质量配比进行混合，得到组合2。将组合2与松花粉多糖和松花粉水提物分别以1:0，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，0:1的比例组合作为样品组，研究以上各个样品对于巨噬细胞产生no的影响，单组分(即仅含组合2或者松花粉多糖或者松花粉水提物)和双组分(即含有组合2和松花粉多糖，或者组合2和松花粉水提物)的总质量浓度均是1mg/ml，实验结果如图6(*p＜0.05表示与模型组差异显著，**p＜0.01表示与模型组差异极显著)所示。
根据图6可知，组合2与松花粉多糖或者组合2与松花粉水提物配合使用均具有降低lps诱导巨噬细胞产生no的作用，当组合物2和松花粉多糖以1:1的质量配比进行组合时，对lps诱导巨噬细胞产生no的降低作用最好。
6、cck8法测定自然杀伤细胞(nk92细胞)杀伤活性
(1)复苏、培养nk92细胞(效应细胞)；
(2)复苏、培养hepg2细胞(靶细胞)；
(3)分别制成细胞悬液，并检测细胞密度；
(4)细胞接种到96孔板，分组：效应细胞孔、靶细胞孔、正常对照孔[又称为效靶细胞孔，效靶比2:1，即效应细胞2×104(每孔)、5×105(每孔)、靶细胞1×104(每孔)]、样品孔(正常对照孔 样品)及空白对照孔(无细胞)。每孔体系200μl，轻微震荡混匀后置于细胞培养箱培养24h；
(5)培养结束，弃去培养基，每孔加100μlpbs清洗两遍，每孔再加含110μl试剂(培养基：cck8试剂＝100:10)，混匀，孵育2h。
(6)孵育结束，测od450；
(7)nk细胞杀伤活性的计算公式如下：自然杀伤活性(％)＝[1－(效靶细胞孔od值－效应细胞孔od值)/靶细胞孔od值]×100％；
(8)相对杀伤活性的计算公式如下：相对杀伤活性(％)＝(样品孔自然杀伤活性/正常孔自然杀伤活性)×100％。
取0.5mg/ml的接骨木果和藻蓝蛋白作为样品。nk92细胞主要通过颗粒酶-穿孔素介导的细胞毒性作用对癌细胞具有自然杀伤力，使用cck8法检测肝癌细胞hepg2在不经过和经过nk92细胞处理的存活率，得出nk92细胞对肝癌细胞的自然杀伤活性。同时部分nk92细胞预先在含不同样品的培养基中孵育24h，再测其对hepg2细胞的自然杀伤活性，根据结果推断各个样品对nk92细胞自然杀伤活性的影响，结果如图7(*p＜0.05表示与模型组差异显著，**p＜0.01表示与模型组差异极显著)所示。
从图7中可以看出，与正常组相比，藻蓝蛋白不影响nk92细胞对hegg2细胞的自然杀伤活性；接骨木果对nk92细胞自然杀伤活性存在降低作用。
根据上述各个物质单独使用对于nk92细胞自然杀伤活性的结果，将藻蓝蛋白和接骨木果以1:0，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，0:1的比例组合作为样品组，研究以上各个组合对于nk92细胞自然杀伤活性的影响，单组分(即仅含藻蓝蛋白或者接骨木果)和双组分(即含有藻蓝蛋白和接骨木果)的总质量浓度均是0.5mg/ml，实验结果如表3所示。
从表3中的结果可知，将藻蓝蛋白与接骨木果配合使用不具有提高nk92细胞相对杀伤活性的作用，并且，将藻蓝蛋白与接骨木果配合使用对于nk92细胞自然杀伤活性不存在显著的复配增效作用。
表3经不同组合处理后nk92细胞相对杀伤活性(％)
根据双组分对于nk92细胞自然杀伤活性的结果，将蓝藻多糖和接骨木果以1:1的质量配比进行混合，得到组合2。将组合2与松花粉多糖和松花粉水提物分别以1:0，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，0:1的比例组合作为样品组，研究以上各个组合对于巨噬细胞吞噬活性的影响，单组分(即仅含组合2或者松花粉多糖或者松花粉水提物)和双组分(即含有组合2和松花粉多糖，或者组合2和松花粉水提物)的总质量浓度均是0.5mg/ml，实验结果如表4所示。
从表4可以看出，组合2与松花粉多糖或者组合2与松花粉水提物配合使用具有抑制nk92细胞对hegg2细胞自然杀伤活性的作用，且前者具有更强的抑制效果。并且，将将组合2与松花粉多糖和松花粉水提物一起使用对于nk92细胞自然杀伤活性不存在明显的复配增效作用。
表4经多组分组合处理后nk92细胞相对杀伤活性(％)
综上所述，藻蓝蛋白和接骨木果具有复配增效的作用，能够明显降低lps诱导巨噬细胞分泌的no水平；藻蓝蛋白、接骨木果和松花粉提取物具有复配增效的作用，相较于藻蓝蛋白和接骨木果的组合能够更进一步的降低lps诱导巨噬细胞分泌的no水平。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
1.一种具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物，其特征在于，所述组成物包括：(a)藻蓝蛋白、(b)接骨木果和任选的(c)松花粉提取物。
2.根据权利要求1所述的具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物，其特征在于，所述(a)藻蓝蛋白和所述(b)接骨木果的重量配比为1:(1～2)。
3.根据权利要求2所述的具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物，其特征在于，所述(a)藻蓝蛋白和所述(b)接骨木果的重量配比为1:1。
4.根据权利要求1或2所述的具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物，其特征在于，所述(a)藻蓝蛋白、所述(b)接骨木果和所述(c)松花粉提取物的重量配比为2:(2～4):(1～4)。
5.根据权利要求4所述的具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物，其特征在于，所述(a)藻蓝蛋白、所述(b)接骨木果和所述(c)松花粉提取物的重量配比为2:2:(1～4)。
6.根据权利要求5所述的具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物，其特征在于，(c)松花粉提取物为松花粉水提物，所述(a)藻蓝蛋白、所述(b)接骨木果和所述(c)松花粉提取物的重量配比为2:2:1。
7.根据权利要求6所述的具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物，其特征在于，松花粉水提物通过以下方法制备得到：
松花粉经水提取，得到松花粉水提物；
优选地，提取的固液质量配比为0.08～0.12，优选为0.1；
优选地，提取为超声提取；
优选地，超声提取的温度为25～45℃，时间为10～30min。
8.根据权利要求5所述的具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物，其特征在于，(c)松花粉提取物为松花粉多糖，所述(a)藻蓝蛋白、所述(b)接骨木果和所述(c)松花粉提取物的重量配比为1:1:1。
9.权利要求1-8任一项所述的具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物在制备免疫药物中的应用。
10.一种免疫药物，其特征在于，包括权利要求1-8任一项所述的具有抑制lps诱导巨噬细胞分泌no功能的组成物以及辅料。
技术总结