屏边三七提取物在制备激活自然杀伤性T细胞药物中的应用的制作方法

屏边三七提取物在制备激活自然杀伤性t细胞药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及屏边三七提取物在制备激活自然杀伤性t细胞药物中的应用。


背景技术：

2.自然杀伤性t细胞（nkt细胞）是一种t淋巴细胞，在固有免疫和获得性免疫间发挥着重要的桥梁作用。nkt细胞被激活后迅速释放出大量细胞因子，包括1型辅助性t细胞因子（t helper 1，th1）和th2型细胞因子。th1型细胞因子，如白细胞介素（interleukin，il）
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2和干扰素
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γ（interferon
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γ，ifn
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γ），促进机体的细胞免疫应答，增强细胞毒作用，进而发挥抗感染抗肿瘤的作用。th2型细胞因子，如il
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4和il
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10，刺激b细胞增殖分化产生抗体，促进机体的体液免疫应答；诱导树突状细胞的成熟，影响自然杀伤细胞、巨噬细胞、传统t细胞以及b淋巴细胞的功能，进而调节机体的固有免疫和适应性免疫应答。因此靶向激活nkt细胞成为免疫治疗的热点，寻找能被nkt细胞识别的抗原引起了人们极大的兴趣。
3.屏边三七是云南民族民间用药，具有抗炎和抗癌活性。发明人在对屏边三七的提取分离过程中，意外地发现屏边三七提取物对nkt细胞有很好的激活作用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供屏边三七提取物在制备激活自然杀伤性t细胞药物中的应用。
5.本发明的目的是这样实现的：屏边三七提取物具有激活自然杀伤性t细胞的作用；屏边三七提取物的制备方法为：(1)将屏边三七洗净，晾干，打成粗粉；(2)粗粉加乙醇回流2次，每次用量为屏边三七粗粉的质量体积（kg/l）5
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15倍，每次1~3 h，回流后过滤，合并滤液，减压浓缩提取液至无醇味得到屏边三七乙醇浸膏；(3)将屏边三七乙醇浸膏加水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，每次溶剂萃取3
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6次；合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩提取液至无乙酸乙酯味得到屏边三七提取物。
6.步骤（2）中所述的乙醇质量浓度为80
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90%；步骤（3）中所述的混悬用水用量为屏边三七乙醇浸膏的1
‑
3倍，每次萃取时，石油醚、乙酸乙酯用量为水相体积（l）的1/6
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1/2。
7.屏边三七提取物在制备激活自然杀伤性t细胞药物中的应用。
8.屏边三七提取物激活自然杀伤性t细胞产生il
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2细胞因子。
9.屏边三七提取物在制备预防或治疗癌症、感染、自身免疫性疾病药物中的应用。
10.癌症为肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、大肠癌、胃癌、肾癌、鼻咽癌、卵巢癌、前列腺癌或皮肤癌。
11.感染为细菌感染、真菌感染、支原体感染、衣原体感染或病毒感染。
12.自身免疫性疾病为系统性红斑狼疮、过敏性哮喘、多发性硬化症、变应性鼻炎、移植物抗宿主病、类风湿性关节炎、1型糖尿病、银屑病、韦格纳肉芽肿病、复发性多软骨炎或原发性胆汁性肝硬化。
13.一种药物组合物，其特征在于以屏边三七提取物作为活性成分或者是药用载体。
14.本发明优点：本发明提供的屏边三七提取物能够有效激活自然杀伤性t细胞。
附图说明
15.图1为屏边三七提取物刺激nkt细胞小鼠杂交瘤2h4细胞分泌il
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2。
16.其中，阴性对照组为含dmso的培养基；阳性对照组为100ng/ml的α
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galcer；低剂量组为屏边三七提取物20μg/ml；中剂量组为屏边三七提取物100μg/ml ；高剂量组为屏边三七提取物500μg/ml。
具体实施方式
17.下面对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变换，均属于本发明的保护范围。
18.屏边三七提取物在制备激活自然杀伤性t细胞药物中的应用。
19.屏边三七提取物具有激活自然杀伤性t细胞的作用；屏边三七提取物的制备方法为：(1)将屏边三七洗净，晾干，打成粗粉；(2)粗粉加乙醇回流2次，每次用量为屏边三七粗粉的质量体积（kg/l）5
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15倍，每次1~3 h，回流后过滤，合并滤液，减压浓缩提取液至无醇味得到屏边三七乙醇浸膏；(3)将屏边三七乙醇浸膏加水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，每次溶剂萃取3
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6次；合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩提取液至无乙酸乙酯味得到屏边三七提取物。
20.步骤（2）中所述的乙醇质量浓度为80
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90%；步骤（3）中所述的混悬用水用量为屏边三七乙醇浸膏的1
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3倍，每次萃取时，石油醚、乙酸乙酯用量为水相体积（l）的1/6
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1/2。
21.屏边三七提取物在制备激活自然杀伤性t细胞药物中的应用。
22.屏边三七提取物激活自然杀伤性t细胞产生il
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2细胞因子。
23.屏边三七提取物在制备预防或治疗癌症、感染、自身免疫性疾病药物中的应用。
24.癌症为肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、大肠癌、胃癌、肾癌、鼻咽癌、卵巢癌、前列腺癌或皮肤癌。
25.感染为细菌感染、真菌感染、支原体感染、衣原体感染或病毒感染。
26.自身免疫性疾病为系统性红斑狼疮、过敏性哮喘、多发性硬化症、变应性鼻炎、移植物抗宿主病、类风湿性关节炎、1型糖尿病、银屑病、韦格纳肉芽肿病、复发性多软骨炎或原发性胆汁性肝硬化。
27.一种药物组合物，其特征在于以屏边三七提取物作为活性成分或者是药用载体。
28.实施例1将屏边三七洗净，晾干，打成粗粉。取100g粗粉，加90%乙醇回流2次，第1次2h、第2
次1.5h，每次90%乙醇用量为1l。回流后过滤，合并滤液，减压蒸馏后得到24.1g浸膏。将浸膏加50ml水溶解，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取4次，每次溶剂用量为15ml；合并乙酸乙酯萃取液，减压蒸馏后得到乙酸乙酯部位浸膏：11.7g，即为屏边三七提取物。
29.实施例2(1)将屏边三七洗净，晾干，打成粗粉；(2)粗粉加乙醇回流2次，每次用量为屏边三七粗粉的质量体积（kg/l）5
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15倍，每次1~3 h，回流后过滤，合并滤液，减压浓缩提取液至无醇味得到屏边三七乙醇浸膏；(3)将屏边三七乙醇浸膏加水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，每次溶剂萃取3
‑
6次；合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩提取液至无乙酸乙酯味得到屏边三七提取物。
30.步骤（2）中所述的乙醇质量浓度为80
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90%；步骤（3）中所述的混悬用水用量为屏边三七乙醇浸膏的1
‑
3倍，每次萃取时，石油醚、乙酸乙酯用量为水相体积（l）的1/6
‑
1/2。
31.实施例3以实施例1制备得到的屏边三七提取物进行试验，具体试验方法和过程如下：将屏边三七提取物溶于dmso中，配制成100mg/ml的储存溶液备用，实验时用培养基梯度稀释成500μg/ml，100μg/ml，20μg/ml的溶液。
32.取对数生长期的a20
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cd1d细胞接种于96孔平板上，接种密度为3x104/孔，接种体积为100μl，然后分别加100μl的含药培养基，使化合物终浓度为250μg/ml，50μg/ml，10μg/ml，以含等量dmso的培养基作为阴性对照，以100ng/ml的α
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galcer作为阳性对照。于37℃培养箱中共孵育24h，然后弃去培养基，加入150μl的2h4细胞，密度为3x104/孔，继续培养24h后收集上清液，用酶联免疫吸附法（enzyme
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linked immunosorbent assay, elisa）检测il
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2细胞因子的分泌。
33.实验结果：图1为屏边三七提取物刺激nkt细胞小鼠杂交瘤2h4细胞分泌il
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2。在中浓度时即显示出较强的激活作用，高浓度时可能因为毒性所以反而分泌的il
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2减少。
34.从图中可以看出，本发明提供的屏边三七提取物对nkt细胞有激活作用。