本发明属于生物工程
技术领域：
，具体涉及一种鸭腺病毒3型菌株灭活疫苗及其应用。
背景技术：
：腺病毒为线状双股dna病毒，无囊膜，直径70～110nm，呈二十面体对称。腺病毒粒子由252个壳粒组成，包含240个不在顶点的壳粒(六邻体)和12个顶点壳粒(五邻体)。每个五邻体基底带有1～2根被称为纤丝的纤突，纤丝的长度与病毒的抗原性相关。感染禽类的腺病毒主要有3个群，i群代表株是鸡胚致死性孤儿病毒，目前从鸡分离到12个血清型，火鸡2个血清型，鹅4个血清型，鸭3个血清型；ⅱ群主要包括火鸡出血性肠炎病毒、大理石脾病毒和鸡大脾病病毒；ⅲ群与减蛋综合征相关，目前只包含一个成员，即减蛋综合征病毒。鸭腺病毒l型病毒是与产蛋下降综合症相关的一种无囊膜的双股dna禽腺病毒，属于腺胸腺病毒属，与i群禽腺病毒存在很小的共同抗原。发病鸭产蛋率大幅度下降。少数发病鸭采食量减少，精神轻度沉郁，产出畸形蛋、软壳蛋，死亡率为1％～5％。鸭腺病毒2型自法国番鸭中爆发的大规模疾病中分离，该病毒能产生腺病毒抗体。使感染病鸭体重下降，有些站不稳。感染鸭从35日龄左右开始持续10d每天都有1～1.5％的死亡率。鸭3型腺病毒从2014年在我国首次分离，该病毒hexon基因推导的氨基酸序列与鸭2型腺病毒gr株同源性仅为60％。目前对于腺病毒3型的防控没有特别有效的手段，市场上还未见商品化的疫苗，因此迫切需要一种可用于防治腺病毒3型病毒的疫苗。技术实现要素：针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种鸭腺病毒3型菌株、鸭腺病毒卵黄抗体及其制备方法和应用，本申请分离得到了腺病毒3型yj株，并制备得到了能够用于治疗鸭腺病毒3型病毒的灭活疫苗，该灭活疫苗对鸭腺病毒的攻击能够提供良好的保护，能够刺激机体产生高水平的抗体。为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种鸭腺病毒3型菌株灭活疫苗，包括灭活后的鸭腺病毒3型菌株以及相应的辅助成分，该鸭腺病毒3型菌株为鸭腺病毒3型yj株，于2020年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmccno.21093。进一步地，鸭腺病毒3型yj株hexon基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。上述灭活疫苗在制备治疗鸭腺病毒3型病毒导致的病症的药物中的应用。本发明的有益效果：本申请分离得到了腺病毒3型yj株，该毒株已于2020年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为cgmccno.21093。并制备得到了能够用于治疗鸭腺病毒3型病毒的灭活疫苗，该灭活疫苗对鸭腺病毒的攻击能够提供良好的保护，能够刺激机体产生高水平的抗体。附图说明图1为病料鸭腺病毒pcr检测结果；图2为鸭腺病毒3型yj株hexon基因组序列核苷酸同源性分析；图3为鸭腺病毒3型yj株hexon基因组序列构建的进化树；图4为接种病毒后lmh细胞病变情况；图5为攻毒后发病照片。具体实施方式下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本
技术领域：
的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本
技术领域：
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。实施例11、试验材料病料来源于广东省疑似感染腺病毒的发病的鸭场；lmh细胞为重庆永健公司保存。2、试验方法(1)病料的采集与处理从疑似感染腺病毒的番鸭中采集肝脏和脾脏，反复冻融后，加入1％的青霉素-链霉素后分装于1.5ml的无菌ep管中，用0.22μm的细菌滤器过滤，于-80℃保存备用。(2)病毒的检测用商品化的dna/rna提取试剂盒提取总rna，反转录获得cdna模板，利用dadv基因的一对特异性引物进行pcr扩增，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。表1鉴定sva基因的引物(3)病毒的hexon测序及序列分析从genbank下载病毒的hexon基因序列，设计2对相互重叠片段的引物(表2)，对分离到的病毒进行hexon基因的pcr扩增，检测扩增片段后回收纯化并连接到pmd18-t载体，送生工生物工程股份有限公司测序。将由生工生物工程股份有限公司成功测序后的2段序列拼接得到鸭腺病毒hexon基因序列(见seqidno.1)。利用dnastar软件对hexon基因的核苷酸其他毒株进行比较，并与相关的腺病毒毒株一起绘制进化树分析图。所选用毒株均为genbank上收录的鸭腺病毒毒株。表2扩增sva全基因的引物表3所用毒株的登录号名称登录号1duckadenovirus2strainch-gd-12-2014kr1351642duckadenovirus3isolatefjgt01mh7773953duckadenovirus3isolateahaq13mh7773964duckadenovirus3isolatezjjh07mh7773975duckadenovirus3isolategdmm10mh7773986duckadenovirus3isolategdzj201901mn923205(4)病毒的分离与培养s1.病毒的分离将pcr鉴定为阳性的样品无菌过滤，按5％的接种量接种长满单层的lmh细胞，置于co2培养箱中吸附1h，补加病毒维持液继续培养。每日观察细胞病变情况。细胞发生病变且有80％以上的细胞病变，将病毒液置于-80℃冰箱，冻融2次，分装于-80℃保存。s2.病毒含量测定将lmh细胞制备为单细胞悬液铺于96孔细胞培养板，每孔100μl(细胞含量4.0×105个/ml)，置37℃含5％co2培养箱中培养24h。将病毒液用dmem培养基作10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-9，4个稀释度，各加入培养24h的96孔细胞培养板，每个稀释度接种96孔细胞培养板6孔，每孔100μl，同时设立正常细胞6孔为阴性对照。上述细胞孔加入含2％新生牛血清的dmem培养液，每孔100μl。置37℃含5％co2培养箱中培养5日，每日观察和记录各孔中病毒感染情况，按reed-muench法，计算病毒的致半数细胞感染滴度(tcid50)。(5)病毒纯化s1.噬斑实验将lmh细胞接种到6孔培养板内，培养至长成95％成单层。将病毒液用dmem培养基作10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-94个稀释度接种培养板内的单层细胞，接种量为每孔200μl，每个稀释度接种3孔；置于co2培养箱中吸附2h。吸出病毒液，取含中性红的营养琼脂糖，融化后降温至43～45℃，每孔加入预混好的营养琼脂糖覆盖在细胞表面，待琼脂糖凝固后置于co2培养箱中培养3-4d。每孔加入1％结晶紫染色液1ml，均匀慢速晃动使染色均匀。染色5h或过夜，甩出固体琼脂层，用去离子水冲洗染色液。选择性的挑取单个空斑，加入dmem培养基进行稀释，接种至lmh细胞进行扩增。将产生病变的细胞上清冻融两次，按相同方法进行下一轮的感染和噬斑分离。反复进行三轮噬斑纯化。s2.克隆株病毒含量的测定将腺病毒3型yj株进行三轮噬斑试验，传代培养获得克隆株。将克隆株以1％的接毒量接种至lmh细胞，待细胞病变为90％左右时收获病毒液，然后采用tcid50测定病毒含量。(6)动物回归试验用2周龄的健康番鸭10只，经腿部肌肉注射病毒液2ml，另取5只健康番鸭作空白对照，每天观察记录试验动物的发病情况及临床表现，连续观察7d。在攻毒后的第7天将全部试验用番鸭解剖。观察心脏、肝脏、脾脏肾脏的临床症状。(7)腺病毒3型yj株灭活疫苗的制备s.1病毒增殖按培养基总量的1％将毒种接种长满单层的lmh细胞，置于co2培养箱中吸附1h，补加病毒维持液继续培养。接毒后细胞培养72-96h，当细胞病变达到80％以上时，收获细胞及细胞培养物。s.2半成品检验s2.1无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。s2.2病毒含量测定将lmh细胞制备为单细胞悬液铺于96孔细胞培养板，每孔100μl(细胞含量4.0×105个/ml)，置37℃含5％co2培养箱中培养24h。将病毒液用dmem培养基作10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-94个稀释度，各加入培养24h的96孔细胞培养板，每个稀释度接种96孔细胞培养板6孔，每孔100μl，同时设立正常细胞6孔为阴性对照。上述细胞孔加入含2％新生牛血清的dmem培养液，每孔100μl。置37℃含5％co2培养箱中培养5日，每日观察和记录各孔中病毒感染情况，按reed-muench法，计算病毒的致半数细胞感染滴度(tcid50)。(8)病毒灭活及检验s1病毒灭活将检验合格的病毒液缓慢加入2％的二乙烯亚胺(bei)溶液，充分混匀，使其最终浓度为0.03％。30℃灭活48小时。将50％硫代硫酸钠溶液加入灭活病毒液中，使其终浓度为2％，中止灭活。灭活后的病毒液置2～8℃保存。s2病毒灭活检验取1.0ml灭活的病毒液，接种到长满单层的lmh细胞，置37℃下培养72h。接种细胞盲传2代，观察细胞病变情况。(9)灭活疫苗的配制s1油相制备：取白油与span-80按照94:6的比例充分混合均匀，然后加入2％的硬脂酸铝，搅拌至淡黄色且澄清透明后，121℃高压蒸汽灭菌备用。s2水相制备：灭活完全的抗原液与tween-80按照97.5:2.5的比例震荡混匀，直至tween-80完全溶解。s3乳化：取油相2份放入组织匀浆机内，缓慢搅拌，同时加入水相1份，循环搅拌至油相与水相充分混合。(9)成品检验s1剂型检验将疫苗滴于盛有洁净冷水表面，观察疫苗滴落后的扩散情况，确定剂型。s2离心稳定性检验取10ml灭活苗置于离心管中，3000r/min离心15min，观察外观有无分层破乳情况。s3无菌检验将疫苗接种于含硫乙醇酸盐培养基(t.g)和酪胨琼脂培养基(g.a)斜面各4支，每支0.2ml，每种培养基取2支置于37℃培养，另2支置于25℃培养；另取0.2ml接种于葡萄糖蛋白胨培养基(g.p)小管，置于25℃，培养7d，观察有无细菌生长。s4安全检验2周龄健康易感番鸭10只，分别经腿部肌肉注射灭活疫苗，2.0ml/只，接种后14日，每日观察各组动物的精神状态，以及注射部位是否出现红肿热痛等局部炎症反应。s5效力检验s5.1血清学方法用2周龄的健康易感番鸭10只，各经腿部肌肉接种疫苗1.0ml，接种后7日，以相同剂量加强免疫1次。另设对照雏鸭5只。首免后28日对所有试验鸭采血，分离血清，经处理后测定腺病毒中和抗体效价。s5.2免疫攻毒法用2周龄的健康易感番鸭10只，各经腿部肌肉接种疫苗1.0ml，接种后7日，以相同剂量加强免疫1次。另设对照雏鸭5只。首免后28日，将所有试验鸭肌肉接种鸭腺病毒病毒液2ml(每毫升病毒含量≥108tctd50)。攻毒后逐日观察试验鸭的临床症状。实施例31、病毒的检测从疑似鸭腺病毒感染的组织病料中提取rna，以反转录获得cdna为模板进行pcr扩增，反应条件为：预变性94℃5min；变性94℃30s，退火55℃30s；延伸72℃30s；30个循环；72℃10min。将pcr产物于1％琼脂糖凝胶上电泳检测结果见图1，由结果可见，扩增出一条约633bp的条带，与预期扩增片段大小相符。证实为鸭腺病毒。2、病毒的hexon基因测序及序列分析用dnastar软件将2段重叠片段的测序结果进行拼接，得到鸭腺病毒hexon基因序列。将hexon基因核苷酸比对的结果进行分析。分离株hexon基因组序列与其他鸭腺病毒3型hexon基因组序列核苷酸同源性为100-99.9％。基因组序列进化分析表明分离株和duckadenovirus3isolategdmm10在同一进化分支(见图2、图3)。将该分离株命名为腺病毒3型yj株。该毒株已于2020年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为cgmccno.21093，分类命名duckadenovirustypeiii，dadviiiyj。实施例41、病毒的分离与培养鸭腺病毒3型yj株病毒接种lmh细胞，在细胞培养72h开始出现细胞病变，主要表现为细胞聚集、融合、形成合胞体，对照细胞无明显的病变特征(参见图4，图4中左侧附图为健康对照细胞，右侧附图为接毒后72h病变细胞)。细胞培养120h细胞病变达到90％，收获细胞培养液，采用tcid50试验测定病毒含量为108.0tcid50/ml。2、病毒的纯化经过三轮噬斑实验对克隆株进行病毒含量测定，病毒含量为108.7tcid50/ml，表明克隆株在细胞中的复制增殖能力变强。3、动物回归试验结果为确定鸭腺病毒3型yj分离株的致病性，使用了收获的第3代病毒液进行动物回归试验(见图5)。结果发现，未攻毒对照组雏鸭在7d观察期均未出现异常。攻毒组雏鸭有8死亡，死亡率为80％，剖检病死雏鸭出现肝脏肿大黄化现象，肾脏呈花斑状。实施例51、腺病毒3型yj株灭活疫苗的制备(1)半成品检验结果制苗用病毒液病毒含量为108.8tcid50/ml，无菌检验合格。(2)灭活检验制苗用病毒液接种细胞盲传三代均无细胞病变，灭活检验合格，2、成品检验(1)剂型检验将疫苗滴于盛有洁净冷水表面，无扩散，确定剂型为油包水。(2)离心稳定性检验取10ml灭活苗置于离心管中，3000r/min离心15min，无破乳，离心稳定性良好。(3)无菌检验将疫苗接种于培养基，无细菌生长，无菌检验合格。(4)安全检验10只试验雏鸭注射2.0ml疫苗后全部健活，无局部和全身不良反应，疫苗安全性良好。3、效力检验(1)血清学方法用血清学方法进行疫苗效力检验，首免后28天采血、分离血清测定中和抗体效价为1:256～1:1024之间。阴性对照组的腺病毒抗体水平呈阴性。本发明中的雏鸭免疫实验表明，制备的腺病毒3型灭活疫苗能够刺激机体产生高水平的抗体。表4效力检验中和抗体效价测定结果(2)免疫攻毒法用免疫攻毒法进行疫苗效力评估。试验鸭首免后28日进行腺病毒攻毒试验，结果表明免疫10只鸭均未发病，对照组5只有4只死亡。表明该灭活疫苗对鸭腺病毒的攻击能够提供良好的保护。表5效力检验攻毒结果组别数量/只免疫途径免疫剂量/ml攻毒途径攻毒剂量/ml死亡率免疫组10腿部肌肉1.0腿部肌肉20/10对照组5腿部肌肉1.0腿部肌肉24/5序列表<110>重庆永健生物技术有限责任公司<120>一种鸭腺病毒3型菌株灭活疫苗及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2814<212>dna<213>鸭腺病毒(duckadenovirus)<400>1atggccgctctgacccctgacttgacgacggctacgccgaggctgtcctattttcacatt60gccggtccgagcacacgggagtatctgtcagaggaccttcagcagtttatgagtgcaaca120tccagctactttgagttgcgaaacaaattcaggcaaacggttgctgccccaacgcgtaat180gttactaccgagaaagctcaacgt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技术特征：1.一种鸭腺病毒3型菌株灭活疫苗，其特征在于，包括灭活后的鸭腺病毒3型菌株，该鸭腺病毒3型菌株为鸭腺病毒3型yj株，于2020年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmccno.21093。
2.根据权利要求1所述的鸭腺病毒3型菌株灭活疫苗，其特征在于，所述鸭腺病毒3型yj株hexon基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。
3.权利要求1或2所述的灭活疫苗在制备治疗鸭腺病毒3型病毒导致的病症的药物中的应用。
技术总结本发明公开了一种鸭腺病毒3型菌株灭活疫苗及其应用。该鸭腺病毒3型菌株为鸭腺病毒3型YJ株，于2020年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.21093；该鸭腺病毒3型YJ株HEXON基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明分离得到了腺病毒3型YJ株，并制备得到了能够用于治疗鸭腺病毒3型病毒的灭活疫苗，该灭活疫苗对鸭腺病毒的攻击能够提供良好的保护，能够刺激机体产生高水平的抗体。
技术研发人员：李来旭;李睿;刘鑫莹;何鸿章;张强;周宇;明月月;李阁;张晏;贾会明
受保护的技术使用者：重庆永健生物技术有限责任公司
技术研发日：2021.04.28
技术公布日：2021.08.03
