本发明涉及抗真菌药物领域，具体地说，是杉松提取物协同氟康唑在制备抗真菌药物中的应用。
背景技术：
真菌是广泛存在于自然界的一类真核生物，真菌可感染人体的不同部位。我们把真菌引起的疾病统称为“真菌病”。以临床致病情况为标准可将真菌病分为浅部真菌病和深部真菌病两大类。浅部真菌病在我国极为普遍，常见的有头癣、体癣、股癣、手足癣、花斑癣和甲癣；深部真菌则主要侵犯内脏器官、骨骼及神经系统，也可侵犯皮肤、粘膜，较常见的有孢子丝菌病、着色菌丝病、防线菌病及隐球菌病。而白念珠菌属则对皮肤、粘膜、指(趾)甲和内脏均可侵犯。
目前临床上深部真菌感染的主要治疗药物是多烯类(两性霉素b)和氮唑类(氟康唑等)。其中氮唑类的氟康唑(fluconazole，flc)因其良好的生物利用度和可靠的安全性，成为治疗白念珠菌(candidaalbicans)感染中使用最多的药物。但由于其对白念珠菌的作用主要是抑菌而不是杀菌，因此在长期治疗和重复给药过程中容易引起对flc耐药，这是临床治疗深部真菌感染的一个棘手的问题。恢复耐药真菌对治疗药物的敏感度，提高耐药菌对flc的敏感性，是治疗深部耐药菌感染的一种有效的治疗途径。临床上应对真菌耐药性的措施主要是：增加药物剂量、联合用药、免疫调节等手段，同时需要科研上加快新型抗真菌药的研制和开发。鉴于抗真菌药选择范围小、毒副作用大、耐药性产生以及临床治疗失败等原因，两种或两种以上抗真菌药的联合应用已经成为临床抗真菌治疗的发展方向之一。
杉松(abiesholophyllamaxim.)为松科植物(pinaceae)，别名沙松、白松，产于我国东北牡丹江流域山区、长白山区及辽河东部山区，在海拔500-1200米，气候寒冷湿润，土层肥厚弱灰化棕色森林土地带，常组成针叶林或针叶树与阔叶树混交林。混生树种有：红松、臭冷杉、红皮云杉、长白鱼鳞云杉、黄花落叶松、大青杨、枫桦、春榆、裂叶榆、山杨、糠椴,黄檗.胡桃楸及水曲柳等。苏联、朝鲜也有分布。模式标本采自东北长白山区。《中华本草》中记载：树皮幼时外表面灰褐色或白褐色，不剥裂；老时暗褐色，浅裂，内面灰白色。叶条形，长2-4cm，宽1.5-2.5mm。先端突出或渐尖，坚硬，叶内树脂管中生。树皮气微，味微苦。叶气微，味淡。性味归经：辛，温。功能主治：祛瘀，祛风湿，消肿，接骨。用于跌打损伤，骨折，疮痈，漆疮，风湿痹痛。用法用量：以根皮入药。全年可采，鲜用或晒干研末。3～5钱，水煎冲酒服；外用适量，煎水洗，或用鲜根皮捣烂敷患处。
杉松中含有挥发油、黄酮类、生物碱类、木脂素类等物质。杉松甲醇提取物具有除草作用，木脂素具有神经保护活性。杉松的研究报道少，未见杉松具有协同抗真菌作用的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供杉松提取物在制备协同抗真菌药物中的新应用。
本发明的第一方面，提供杉松提取物协同氟康唑在制备抗真菌药物中的应用，所述的杉松提取物为杉松叶80％乙醇提取物、杉松叶石油醚提取物、杉松叶水提取物、杉松树皮80％乙醇提取物、杉松树皮石油醚提取物、或杉松树皮水提取物。
进一步的，所述的真菌为白念珠菌。
进一步的，所述的杉松提取物的制备方法分别为：
取干燥杉松叶粉碎，用80％乙醇加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用80％乙醇加热回流提取1小时，滤过；合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收溶剂，得杉松叶80％乙醇提取物；
取干燥杉松叶粉碎，用石油醚加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用石油醚加热回流提取1小时，滤过；合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收溶剂，得杉松叶石油醚提取物；
取干燥杉松叶粉碎，用蒸馏水加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用蒸馏水加热回流提取1小时，滤过；合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，得杉松叶水提取物；
取干燥杉松树皮粉碎，用80％乙醇加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用80％乙醇加热回流提取1小时，滤过；合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收溶剂，得杉松树皮80％乙醇提取物；
取干燥杉松树皮粉碎，用石油醚加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用石油醚加热回流提取1小时，滤过；合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收溶剂，得杉松树皮石油醚提取物；
取干燥杉松树皮粉碎，用蒸馏水加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用蒸馏水加热回流提取1小时，滤过；合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，得杉松树皮水提取物。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的杉松提取物的制备方法分别为：
取干燥杉松叶粉碎，称取10.376g，用200ml的80％乙醇加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用200ml的80％乙醇加热回流提取1小时，滤过。合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收乙醇，得杉松叶80％乙醇浸膏3.176g。
取干燥杉松叶粉碎，称取10.089g，用200ml的石油醚加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用200ml的石油醚加热回流提取1小时，滤过。合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收石油醚，得杉松叶石油醚浸膏0.406g。
取干燥杉松叶粉碎，称取10.056g，用200ml的水加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用200ml的水加热回流提取1小时，滤过。合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，得杉松叶水浸膏1.035g。
取干燥杉松树皮粉碎，称取9.737g，用200ml的80％乙醇加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用200ml的80％乙醇加热回流提取1小时，滤过。合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收乙醇，得杉松树皮80％乙醇浸膏1.947g。
取干燥杉松树皮粉碎，称取9.404g，用200ml的石油醚加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用200ml的石油醚加热回流提取1小时，滤过。合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收石油醚，得杉松树皮石油醚浸膏0.90g。
取干燥杉松树皮粉碎，称取10.163g，用200ml的水加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用200ml的水加热回流提取1小时，滤过。合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，得杉松叶水浸膏1.186g。
进一步的，所述的抗真菌药物中杉松叶80％乙醇提取物浓度大于等于0.5ug/ml即可与氟康唑(8.0ug/ml)有效协同；杉松叶石油醚提取物浓度大于等于1.0ug/ml即可与氟康唑(8.0ug/ml)有效协同；杉松叶水提取物浓度大于等于1.0ug/ml即可与氟康唑(8.0ug/ml)有效协同；杉松树皮80％乙醇提取物浓度大于等于4.0ug/ml即可与氟康唑(8.0ug/ml)有效协同；杉松树皮石油醚提取物浓度大于等于1.0ug/ml即可与氟康唑(8.0ug/ml)有效协同；杉松树皮水提取物浓度大于等于1.0ug/ml即可与氟康唑(8.0ug/ml)有效协同。
本发明的第二方面，提供杉松提取物和氟康唑联用在制备抗真菌药物中的应用，所述的杉松提取物为杉松叶80％乙醇提取物、杉松叶石油醚提取物、杉松叶水提取物、杉松树皮80％乙醇提取物、杉松树皮石油醚提取物、或杉松树皮水提取物。
本发明的第三方面，提供一种抗真菌药物，所述的药物是以杉松叶80％乙醇提取物、杉松叶石油醚提取物、杉松叶水提取物、杉松树皮80％乙醇提取物、杉松树皮石油醚提取物、或杉松树皮水提取物，和氟康唑为活性成分的药物组合物；或是包含杉松叶80％乙醇提取物、杉松叶石油醚提取物、杉松叶水提取物、杉松树皮80％乙醇提取物、杉松树皮石油醚提取物、或杉松树皮水提取物，与氟康唑的药物组合物。
进一步的，所述的药物中还包括常用的药物载体或辅料。
本发明对杉松进行了初步的协同氟康唑抗真菌活性研究，采用80％乙醇、石油醚、蒸馏水分别热提杉松叶和树皮，获得了杉松叶80％乙醇提取物、杉松叶石油醚提取物、杉松叶水提取物、杉松树皮80％乙醇提取物、杉松树皮石油醚提取物、杉松树皮水提取物，考察它们协同氟康唑抗耐药白念珠菌的作用，本发明所获得的提取物均有协同氟康唑抗耐药白念珠菌活性，尤其杉松叶80％乙醇提取物效果最好，这一结果为拓展杉松的临床应用，以及治疗氟康唑耐药的白念珠菌提供了新思路，为联合用药治疗真菌感染以及拓展杉松的临床应用提供参考。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例：
一、实验材料与方法
(一)实验材料
1、菌株
白念珠菌103(candidaalbicans103)由海军军医大学长海医院真菌室提供(中国专利文献cn105503788a)。
菌株培养条件：所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基(sda)划板活化，白念珠菌103于30℃培养2周后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置sda斜面，用上述方法培养后于4℃保存备用。
2、受试药物
名称：杉松提取物
杉松叶和树皮各自80％乙醇提取物及杉松叶和树皮各自石油醚提取物
(1)杉松叶80％乙醇提取物(提取物得率为30.609％)
(2)杉松叶石油醚提取物(提取物得率为4.023％)
(3)杉松叶水提取物(提取物得率为10.29％)
(4)杉松树皮80％乙醇提取物(提取物得率为20.0％)
(5)杉松树皮石油醚提取物(提取物得率为9.57％)
(6)杉松树皮水提取物(提取物得率为11.67％)
3、试剂
(1)rpmi1640液体培养液：
rpmi1640(gibcobrl)10g，nahco32.0g，吗啡啉丙磺酸(mops)(sigma)34.5g(0.165m)，加三蒸水900ml溶解，1.0mol/lnaoh调ph至7.0(25℃)，三蒸水定容至1000ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存备用。
(2)沙堡葡萄糖琼脂固体培养基(sda)：
蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整ph至7.0，以三蒸水定容至1000ml，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。
(3)yepd培养液：
酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，三蒸水定容至1000ml，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。
(4)pbs缓冲液：
nacl8.0g，kcl0.4g，na2hpo40.133g，kh2po40.06g，nahco30.35g，加三蒸水定容至1000ml，高压灭菌后4℃保存。
(5)抗真菌药物：
氟康唑注射液，上海信谊金朱药业有限公司。黄芩素(baicalein，be)上海历鼎生物技术有限公司。
(6)溶剂：
二甲基亚砜(dimethylsdphoxide，dmso)中国医药集团上海化学试剂公司。
(7)药物母液配制：
氟康唑为水溶液。
4、仪器设备
multiskanmk3型酶标检测仪(labsystems)
隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)
mjx型智能霉菌培养箱(宁波江南仪器厂)
thz～82a台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)
sw.ct-if型超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)
倒置显微镜(amershampharmacia)
微量加样器(finnpette)
96孔细胞培养板(nunclon)
lightcyclerrealtimepcr仪(rochediagnostics)
eppendorf5417r高速冷冻离心机(eppendorf)
biofugestratos高速冷冻离心机(heraeus)
激光共聚焦显微镜(leicatcssp2)
microconym-30滤器(millipore，bedford，ma)
(二)实验方法
1、杉松四种提取物的提取
取干燥杉松叶粉碎，称取10.376g，用200ml的80％乙醇加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用200ml的80％乙醇加热回流提取1小时，滤过。合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收乙醇，得杉松叶80％乙醇浸膏3.176g。
取干燥杉松叶粉碎，称取10.089g，用200ml的石油醚加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用200ml的石油醚加热回流提取1小时，滤过。合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收石油醚，得杉松叶石油醚浸膏0.406g。
取干燥杉松叶粉碎，称取10.056g，用200ml的水加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用200ml的水加热回流提取1小时，滤过。合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，得杉松叶水浸膏1.035g。
取干燥杉松树皮粉碎，称取9.737g，用200ml的80％乙醇加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用200ml的80％乙醇加热回流提取1小时，滤过。合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收乙醇，得杉松树皮80％乙醇浸膏1.947g。
取干燥杉松树皮粉碎，称取9.404g，用200ml的石油醚加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用200ml的石油醚加热回流提取1小时，滤过。合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收石油醚，得杉松树皮石油醚浸膏0.90g。
取干燥杉松树皮粉碎，称取10.163g，用200ml的水加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用200ml的水加热回流提取1小时，滤过。合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，得杉松叶水浸膏1.186g。
2、真菌悬液的配制。
实验前，用接种圈从4℃保存的sda培养基上挑取白念珠菌103，接种至1mlyepd培养液，于30℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至1mlyepd培养液中，用上述方法再次活化，16h后，用血细胞计数板计数，以rpmi1640培养液调整菌液浓度至1×103～5×103cfu/ml。将丝状菌接种至sda斜面，其中皮下组织真菌和系统性真菌(申克氏孢子丝菌)30℃培养一周；浅表真菌(羊毛状小孢子菌)30℃培养两周。各菌按以上方法活化两次后，加适量rpmi1640培养液于sda斜面，用吸管吹打菌落，使真菌孢子游离于rpmi1640培养液中，然后经四层无菌纱布过滤。培养液经血细胞计数板计数后，加rpmi1640培养液调整孢子浓度至1×103～5×103cfu/ml。
3、药敏反应板的制备
取无菌96孔板，于每排1号孔加rpmi1640液体培养基100μl作空白对照；3～12号孔各加新鲜配制的菌液100μl；2号孔分别加菌液160μl和受试化合物溶液40μl；12号孔不含药物，只加菌液100μl作阳性生长对照。2～ll号孔进行倍比稀释，使各孔的最终药物浓度分别为256.0、128.0、64、32、16、8、4、2、1和0.5μg/ml，对照品黄芩素(be)浓度分别为128.0、64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5和0.25μg/ml，各孔中dmso含量均低于1％，flc溶液的终浓度为8.0μg/ml。每次配制药敏板的同时均制备一质控菌药敏板，各药敏板于30℃恒温箱培养。
4、最低抑菌浓度(mic值)的判定
在30℃恒温箱中，念珠菌培养2周后，用酶标分析仪于620nm测各孔od值。阳性对照孔的od值控制在0.2左右，与阳性对照孔比，以od值下降80％以上的最低浓度孔中的药物浓度为mic80(真菌生长80％被抑制时的药物浓度)。当药物的mic80值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：mic80值高于最高浓度64μg/ml时，计为“>64μg/ml”；mic80值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.125μg/ml”。上述实验均平行操作2至3次，当mic80值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为mic80值；当mic80值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。
参照1997年美国国家临床试验标准化委员会(nccls)提出的标准j(m27-a方案)：amb的mic的确定，与生长对照孔比较，生长100％完全抑制，培养基清亮所对应的最低药物浓度为amb的mic；与生长对照孔比较≥80％生长抑制所对应的最低药物浓度为氟康唑mic80。
5、棋盘式微量稀释法
棋盘式微量稀释法即合用的两种药物于96孔板上以二维棋盘的纵(a至h)横(2至11)两方向分别进行二倍的倍比稀释。受试药物(杉松叶80％乙醇提取物、杉松叶石油醚提取物、杉松叶水提取物、杉松树皮80％乙醇提取物、杉松树皮石油醚提取物、杉松树皮水提取物)以及阳性药(黄芩素)分别与抗真菌药物氟康唑合用后，使得阳性药(黄芩素)的终浓度为128.0、64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5和0.25μg/ml，受试药物(杉松叶80％乙醇提取物、杉松叶石油醚提取物、杉松叶水提取物、杉松树皮80％乙醇提取物、杉松树皮石油醚提取物、杉松树皮水提取物)以及的终浓度分别为256.0、128.0、64、32、16、8、4、2、1和0.5μg/ml，氟康唑的终浓度为8μg/ml，实验所用试剂、药物、实验操作步骤同上。
96孔板于30℃恒温培养箱培养24h后取出，读取mic80值。棋盘式微量稀释法测试结果见表1。
表1杉松4种提取物与氟康唑联用体外抗白念珠菌活性的mic80
由表1可见，杉松叶80％乙醇提取物、杉松叶石油醚提取物、杉松叶水提取物、杉松树皮80％乙醇提取物、杉松树皮石油醚提取物、杉松树皮水提取物都具有协同氟康唑抗真菌活性，而杉松叶80％乙醇提取物效果最好。
二、讨论
真菌感染严重威胁人类健康，真菌耐药性在临床非常普遍。目前，联合用药已成为抗真菌治疗的热点。本发明筛选的杉松叶80％乙醇提取物、杉松叶石油醚提取物、杉松叶水提取物、杉松树皮80％乙醇提取物、杉松树皮石油醚提取物、杉松树皮水提取物都具有协同抗真菌作用，其中杉松叶80％乙醇提取物效果最好。本发明为拓展杉松的临床应用，以及治疗氟康唑耐药的白念珠菌提供了新思路。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
1.杉松提取物协同氟康唑在制备抗真菌药物中的应用，所述的杉松提取物为杉松叶80％乙醇提取物、杉松叶石油醚提取物、杉松叶水提取物、杉松树皮80％乙醇提取物、杉松树皮石油醚提取物、或杉松树皮水提取物。
2.根据权利要求1所述的杉松提取物协同氟康唑在制备抗真菌药物中的应用，其特征在于，所述的真菌为白念珠菌。
3.根据权利要求1所述的杉松提取物协同氟康唑在制备抗真菌药物中的应用，其特征在于，所述的杉松提取物的制备方法为：
取干燥杉松叶粉碎，用80％乙醇加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用80％乙醇加热回流提取1小时，滤过；合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收溶剂，得杉松叶80％乙醇提取物；
取干燥杉松叶粉碎，用石油醚加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用石油醚加热回流提取1小时，滤过；合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收溶剂，得杉松叶石油醚提取物；
取干燥杉松叶粉碎，用蒸馏水加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用蒸馏水加热回流提取1小时，滤过；合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，得杉松叶水提取物；
取干燥杉松树皮粉碎，用80％乙醇加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用80％乙醇加热回流提取1小时，滤过；合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收溶剂，得杉松树皮80％乙醇提取物；
取干燥杉松树皮粉碎，用石油醚加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用石油醚加热回流提取1小时，滤过；合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收溶剂，得杉松树皮石油醚提取物；
取干燥杉松树皮粉碎，用蒸馏水加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用蒸馏水加热回流提取1小时，滤过；合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，得杉松树皮水提取物。
4.根据权利要求1所述的杉松提取物协同氟康唑在制备抗真菌药物中的应用，其特征在于，所述的抗真菌药物中杉松叶80％乙醇提取物浓度≥0.5ug/ml；所述的抗真菌药物中杉松叶石油醚提取物浓度≥1.0ug/ml；所述的抗真菌药物中杉松叶水提取物浓度≥1.0ug/ml；所述的抗真菌药物中杉松树皮80％乙醇提取物浓度≥4.0ug/ml；所述的抗真菌药物中杉松树皮石油醚提取物浓度≥1.0ug/ml；所述的抗真菌药物中杉松树皮水提取物浓度≥1.0ug/ml；。
5.杉松提取物和氟康唑联用在制备抗真菌药物中的应用，所述的杉松提取物为杉松叶80％乙醇提取物、杉松叶石油醚提取物、杉松叶水提取物、杉松树皮80％乙醇提取物、杉松树皮石油醚提取物、或杉松树皮水提取物。
6.一种抗真菌药物，其特征在于，所述的药物是以杉松叶80％乙醇提取物、杉松叶石油醚提取物、杉松叶水提取物、杉松树皮80％乙醇提取物、杉松树皮石油醚提取物、或杉松树皮水提取物，和氟康唑为活性成分的药物组合物；或是包含杉松叶80％乙醇提取物、杉松叶石油醚提取物、杉松叶水提取物、杉松树皮80％乙醇提取物、杉松树皮石油醚提取物、或杉松树皮水提取物与氟康唑的药物组合物。
7.根据权利要求6所述的抗真菌药物，其特征在于，所述的药物中还包括常用的药物载体或辅料。
技术总结